MLKL在小鼠皮肤伤口愈合过程中的作用

The role of MLKL in mediating skin wound healing in Mice

摘要

为探究MLKL对肌成纤维细胞和巨噬细胞间相互作用过程中的调控作用及对小鼠皮肤伤口愈合的影响，分别构建野生型C57BL/6J小鼠和MLKL基因敲除（MLKL^-/-）小鼠背部创伤模型，分析皮肤伤口愈合情况。体外培养野生型C57BL/6J和MLKL^-/-小鼠肌成纤维细胞及骨髓源巨噬细胞，使用小鼠耳源肌成纤维细胞培养上清液（Myofibroblast conditioned medium，MFbCM）处理野生型C57BL/6J小鼠M1和M2型巨噬细胞，检测M1型巨噬细胞IL-6、TNF-α及NO的分泌量。检测M2型巨噬细胞精氨酸酶（Arginase）及几丁质酶3样分子（Ym1）的表达量。结果显示，1）相比于野生型C57BL/6J小鼠，MLKL^-/-小鼠伤口收缩更为缓慢。在损伤后第5、7和10天，野生型C57BL/6J小鼠创面收缩率显著高于MLKL^-/-小鼠（P<0.001）。2）MLKL缺失显著降低伤口表面Ym1和Arginase的表达，在损伤后第5、7和10天差异显著（P<0.001）。此外，MLKL的缺失影响了MFbCM上调M2型巨噬细胞Ym1和Arginase表达的能力。表明MLKL可能参与调控MFbCM诱导的M2型巨噬细胞分泌活动。3）MFbCM可促进M1型巨噬细胞IL-6、TNF-α和NO的表达，且依赖于MLKL的存在，表明MLKL可能参与调控MFbCM诱导的M1型巨噬细胞分泌活动。综上，本研究确定了MLKL参与巨噬细胞和肌成纤维细胞间相互作用，这种相互作用在伤口愈合的每个阶段都是必不可少的。因此，该研究将有助于更好地理解MLKL在创伤愈合中的作用，为创面愈合提供新的治疗策略。

Abstract

To explore the regulatory effect of MLKL on the interaction between myofibroblasts and macrophages and its effect on skin wound healing in mice， this study constructed back trauma models of wild-type C57BL/6J mice and MLKL knockout （MLKL^-/-） mice to analyze skin wound healing. Myofibroblasts and bone marrow-derived macrophages of Wild-type C57BL/6J mice and MLKL^-/-mice were cultured in vitro. M1 and M2 macrophages of wild-type C57BL/6J mice were treated with mouse ear skin myofibroblast conditioned medium （MFbCM）， and the secretion of IL-6，TNF-α and NO in M1 macrophages were detected. The expression of Arginase and chitinase 3-like molecule （Ym1） in M2 macrophages was detected. The results showed that： 1） Compared with wild-type C57BL/6J mice， MLKL^-/-mice had slower wound contraction. On the 5th，7th and 10th day after injury， the wound contraction rate of wild-type C57BL/ 6J mice was significantly higher than that of MLKL^-/-mice（P<0.001）. 2） MLKL deficiency significantly reduced the expression of Ym1 and Arginase on the wound surface， which were more significant on the 5th， 7th and 10th day after injury（P<0.001）. In addition， the deletion of MLKL affected the ability of MFbCM to up-regulate the expression of Ym1 and Arginase in M2 macrophages，suggesting that MLKL may be involved in the regulation of MFbCM-induced M2 macrophage secretion. 3） MFbCM can promote the expression of IL-6， TNF-α and NO in M1 macrophages， which was dependent on the presence of MLKL. It was suggested that MLKL may be involved in the regulation of MFbCM-induced M1 macrophage secretion.In summary， this study identified that MLKL is involved in the interaction between macrophages and myofibroblasts， which is essential at every stage of wound healing. Therefore， this study will help to better understand the role of MLKL in wound healing and provide new therapeutic strategies for wound healing.

Graphical abstract

关键词

MLKL / 创伤愈合 / 巨噬细胞 / 肌成纤维细胞

Key words

MLKL / wound repair / macrophage / myofibroblast

创伤愈合过程涉及到多种细胞及细胞因子共同参与协调，促进上皮重塑和肉芽组织增生^［1-2］。将伤口中的炎症精确地调节到适合促进伤口愈合的水平，但防止阻碍伤口愈合的水平是非常必要的。不同的细胞死亡方式在调节组织炎症和伤口修复中发挥着关键作用。混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是细胞程序性坏死的一种形式——坏死性凋亡的终末执行者。坏死性凋亡在创面中大量存在，并被认为是通过引起炎症反应影响创面愈合的重要因素^［3］。遗传学研究证明，坏死性凋亡在体内能够促进炎症反应发生^［4］。MLKL缺失可以抑制小鼠的皮肤炎症^［5］。此外，有研究表明MLKL可促进损伤后的组织再生^［6］。MLKL的上游调节因子RIPK3也被发现有助于伤口愈合的进展^［7］。

巨噬细胞是组织修复中的主要效应细胞，具有多功能性和可塑性^［8］。肌成纤维细胞对组织修复及疤痕的形成至关重要。巨噬细胞和肌成纤维细胞之间相互作用受到影响，是打破生理性修复和病理性纤维化之间平衡的关键因素^［9］。研究表明，在伤口愈合过程中肌成纤维细胞和巨噬细胞的相互作用能够促进愈合进程^［10］。此外，MLKL缺乏可以防止包括巨噬细胞和成纤维细胞在内的细胞发生程序性坏死^［11］。由此推测MLKL可能通过调节炎症、参与细胞相互作用或其他过程参与组织修复。然而，目前尚无MLKL参与皮肤创伤愈合过程的直接证据。

本研究通过使用MLKL^-/-小鼠作为模型来研究MLKL在皮肤伤口愈合中的作用。探讨MLKL在巨噬细胞和肌成纤维细胞相互作用中的影响，为进一步研究MLKL在组织损伤修复过程中发挥的具体作用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与药品

胎牛血清（FBS）购自ExcellBiology公司；小鼠IL-6 Elisa试剂盒购自Biolegend公司；总NO检测试剂盒购自Beyo-time公司；LPS购自invivogen公司；IL-4、IL-13和M-CSF均购自Peprotech公司；兔抗Ym1多克隆抗体购自Stemcell Technologies公司；鼠抗Arginase单克隆抗体购自SANTA公司；辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自Cell Signaling Technologgy公司；双敏化学发光试剂购自Affinity Biosciences公司；Alexa Fluor 647偶联的山羊抗兔IgG二抗购自Abcam公司；Alexa Fluor 488偶联的驴抗大鼠IgG二抗购自Abcam公司。

1.2　实验动物

野生型C57BL/6J小鼠购自南京大学模型动物研究所，MLKL基因敲除小鼠（MLKL^-/-）由内蒙古大学于水星教授馈赠。本试验使用8周龄，体重（25±2） g健康小鼠，将小鼠安置在可以自由饮食饮水且温度、湿度和昼夜节律正常的环境中饲养。

1.3　试验设计

随机选取野生型C57BL/6J小鼠和MLKL^-/-小鼠，各分为6组，每组10只，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，剃除背毛后用75%酒精对皮肤进行消毒。使用直径约6 mm的圆形打孔器在小鼠背部做圆形创口，使其皮肤伤口自然愈合^［12］。在皮肤创伤后第0、3、5、7、10、12和14天采集伤口照片，采用图像分析工具 Image J处理图像，获得小鼠皮肤伤口表面积。根据伤口面积，计算伤口愈合率：（Day0-Day）/Day0×100%。

1.4　小鼠耳皮肤来源的肌成纤维细胞培养

使用已建立方法分离野生型C57BL/6J小鼠和MLKL^-/-小鼠耳皮肤成纤维细胞^［13］。将鼠耳剪碎，在0.25%胰蛋白酶-EDTA中消化1 h。将鼠耳组织碎片置于含10% FBS和2%双抗的DMEM/F12培养基的细胞培养瓶中培养2~5 d。培养2周后，将成纤维细胞以1×10⁵个/孔的密度接种至6孔细胞培养板中，使用含有TGF-β（100 ng/L）的DMEM/F12培养基（10% FBS和2%双抗）继续培养5 d，以诱导其分化为肌成纤维细胞。收集肌成纤维细胞培养上清液（Myofiblast conditioned medium，MFbCM），用于后续试验。

1.5　小鼠骨髓源巨噬细胞培养、诱导分化及鉴定

根据参考Kitur等^［14］分离野生型C57BL/6J小鼠骨髓源巨噬细胞。分离获得的细胞放置于培养箱中培养。用PBS缓冲液从小鼠股骨和胫骨中冲洗出骨髓，使用含有巨噬细胞集落刺激因子M-CSF（20 μg/L）和20% FBS的RPMI1640培养基培养5 d。随后使用LPS（1 ng/L）刺激巨噬细胞24 h，诱导其分化为M1型巨噬细胞。使用IL-4（20 μg/L）和IL-13（20 μg/L）刺激巨噬细胞48 h，诱导其分化为M2型巨噬细胞。使用Alexa Fluor 647偶联抗小鼠CD11b流式抗体和Alexa Fluor 488偶联抗小鼠CD86流式抗体对M1型小鼠骨髓源巨噬细胞进行流式细胞术鉴定。使用Alexa Fluor 647偶联抗小鼠CD11b流式抗体和Alexa Fluor 488偶联抗小鼠CD163流式抗体对M2型巨噬细胞进行流式细胞术鉴定，以判断阳性细胞的比率。

1.6　免疫荧光染色技术检测小鼠皮肤创面组织中Ym1和Arginase的表达

通过免疫荧光染色比较C57BL/6J小鼠和MLKL^-/-小鼠在皮肤创面损伤后14 d内的愈合情况。检测皮肤创面组织中精氨酸酶（Arginase）及几丁质酶3样分子（Ym1）的表达情况^［15-16］。具体方法如下：制作小鼠皮肤创面组织冰冻切片（6 µm），冰丙酮固定10 min，室温下封闭液孵育1 h，避光过夜孵育兔抗Ym1多克隆抗体（1∶50）和鼠抗Arginase单隆抗体（1∶100）。室温下避光孵育二抗1 h，使用DAPI进行细胞核染色。使用激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM ）观察，获得图片及荧光强度值。

1.7　ELISA检测

在C57BL/6J野生型小鼠M1型巨噬细胞中加入C57BL/6J小鼠耳皮肤来源肌成纤维细胞培养上清液（C57BL/6J MFbCM）或MLKL^-/-小鼠耳皮肤来源肌成纤维细胞培养上清液（MLKL^-/-MFbCM），处理巨噬细胞24 h，同时设置不处理实验组。收集细胞培养上清液。按照ELISA试剂盒说明书方法检测细胞培养上清液中IL-6和TNF-a的分泌水平。

1.8　NO 含量检测

同1.7处理M1型巨噬细胞后，收集细胞培养上清液。通过检测M1巨噬细胞上清液中NO代谢物亚硝酸盐的含量以评估NO的含量。具体方法如下：在酶标板中分别加入样品及标准品，加入5 μL NADPH，10 μL FAD，5 μL Nitrate Reductase，混匀后在37 ℃条件下孵育30 min。加入10 μL LDH Buffer，10 μL LDH，混匀后在37 ℃条件下孵育30 min。加入 50 μL Griess Reagent I，50 μL Griess ReagentⅡ，混匀。使用酶标仪检测波长在540 nm 处的吸光值。

1.9　Western Blot分析

在C57BL/6J野生型小鼠M2型巨噬细胞中加入C57BL/6J MFbCM或MLKL^-/- MFbCM，处理巨噬细胞24 h，同时设置不处理试验组。提取细胞蛋白进行电泳。方法如下：配置SDS-PAGE凝胶，加入蛋白样品（10 μg）；PVDF膜转印（恒压25 V，30 min）；3% BSA 的TBST中室温封闭4 h；兔抗Ym1多克隆抗体（1∶1 000）和鼠抗GAPDH单克隆抗体（1∶5 000）分别过夜孵育PVDF 膜；使用辣根过氧化物酶HRP偶联的山羊抗兔 IgG（1∶5 000）或 HRP 偶联的兔抗小鼠IgG（1∶5 000）在室温条件下避光孵育1 h；使用双敏化学发光试剂和化学发光成像系统进行图像的采集，使用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.10　统计分析

使用GraphPad Prism 8软件对所有数据统计并进行差异性分析3次重复试验数，据\overline{X}±SD，One-Way ANOVA，以P<0.05为差异显著（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001）。

2　结果与分析

2.1　 MLKL基因对鼠背部伤口愈合的影响

在伤口愈合的第0、3、5、7、10、12和14天分别比较野生型C57BL/6J小鼠和MLKL^-/-小鼠背部伤口愈合情况。通过图1可知，相比于野生型C57BL/6J小鼠，MLKL^-/-小鼠伤口收缩迟缓。通过图2可知在皮肤损伤后第5、7和10天，野生型C57BL/6J小鼠创面收缩率极显著高于MLKL^-/-小鼠（P<0.001）。结果表明，MLKL功能的缺失影响皮肤伤口愈合过程。

2.2　小鼠巨噬细胞细胞诱导分化与鉴定

在LPS处理野生型C57BL/6J小鼠巨噬细胞后，M1型巨噬细胞表面标记物CD86和CD11b双阳性细胞的比例为99.8%（图3（a））。在20 μg/L IL-4和20 μg/L IL-13处理野生型C57BL/6J小鼠巨噬细胞后，M2型巨噬细胞表面标记物CD163和CD11b双阳性细胞比例为95.9%（图3（b））。结果表明，本试验成功培养巨噬细胞，通过LPS的处理成功将巨噬细胞诱导分化为M1型巨噬细胞，通过IL-4和IL-13的处理成功将巨噬细胞诱导分化为M2型巨噬细胞，且具有较好的诱导效果和较高的分化比率。

2.3　 MLKL对创面组织Ym1和Arginase表达的影响

通过免疫荧光染色技术检测小鼠皮肤损伤后创面组织中的Ym1和Arginase表达情况（图4）。结果表明，皮肤损伤后第5天和第7天（图5），在基因敲除MLKL小鼠的伤口表面观察到Arginase（图5（a）和Ym1（图5（b））表达相比于野生型C57BL/6J小鼠显著降低（P<0.001）。

2.4　 MLKL对MFbCM诱导的M2型巨噬细胞Ym1和Arginase表达的影响

在M2型巨噬细胞中加入C57BL/6J MFbCM或MLKL^-/-MFbCM，24 h后检测M2型巨噬细胞Ym1和Arginase蛋白表达量（图6（a））。结果表明，MLKL^-/-MFbCM处理的巨噬细胞中Arginase（图6（b））和Ym1（图6（c））表达水平与C57BL/6J MFbCM相比处于较低水平（P<0.01）。

2.5　 MLKL对MFbCM诱导的M1型巨噬细胞

IL-6、TNF-α及NO分泌的影响

根据图7和8得知，C57BL/6J MFbCM和MLKL^-/-MFbCM均可显著上调M1型巨噬细胞中 IL-6（图7（a））、TNF-α（图7（b））及NO（图8）分泌量（P<0.001），且C57BL/6J MFbCM上调现象更为显著（P<0.001）。结果表明，MLKL缺失显著影响IL-6、TNF-α及NO的分泌量。

3　讨论

细胞死亡和炎症反应是宿主对抗病原体入侵的免疫反应的关键组成部分。局部炎症反应可以促进组织修复。然而，过度的炎症浸润会干扰正常的愈合过程，如胶原沉积、血管生成和肉芽组织形成^［17-18］。程序性细胞死亡在维持细胞稳态，即细胞增殖和细胞死亡的平衡中发挥重要作用^［19］。人们普遍认为，MLKL依赖性坏死可导致有害病理。与这一观点相反，本研究已经证明MLKL对正常皮肤伤口愈合非常重要。程序性坏死是由RIPK3激活介导的非caspase依赖性的细胞死亡机制^［20］。研究表明，在损伤后14 d中，RIPK3缺乏显著延迟了伤口闭合，与野生型小鼠创面相比，RIPK3缺陷降低了创面的愈合质量，表现为再上皮化受损、血管生成延迟、肉芽组织不规则和胶原沉积^［5］。MLKL是RIPK3的功能性底物，是坏死信号转导的衔接蛋白^［21］。RIPK3和MLKL在创面早期均有过表达。损伤后创面愈合率表明，MLKL缺失减缓了小鼠皮肤创面愈合。这一现象与Martens等^［6］的研究结果一致，即MLKL可以促进损伤后的组织再生。因此，探究MLKL介导的皮肤伤口愈合调控机制对了解皮肤发育和创面修复十分必要。Shook等^［22］的研究表明，在皮肤修复过程中，巨噬细胞促进肌成纤维细胞的增殖和异质性。巨噬细胞具有多种不同的表型，在创面愈合过程中发挥重要作用。促炎的M1型巨噬细胞可诱导持续炎症和组织降解，抑制细胞增殖和伤口愈合，而抗炎的M2型巨噬细胞可有效促进成纤维细胞迁移、血管生成和组织修复^［23］。Wu等^［24］研究表明，在LPS刺激下，MLKL基因敲除小鼠的巨噬细胞IL-6表达水平低于野生型C57小鼠巨噬细胞。与该研究结果一致的是，当用MLKL^-/-MFbCM替代C57BL/6J MFbCM处理M1巨噬细胞时，并没有获得增强的IL-6、TNF-a和NO的产生。因此，MLKL参与创面愈合不仅依赖于炎症反应，还依赖于M1型巨噬细胞与肌成纤维细胞的相互作用，共同维持创面早期微环境。此外，MLKL能够破坏细胞膜，释放细胞内容物，MLKL缺失可能导致更少的炎症细胞因子释放到伤口环境。MLKL缺陷影响皮肤创面愈合，可能与创面验证反应有关，尤其是在创面愈合早期。

已有研究表明，巨噬细胞消融减少了创面肌成纤维细胞的数量，损害了肌成纤维细胞的功能，并损害了创面愈合^［25］。Buechler等^［26］对成纤维细胞和巨噬细胞的特性进行了深入研究，这2种细胞通过直接相互作用在维持组织稳态方面发挥多种功能。然而，在病理性刺激下，M2型巨噬细胞与成纤维细胞之间的相互作用不能及时终止，从而导致病理性纤维化。Ym1和Arginase主要出现在损伤部位的巨噬细胞，可作为M2型巨噬细胞的生物标志物^［27］。缺乏Arginase已被证明会损害皮肤伤口愈合，而过度产生Arginase则会促进纤维化^［28］。有报道称Ym1阳性巨噬细胞参与调节肌成纤维细胞分化，血管生成和组织形成^［29］。在M2型巨噬细胞中，经C57BL/6J MFbCM处理后，Arginase和Ym1的表达上调，而经MLKL^-/-MFbCM处理后，这种调节作用反而被抑制，表明肌成纤维细胞表达的MLKL可以参与M2型巨噬细胞的极化。本实验室先前研究表明，NLRP3缺失影响肌成纤维细胞诱导巨噬细胞功能，MLKL作为激活NLRP3炎性小体的信号，可能通过影响NLRP3从而影响2种细胞相互作用^［10］。本研究推测，一方面MLKL通过调节坏死诱导的炎症反应参与创面愈合，另一方面MLKL参与创面愈合不仅依赖于炎症期的坏死，还有助于组织再生。

因此，本研究通过初步探究MLKL在细胞相互作用过程中的调控机制，为进一步研究MLKL在组织损伤修复过程中发挥的具体作用提供理论基础。深入了解组织损伤愈合过程中涉及的相关分子，有助于发现新的分子靶点，为组织损伤提供新的治疗策略。然而，MLKL通过何种途径对2种细胞相互作用和皮肤伤口愈合过程进行调控目前尚未明确，需要进一步探讨。

4　结论

MLKL缺失显著减缓小鼠皮肤伤口愈合进程。肌成纤维细胞能够增强M1型巨噬细胞分泌活动，同时促进M2型巨噬细胞极化。此外，MLKL在肌成纤维细胞对M1/M2巨噬细胞功能的调控方面发挥关键作用，进而影响创面愈合进程。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32202879)

内蒙古农业大学优秀博士人才引进科研启动项目(NDYB2021-19)

内蒙古自治区高等学校科学研究重点项目(NJZZ23035)