激素不同配比及光质差异对苹果砧木木质化茎段扦插生根的影响

Effects of different hormone ratios and varied light qualities on rooting of apple rootstock woody stem cuttings

摘要

为探究不同激素配比和红蓝光处理对木质化茎段扦插生根的影响及生根机理，以苹果砧木木质化茎段为材料，对插穗进行激素不同配比及红蓝光处理，测定可溶性糖、可溶性淀粉和可溶性蛋白含量等生理指标，并于扦插后第4天进行转录组测序，对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，采用qRT-PCR对基因表达水平进行定量分析验证。结果表明：1）在所有处理中，3 000 mg/L萘乙酸（NAA）显著提高了苹果木质化茎段扦插生根率（P<0.05）。相较于红光处理，红蓝光和蓝光处理显著提高了苹果砧木木质化茎段扦插的生根率（P<0.05）。蓝光处理下插穗的根尖数和根总长明显高于其他处理。2）插穗在3 000 mg/L NAA处理后第8天可溶性糖含量显著增加（P<0.05）；可溶性淀粉含量在第4天下降，但在第16天显著高于对照（CK，P<0.05）；可溶性蛋白含量在第4天低于CK，在第16天升高且显著高于CK（P<0.05）。3）转录组测序获得了与生根相关的9个KEGG通路和1 543个差异表达基因，进一步筛选到与生根过程密切相关的2个基因家族SAURs和BAMs的5个基因。其中，MdSAUR51、MdSAUR50及MdSAUR12与生长素信号应答相关；MdBAM2与MdBAM1通过抑制淀粉水解，可能调控插穗中淀粉积累，进而影响不定根形成。研究结果为提高工厂化育苗效率以及后续生根机理研究提供了科学依据。

Abstract

To investigate the effects of different hormone ratios and treatment with red and blue light on the rooting of woody stem cuttings and the rooting mechanism， apple rootstock woody stems were used as the materials， and the cuttings were treated with different ratios of hormones and treatment with red and blue light to determine the physiological indexes such as the content of soluble sugar， soluble starch and soluble protein. Transcriptome sequencing was carried out on the 4th day after the cuttings were taken. Go enrichment analysis and KEGG pathway analysis were performed on differentially expressed genes. qRT-PCR was used to quantitatively analyze and verify gene expression levels. The results showed that： 1） Among all treatments， 3 000 mg/L naphthalene acetic acid （NAA） significantly increased the rooting rate of apple woody stem cuttings （P<0.05）. Compared with the red light treatment， the red and blue light treatment and blue light treatment significantly increased the rooting rate of apple rootstock woody stem cuttings（P<0.05）. The number of root tips and total root length of cuttings were significantly higher in the blue light treatment than in the other treatments. 2） The soluble sugar content of cuttings increased significantly on the 8th day after NAA treatment（P<0.05）. The soluble starch content declined on the 4th day， but was significantly higher than CK on the 16th day（P<0.05）. The soluble protein content was lower than CK on the 4th day， and increased significantly on the 16th day（P<0.05）. 3） Transcriptome sequencing obtained 9 KEGG pathways and 1 543 differentially expressed genes related to rooting， and further screened 5 genes from 2 gene families， SAURs and BAMs closely related to the rooting process. Among them， MdSAUR51， MdSAUR50 and MdSAUR12 were associated with growth hormone signalling response； MdBAM2 and MdBAM1 may regulate starch accumulation in cuttings by inhibiting starch hydrolysis， thereby affecting adventitious root formation. This study provides a scientific basis for improving the efficiency of factory nursery and subsequent rooting mechanism research.

Graphical abstract

关键词

生长素 / 苗木扩繁 / 硬枝扦插 / 生根生理机制 / 生根相关基因

Key words

auxin / seedling propagation / hardwood cutting / rooting physiological mechanism / rooting-related genes

扦插是植物无性扩繁的重要方式，不定根（ARs）的形成在扦插扩繁中发挥着重要作用^［1］。因此，提高ARs的形成效率对木本园艺作物无性扩繁，尤其对于难生根植物苹果^［2］（Malus domestica）的砧木工厂化育苗具有重要意义。

环境湿度、激素处理和光质调节是影响扦插成功的重要因素。已有研究表明插穗在空气湿度90%以上时能够保持较好的生长状态^［3］。在扦插过程中，通常使用吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）等人工合成的激素类似物处理插穗基部^［4］；研究发现500 mg/L的IBA可以显著提高苹果嫩枝扦插的生根率^［5］。此外，木质化茎段扦插的插穗叶片通过光合作用积累碳源，为生根提供能量物质；并且光质可以调节光合作用^［6］，进一步影响生根效果。已有研究发现蓝光可以增加气孔导度，有助于增加光合效率^［7］；蓝光条件下罗勒的生根速度比自然光快3倍^［8］；锦紫苏在红光下ARs的数目显著升高^［9］。因此，激素和光质对扦插生根均具有重要的调控作用。

植物组织扦插ARs形成过程中，插穗储存养分对生根的促进作用^［10］及其分子机理已有相关研究。木质化茎段扦插插穗较粗，可为ARs形成储藏更多养分。在营养物质中，可溶性糖是ARs形成过程中的主要碳源^［11］，淀粉则是通过分解转化成可溶性糖发挥作用^［12］。与此同时，可溶性蛋白也发挥着不可或缺的作用。许晓岗^［13］研究发现，垂丝海棠和楸子当年生枝扦插过程中，4月初扦插比3月初扦插的插穗可溶性蛋白含量提前10 d达到峰值，且插穗切口愈合更早。另一方面，ARs形成的分子机制也日益受到研究者的关注^［14］。例如在苹果中，SH40嫩枝扦插ARs的形成受ARRO-1、ARF7和ARF19基因调控^［15］；拟南芥SAUR41的特异性表达对细胞扩增和根分生组织形态有不同的调控作用^［16］。

关于苹果砧木的木质化茎段扦插的最适激素浓度及光质要求鲜有报道。因此，为探究不同激素配比和红蓝光处理对木质化茎段扦插生根的影响，获得较高的ARs形成率。本研究拟以苹果砧木为研究对象，设计不同激素配比和光质处理，并测定插穗中储藏养分的含量，采用转录组测序和表达量分析验证方法初步挖掘木质化茎段扦插生根的相关基因，以期为苹果砧木生根及其生根机理的深入研究提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

试验于2023年7—10月在中国农业大学西校区进行。以苹果砧木GM256与M9杂交后代的优系DG1178为材料，采穗母株定植于中国农业大学河北涿州试验站（39.29′N，115.58′E），树龄为4年。该试验站属于暖温带大陆性季风气候，年平均降雨量为554.14 mm，降雨主要集中于6—9月，年平均气温为11.6 ℃。

1.2　试验方法

1.2.1　扦插方法及激素配比处理

用消毒后的果枝剪从母株上剪下生长健壮、芽体饱满的已木质化带叶一年生枝条，后插入经过1 000倍液多菌灵（江苏蓝丰生物化工股份有限公司，中国）灭菌的V（蛭石）∶V（珍珠岩）=1∶1的基质中。试验在气、水循环扦插培养架中进行，该培养架参照专利CN113197092A^［17］搭建，控制环境温度为26 ℃左右，湿度为90%以上。采用0、1 500、3 000 mg/L IBA（Sigma，美国）和0、1 500、3 000 mg/L NAA（Sigma，美国）进行组合，共8个处理，以清水处理为对照（CK），各处理情况见表1。采用完全随机试验设计，每个处理3次重复，于扦插后50 d调查生根率并进行统计分析。

1.2.2　插穗生根过程中的光质处理

使用青岛索广电器有限公司生产的商用植物生长灯，插穗叶片处光合光子通量密度（Photosynthetic Photon Flux Density，PPFD）为110 μmol/（cm²·s），以红光、蓝光、红蓝光（红光∶蓝光=5∶1）为处理，采用完全随机试验设计，每个处理3次重复，于扦插后50 d调查生根率并进行统计。

1.2.3　根系指标、生理指标测定与转录组测序

进一步使用激素配比试验中筛选得到的最优激素浓度处理插穗，以清水处理为对照，对2个处理下插穗生根过程中的生理指标进行测定；并对扦插苗进行表型观察，每个处理3次重复，测定指标如下：

1）生根率及根系指标。于扦插后第50天进行观测，生根率计算公式如下：

\mathrm{生根}\mathrm{率}=\mathrm{生根}\mathrm{插穗}\mathrm{数}/\mathrm{插穗}\mathrm{总数}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

在试验过程中采用相机拍照，并将插穗照片使用WinRHIZO软件（Regent Instrument Inc.， 魁北克，加拿大）进行采集分析，记录根总长、生根数、根表面积、根体积及根平均直径等根系指标。

2）生理指标。可溶性糖、可溶性淀粉含量采用蒽酮比色法进行测定^［18］，可溶性蛋白含量使用可溶性蛋白试剂盒（G0507F）（苏州格锐思生物科技有限公司，中国）进行测定。测定时间为扦插第0、4、8和16天。

3）转录组测序。于扦插后第4天，对CK和3 000 mg/L NAA处理的插穗基部进行取样，由安诺优达基因科技（北京）有限公司进行转录组测序。

1.3　统计分析

利用Excel 2016整理试验数据和作图，使用IBM SPSS Statistics 26.0对试验数据进行统计分析，运用Origin 2022进行作图。

2　结果与分析

2.1　激素差异配比对苹果砧木生根的影响

探究不同激素配比处理对苹果砧木木质化茎段插穗生根率的影响（图1（a））及生根情况（图1（b））。IBA单独处理的T1和T2生根率无显著差异。用NAA单独处理插穗基部后，3 000 mg/L NAA（T4）生根率达到了74.74%，显著高于其他处理（P<0.05）。在IBA和NAA混合处理中，当IBA为1 500 mg/L时，将NAA浓度从1 500提高到3 000 mg/L后，对生根率并未造成显著影响；当IBA浓度为3 000 mg/L，将NAA浓度从1 500提高到3 000 mg/L后，插穗的生根率降低。

不同激素配比对苹果砧木生根根系的影响结果见表2。与其他处理相比，3 000 mg/L IBA处理下（T2）根尖数最多，根表面积和根体积最大，均显著高于CK（P<0.05）；T3的根总长最长，显著高于CK（P<0.05）；T7的根平均直径数值最大，达到了0.32 mm，且显著高于CK（P<0.05）。

2.2　光质差异对苹果砧木生根的影响

探究不同光质对苹果木质化茎段插穗生根率的影响（图2（a））及生根情况（图2（b））。在光质试验中，蓝光处理下苹果木质化茎段插穗的生根率达到74.53%；蓝光与红蓝光处理相比，插穗的生根率差异不显著，但二者均显著高于红光（P<0.05）。

不同光质对苹果砧木生根根系的影响见表3。蓝光处理下插穗根尖数为100.83，根总长为56.84 cm，均显著高于红光和红蓝光（P<0.05）；与红蓝光相比，蓝光处理下插穗的根表面积差异并不显著，但两者均显著高于红光处理（P<0.05）；红蓝光处理下插穗的根体积显著高于其他2个处理（P<0.05）；与红光和红蓝光相比，蓝光处理显著降低了生根苗根系的根平均直径（P<0.05）。

2.3　苹果砧木生根生理机理

不同时期扦插苗的外部形态见图3。使用筛选得到的最佳激素浓度处理（3 000 mg/L NAA）和清水处理插穗。第8天时，3 000 mg/L NAA处理和CK插穗基部开始膨大，均有愈伤组织形成；在第16天时，3 000 mg/L NAA处理的插穗基部已有ARs形成，而CK无ARs形成。

NAA对苹果砧木扦插苗不同时期生理指标的影响见图4。从0到第8天，3 000 mg/L NAA处理的插穗基部可溶性糖含量升高，在第16天可溶性糖含量下降，总体呈现先上升后下降的趋势，而CK处理呈上升趋势（图4（a））。在第4天时，3 000 mg/L NAA处理的插穗基部可溶性淀粉含量显著低于CK（P<0.05）；第16天时，NAA处理后的可溶性淀粉含量升高；2个处理均呈现先降后升的规律（图4（b））。在第4天时，3 000 mg/L NAA处理的插穗基部可溶性蛋白含量显著低于CK，而第16天NAA处理显著高于CK（P<0.05）（图4（c））。4个时间点的SPAD值差异均不显著（图4（d））。

NAA对苹果砧木生根根系的影响见表4。在扦插后第50天，3 000 mg/L NAA处理后扦插生根率达80.63%，显著高于CK处理（P<0.05）。3 000 mg/L NAA显著提高了插穗的根尖数（P<0.05）。3 000 mg/L NAA处理的根总长显著高于CK（P<0.05）。3 000 mg/L NAA处理后的根表面积为37.10 cm²，根体积为2.78 cm³，均显著高于CK（P<0.05）。3 000 mg/L NAA处理显著提高了根平均直径（P<0.05）。

2.4　苹果砧木生根分子机理

为进一步探究苹果砧木扦插生根的分子机理，对CK和3 000 mg/L NAA处理的插穗在扦插第4天时进行了转录组分析（图5）。在GO富集的3个大类中，生物过程（Biological process，BP）被注释的基因数目最多，为3 104个；其中有几个关键的生物学通路，包括对刺激的响应（Response to stimulus）、代谢过程（Metabolic process）、发育过程（Developmental process）、细胞活动（Cellular process）以及生物学调控（Biological regulation）等，主要生物学功能均为相关基因发挥作用；在生物过程中，细胞活动（Cellular process）富集的基因数目最多，达755个。分子功能（Molecular function，MF）中富集基因数目最多的2个途径为结合（Binding）与催化活动（Catalytic activity）通路。在细胞组分（Cellular component，CC）中，细胞结构组件（Cellular anatomical entity）被注释到的基因数目最多，包含的基因数目达1 085个（图5（a））。

两处理间共筛选到1 543个差异表达基因（DEGs），其中上调表达基因622个，下调表达基因921个。由GO富集分析可见（图5（b）），在BP中，脱落酸响应（GO：0009737）差异表达基因数最多，为59个，其次碳水化合物代谢过程（GO：0005975）差异表达基因数目为48个，缺水响应（GO：0009414）通路富集的差异表达基因数为43个；在CC方面，差异表达基因主要富集在细胞外（GO：0005576）和质外体（GO：0048046），分别为104和58个；在MF方面，DNA结合转录因子活性（GO：0003700）富集的差异表达基因数目最多，为119个。

对2个处理之间的DEGs进行KEGG通路分析（图5（c）），有149个差异表达基因富集在前9个通路中，这些通路主要为植物激素信号转导（Plant hormone signal transduction）、MAPK信号通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、戊糖和葡萄糖醛酸互换（Pentose and glucuronate interconversions）、DNA复制（DNA replication）、类胡萝卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）、光合作用-天线蛋白（Photosynthesis-antenna proteins）等；其中有45个基因富集在植物激素信号转导途径上，数目最多。

通过差异表达基因分析，在扦插第4天时，选出与生长素信号应答相关的3个上调表达基因和与淀粉分解相关的2个下调表达基因，采用qRT-PCR对4个时间点的基因表达水平进行定量分析（图6）。3 000 mg/L NAA处理下，MdSAUR51在第4天时相对表达量显著上调（P<0.05）（图6（a））；第4和8天时，MdSAUR50在3 000 mg/L NAA处理下表达量均显著上调（P<0.05）（图6（b））；在3 000 mg/L NAA处理下，在第4和16天时MdSAUR12的相对表达量显著上调，而在第8天时表达量显著下调（P<0.05）（图6（c））。第4天时，在3 000 mg/L NAA处理后插穗中MdBAM2的相对表达量显著下调（P<0.05）（图6（d））；在第4和8天时，与CK相比，MdBAM1在3 000 mg/L NAA处理后插穗中的相对表达量显著下调（P<0.05）（图6（e））。

3　讨 论

根原基的形成过程复杂，激素^［19］和光^［20］在其中起着重要的调控作用。苹果难生根株系经过3 000 mg/L IBA处理生根效果较好，易生根株系在1 000 mg/L IBA处理后生根率更高^［21］；已有研究发现500 mg/L IBA和1 000 mg/L IBA处理显著高于1 500 mg/L IBA处理的生根率^［5］；张广仁等^［22］以‘辽砧2号’为材料进行扦插发现，1 000 mg/L IBA和100 mg/L NAA组合处理生根效果优于IBA或NAA单独处理。本研究发现3 000 mg/L NAA单独处理下苹果砧木优系DG1178生根效果较好。在光质促进ARs形成的过程中，650~660 nm的红光可促进葡萄ARs的形成^［23］；在葡萄离体培养中，蓝光抑制了葡萄根系的发育^［24］。然而本研究在蓝光处理下插穗的根尖数和根总长显著提高，说明蓝光照射更适用于DG1178木质化茎段扦插扩繁。

插穗中的营养物质为ARs形成提供物质基础^［25］，其中营养物质主要有糖、淀粉以及蛋白质等。研究发现ARs形成需要大量的糖^［26］；可溶性糖在生根过程中存在明显的累积现象，经过生长素诱导后，可溶性糖提前达到峰值，进而产生ARs^［27］。本研究中NAA处理能够使可溶性糖更快积累，从而较早形成ARs，这与前人研究结果一致。魏树强^［28］在杂交鹅掌楸扦插过程中发现韧皮部的可溶性淀粉含量先减少后增加。结合本研究推测是因为激素处理导致大量可溶性淀粉被消耗转化为可溶性糖，促进了插穗ARs形成和根系伸长；另外，插穗叶片合成的光合产物被运送到插穗基部，使可溶性淀粉开始大量积累。同时，可溶性蛋白在ARs发育过程中扮演着重要的角色^［29］。张紫璇^［30］发现在花椒扦插过程中，可溶性蛋白含量先下降后上升再下降，推测第一次下降是因为可溶性蛋白被用于愈伤组织诱导，而第二次下降是因为可溶性蛋白被根系生长所消耗。这与本研究结果一致，说明可溶性蛋白可能被用于ARs形成。

SAURs^［31］和BAMs^［32］在植物生长发育中起着重要的调控作用。SAUR家族成员可以促进或抑制植物细胞伸长参与植物组织分化，同时对植物根系的生长发育具有调节作用。吴康^［33］用1 mmol/L IAA处理‘GL-3’盆栽苗后，发现MdSAUR6在植物体内高度表达，表明外源生长素与SAUR基因表达密切相关。本研究筛选到了3个SAUR家族基因MdSAUR51、MdSAUR50和MdSAUR12，发现这些基因在苹果ARs发育中也发挥着潜在调控作用。β-淀粉酶（β-amylase，BAM）可以切断多聚糖非还原性末端的糖苷键，使淀粉分解成为麦芽糖。有研究表明，MdBAM5与苹果中淀粉的降解密切相关^［34］；Peng等^［35］通过在柠檬中过表达PtrBAM1基因，抑制了叶片淀粉降解，从而抑制了可溶性糖含量的积累。本研究通过测定生理指标发现可溶性糖和淀粉是ARs形成的重要因素，因此通过调控BAM家族的相关基因MdBAM2和MdBAM1表达可潜在影响ARs的形成。然而，MdSAUR51、MdSAUR50、MdSAUR12、MdBAM2和MdBAM1基因如何参与ARs形成的具体分子机理有待进一步研究。

4　结 论

本研究以苹果砧木为研究对象，研究了不同激素配比和红蓝光处理对木质化茎段扦插生根的影响，并对生根的生理及分子机制进行了初步探究，主要结论如下：

1）红蓝光、蓝光以及3 000 mg/L NAA对苹果木质化茎段扦插生根具有较好的促进效果，蓝光处理可以使扦插苗根系更发达。

2）3 000 mg/L NAA条件下，可溶性糖、可溶性淀粉和可溶性蛋白在生根不同阶段进行差异性积累，促进了苹果砧木木质化茎段扦插生根。

3）获得了与生根相关的9个KEGG富集通路和1 543个差异表达基因，并且筛选得到与带叶木质化茎段扦插不定根形成高度相关的5个关键基因，这些基因参与调控了细胞伸长、生长素极性运输和淀粉水解过程。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2019YFD1000103)

国家自然科学基金项目(31801810)

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2024TC146)

北京市教委高精尖学科建设项目(PXM2019_014207_000032)