灰比诺葡萄病毒侵染性克隆构建及致病性

Construction and pathogenicity tests of one infectious clone of Grapevine Pinot gris virus

摘要

为探索灰比诺葡萄病毒（Grapevine Pinot gris virus， GPGV）在葡萄上的致病性，以感染GPGV山东分离物（GPGV-SD）的‘阳光玫瑰’葡萄植株为试材，利用RT-PCR扩增获得GPGV-SD的基因组全长序列并构建了该病毒的侵染性克隆，随后将其接种本生烟和葡萄植株进行致病性分析。结果表明：GPGV-SD基因组全长为7 274个核苷酸（不含poly（A）尾），与国内外已报道的GPGV分离物的核苷酸序列相似度为74.00%~96.90%。GPGV-SD能系统侵染本生烟，分别在接种后5和8 d检测到第1片系统叶和顶部叶中的GPGV，并在接种后约3周观察到本生烟系统叶出现褪绿斑症状。利用农杆菌介导的真空渗透法也可使GPGV-SD系统侵染葡萄植株，‘红地球’和‘马瑟兰’葡萄苗在接种GPGV-SD后未表现出明显的病毒病症状。本研究有助于拓宽对GPGV致病性的认识，所构建的GPGV-SD的侵染性克隆可作为葡萄病毒与寄主互作研究的工具。

Abstract

To explore the pathogenicity of Grapevine Pinot gris virus （GPGV） on grapes， grapevine cultivar Shine Muscat plant infected with GPGV Shandong isolate （GPGV-SD） was taken as the study material. RT-PCR was used to amplify the complete genome sequence of GPGV-SD and an infectious cDNA clone of the virus was then constructed. The pathogenicity of GPGV-SD on Nicotiana benthamiana and grapevine plants were also analyzed. The results indicated that： The genome of GPGV-SD was 7 274 nucleotides in length excluding the poly（A） tail， which shared 74.00% to 96.90% nucleotide sequence similarity with that of the previous reported isolates of GPGV. GPGV-SD could systemically infect N. benthamiana plants and the virus was detected in the first systemically infected and upper leaves at about 5 to 8 days after inoculation. In addition， the symptoms of chlorotic blotches and spots were observed in systemically infected leaves of N. benthamiana plants at about 3 weeks after inoculation. GPGV-SD was also able to systemically infect grapevine plants via vacuum-agroinfiltration method， and the inoculation of the ‘Marselan’ and ‘Red Globe’ grapevine plants with GPGV-SD did not induce obvious symptoms. In conclusion， this study can broaden our knowledge on the pathogenicity of GPGV-SD， and the infectious cDNA clone of GPGV-SD is a power tool for studying the interactions between grapevine viruses and hosts.

Graphical abstract

关键词

葡萄灰比诺病毒 / 侵染性克隆 / 致病性 / 本生烟 / 葡萄

Key words

Grapevine Pinot gris virus / infectious clone / pathogenicity / Nicotiana benthamiana / Vitis vinifera

葡萄是感染病毒最多的果树，至今已发现有90多种病毒可侵染葡萄^［1］。病毒病可导致葡萄产量平均减少30%~80%，严重者甚至绝收；同时病毒病使葡萄果粒着色差且大小不等、可溶性固形物含量显著降低^［2］。对葡萄生产危害最大的病毒病主要有葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease）、葡萄扇叶病（又称葡萄扇叶退化病，Grapevine fanleaf degeneration）、葡萄皱木复合病（Grapevine rugose wood complex）和葡萄叶斑驳畸形病（Grapevine leaf mottling and deformation，GLMD）等^［1］。其中，GLMD是2012年在意大利葡萄园中的‘灰比诺（Pinot gris）’葡萄品种上首次发现的^［3］，目前，该病在世界各国葡萄园中均有广泛分布。发病葡萄植株叶片表现褪绿斑驳和严重畸形，枝条节间变短、植株矮小^［3］。有研究表明，葡萄灰比诺病毒（Grapevine Pinot gris virus， GPGV）可能与该病相关^［3-5］。

GPGV为正单链RNA病毒，是乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）毛发状病毒属（Trichovirus）的成员。该病毒基因组全长约7 179~7 312个核苷酸，含3个开放阅读框，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、移动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）。3'末端有poly（A）尾。GPGV在无症状和有叶斑驳畸形病症状的葡萄植株中均可被检测到^［3］，而且通常与其他病毒一起复合侵染葡萄植株^［4-5］。目前我们对GPGV致病性的认识还十分有限。

GLMD近年来在我国扩展迅速，在‘阳光玫瑰’‘美人指’‘巨玫瑰’等许多葡萄主栽品种上普遍发生^［5］。本研究通过RT-PCR扩增、5'和3'RACE获得GPGV山东分离物（GPGV-SD）基因组全长序列并构建了该病毒的侵染性cDNA克隆，随后在‘红地球’‘马瑟兰’葡萄苗和该病毒的试验寄主本生烟上进行了GPGV-SD侵染性和致病性分析，旨在加深对GPGV致病性的认识，并为葡萄的基因功能验证提供研究工具。

1　材料与方法

1. 1　植物材料、载体和菌株

感染了包括GPGV在内的多种病毒的‘阳光玫瑰’葡萄盆栽苗（将采自山东的休眠枝条经扦插繁育得到）、本生烟及经过农杆菌菌液浸润后移栽到土盆的‘红地球’‘马瑟兰’葡萄苗在养苗室中分区放置。在组培室中培养的‘红地球’‘马瑟兰’葡萄组培苗经脱毒处理后，不含葡萄卷叶伴随病毒1号（Grapevine leafroll-associated virus 1， GLRaV-1）、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7、GLRaV-13、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus， GFkV）、葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus， GFLV）、葡萄A病毒（Grapevine virus A， GVA）、GPGV、葡萄浆果内坏死病毒（Grapevine berry inner necrosis virus， GINV）、葡萄蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus， GFabV）、葡萄双生病毒A（Grapevine geminivirus A， GGVA）和沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus， GRSPaV）。养苗室和组培室温度均为25 ℃左右，光照16 h，黑暗8 h。

植物双元表达载体pXT1由南京农业大学陶小荣教授惠赠，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101由本实验室保存。GPGV CP抗血清由本实验室制备保存。

1.2　试剂及引物

DNA marker、2×Taq PCR Master Mix购自北京拓英坊科技有限公司，胶回收试剂盒、反转录试剂盒（HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、5'/3'RACE 扩增试剂盒（HiScript-TS 5'/3' RACE Kit）、拓扑克隆试剂盒（Ultra-Universal TOPO Cloning Kit）和质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，高保真酶（KOD One TM PCR Master Mix）购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，RNA提取试剂盒（HiPure HP Plant RNA Mini Kit）购自广州美基生物科技有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，同源重组酶（HiFi DNA Assembly Master Mix）购自NEW ENGLAND Biolabs公司。

GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7、GLRaV-13、GFkV、GFLV、GVA、GPGV、GINV、GGVA、GFabV和GRSPaV的检测引物和克隆GPGV全基因组引物见表1。本研究引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3　RT-PCR和PCR检测葡萄病毒

分别将本生烟叶片、葡萄叶片组织加液氮并研磨成粉末。将粉末转移到2 mL的RNase-free离心管中，分别按照RNA和DNA提取试剂盒的操作手册提取总RNA和总DNA。随后将RNA反转录成cDNA。根据反转录试剂盒（HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）的使用说明进行操作。

检测GGVA时直接用DNA进行PCR，检测其他病毒和克隆GPGV-SD全基因组均用cDNA为模板进行PCR反应。10 μL的PCR扩增体系中包括1 μL cDNA或DNA、3 μL ddH₂O、正反向引物各0.5 μL（10 µmol）和5 μL 2×Taq PCR Master Mix。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min、95 ℃变性30 s、54~60 ℃（根据引物Tm值确定）退火30 s、72 ℃延伸24~45 s（根据产物长度确定），35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4　蛋白质印迹（Western blot）

Western blot检测GPGV按照文献［12］介绍方法操作。GPGV CP抗血清的稀释倍数为1∶2 000，用ECL化学发光法检测杂交信号。

1.5　GPGV-SD侵染性克隆构建、测序

将检测GPGV CP基因的PCR产物送公司测序，将测序结果（GPGV CP基因部分序列342 bp）在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行比对，发现与GPGV分离物ERR922631（GenBank：BK011064）的CP基因序列相似度为97.67%。因此，根据该分离物全序列设计引物F17/R17（表1）来扩增GPGV-SD全基因组。用拓扑克隆试剂盒将扩增产物连接pCE3 Blunt Vector并送公司进行NGS测序。保存测序结果正确的重组质粒（pCE-GPGV-SD）。为进一步确定GPGV-SD基因组5'和3'末端序列的正确性，用5'/3'RACE扩增试剂盒将葡萄总RNA反转录成cDNA，参照上述GPGV-SD全序列设计5'/3'基因特异性引物（5' GSP：GGGACCAAATGCCCTATGTGACTGGAGG；3' GSP：AGGAGAGAGCTGATCGCAAAGCTGAGCG）并扩增GPGV-SD的5'末端和3'末端序列，将扩增产物连接pCE3 Blunt Vector并送公司进行Sanger测序，获得正确的GPGV-SD末端序列。使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joining），自展校正值为2 000，对GPGV-SD和选取的GenBank已报道的19个GPGV分离株进行系统进化树分析。

随后构建GPGV-SD侵染性克隆。首先，根据GPGV-SD全基因组和载体pXT1的序列信息设计引物F（5'-3'： TTAATTTTCAAAAAAAAAAA GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCG）/R（5'-3'： TTATCCGAAAATTAAAATGACC TCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATAT）。以双元表达载体pXT1为模板进行PCR扩增，扩增产物即为线性化的pXT1全序列片段（片段两端末尾分别带有GPGV-SD的同源臂，其序列为引物划线部分）。以pCE-GPGV-SD为模板，用F17/R17进行PCR扩增得到GPGV-SD全基因序列。用同源重组酶HiFi DNA Assembly Master Mix将这2个片段进行拼接，获得GPGV-SD侵染性克隆（pXT-GPGV-SD）。

1.6　GPGV-SD侵染性克隆在本生烟和葡萄上的致病性分析

将pXT-GPGV-SD用冻融法转化农杆菌菌株GV3101，利用菌液PCR筛选获得阳性克隆。将含有pXT-GPGV-SD的农杆菌菌液在YEP液体培养基中（含50 µg/mL卡那霉素、25 µg/mL利福平）经过2次摇菌（28 ℃）至OD₆₀₀值约为1.0。收集菌体（6 000 r/min、5 min），随后用MMA缓冲液（10 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L MES和150 μmol/L AS）重悬菌液至OD₆₀₀值为1.0。菌液在浸润前于室温条件下静置2 h。

生长6周左右的本生烟用于GPGV-SD的侵染试验。用1 mL一次性无菌注射器（无针头）将重悬菌液浸润到叶片背面，每片叶浸润0.4 mL，每株烟草浸润2片叶。对浸润后的植株每天观察发病情况，并分别在浸润后1至10 d取第1片系统叶和顶部未展开叶为样品，用RT-PCR和Western blot检测GPGV。

继代培养4周的‘红地球’‘马瑟兰’葡萄生根组培苗用于GPGV-SD的侵染试验。将组培苗从瓶中取出，用清水冲洗掉残剩的培养基。然后将组培苗浸没于含有pXT-GPGV-SD的农杆菌菌液中，按照文献［13］的操作方法用真空渗透法将农杆菌菌液浸润组培苗。把浸润后的组培苗用清水冲洗一下，将其移栽到土盆中。每天观察移栽葡萄植株的生长和发病情况，并在移栽1个月后采集葡萄叶片样品，用RT-PCR和Western blot检测GPGV。

2　结果与分析

2.1　克隆GPGV-SD全基因组序列

2023年1月，对采自山东烟台的‘阳光玫瑰’葡萄休眠枝条进行扦插繁殖时，发现成活的葡萄苗表现出叶斑驳畸形病症状（图1（a））。用RT-PCR和PCR对其进行了GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7、GLRaV-13、GFabV、GVA、GPGV、GFkV、GFLV、GINV、GGVA和GRSPaV等14种重要葡萄病毒的检测，结果表明，该植株感染了GLRaV-3、GVA、GPGV、GRSPaV和GFkV这5种病毒（图1（b）和（c））。随后用RT-PCR扩增‘阳光玫瑰’葡萄植株GPGV分离物（GPGV-SD）的全基因组，并通过5'和3'RACE确定GPGV-SD基因组末端序列的正确性。GPGV-SD基因组（GenBank： PP350831）全长为7 274 nt（不含poly（A）尾），与国内外已报道的GPGV分离物序列相似度在74.00%~96.90%。系统进化树结果显示（图2），GPGV-SD与来自法国的GPGV分离物PN（GenBank： KY706085）和来自意大利的GPGV分离物fvg-Is12（GenBank： MH087443）亲缘关系最近，自展值（Bootstrap value）均达到了100%。

此外，GPGV-SD的3'末端存在着poly（A）尾，但3次RACE试验得到的poly（A）尾长度均不一样，分别为11、8和17个A，这表明该病毒在葡萄植物体内存在poly（A）长度变化的状况。本研究构建的GPGV-SD侵染性克隆含由11个A组成的poly（A）尾。

2.2　GPGV-SD在本生烟上的致病性

将3'末端含poly（A）尾（11个A）的GPGV-SD全长序列通过同源重组法构建了侵染性克隆pXT-GPGV-SD。将携带pXT-GPGV-SD质粒的农杆菌菌液浸润本生烟，对照为浸润空载体pXT1，各处理16株。在浸润后第21天，浸润pXT-GPGV-SD的本生烟有14株成活，其中12株本生烟的系统叶出现褪绿斑症状，而浸润空质粒的本生烟均未出现症状（图3（a））。抽取3株本生烟连续9 d进行RT-PCR检测，结果显示，在浸润pXT-GPGV-SD后的第5和第8天，分别在第1片系统叶和顶部未完全展开叶样品中检测到GPGV微弱条带（图3（b）和（c））。Western blot检测结果也显示，浸润后第8天，在接种植株第1片系统叶中可检测到明显的GPGV CP条带（图3（d））。这些结果表明，本研究构建的GPGV-SD侵染性克隆可系统侵染试验寄主本生烟，在接种后5~8 d，GPGV就可从本生烟的浸润叶移动到全株，并在接种约3周后引起系统叶的褪绿斑症状。

2.3　GPGV-SD在‘红地球’‘马瑟兰’葡萄品种上的致病性

将携带pXT-GPGV-SD质粒的农杆菌菌液浸润‘红地球’‘马瑟兰’葡萄组培苗，对照为浸润空质粒pXT1。移栽后7~10 d有新芽长出，表明移栽成活。移栽1个月后对葡萄苗取样进行病毒检测。20株‘红地球’葡萄组培苗有15株（75%）在浸润pXT-GPGV-SD后存活，其中9株（60%）在一个月后经RT-PCR检测到GPGV；20株‘马瑟兰’葡萄组培苗有14株（70%）在浸润后存活，其中8株（57%）在一个月后经RT-PCR检测到GPGV（图4（b））。Western blot也显示在浸润pXT-GPGV-SD的葡萄新叶中能检测到GPGV的CP条带（图4（c））。‘红地球’‘马瑟兰’葡萄分别在移栽后约100和60 d内，均未表现出明显的病毒病症状（图4（a））。说明本研究所构建的GPGV-SD侵染性克隆可系统侵染葡萄植株，且在本研究的试验条件下没有导致‘红地球’‘马瑟兰’葡萄品种出现明显的病毒病症状。

3　讨　论

本研究以表现叶斑驳畸形病症状的‘阳光玫瑰’葡萄为材料，构建了GPGV-SD侵染性克隆，成功系统侵染了本生烟并引起了褪绿斑症状，但未能在‘红地球’‘马瑟兰’葡萄上引起明显的病毒病症状。Targuini等^［14］报道GPGV分离物fvg-Is12和fvg-Is15（GenBank： MH087443和MH087446）侵染本生烟引起严重黄化症状；在葡萄上则观察到叶斑驳畸形症状，不过在一段时间后该症状消失。GPGV-SD与GPGV分离物fvg-Is12和fvg-Is15的核苷酸相似度分别为96.13%和96.03%，核苷酸差异有可能是导致GPGV-SD致病性相对较弱的原因之一。Yu 等^［5］和Fan等^［15］的研究结果表明，在表现叶斑驳畸形病症状的葡萄植株中，除GPGV外，还经常检测到GFabV、GRSPaV和GINV，这表明叶斑驳畸形病可能与多种病毒混合侵染有关。但是Targuini等^［14］未对试验所用的灰比诺葡萄检测是否感染GFabV、GRSPaV和GINV，而本研究所用的‘红地球’‘马瑟兰’葡萄苗不含GPGV、GFabV、GRSPaV和GINV等14种病毒。因此，这可能是GPGV-SD在‘红地球’‘马瑟兰’葡萄苗上未导致叶斑驳畸形症状的最主要原因。有报道表明，葡萄阿尔及利亚潜伏病毒（Grapevine Algerian latent virus）侵染性克隆可导致不同葡萄品种出现不同的症状^［16］，而本研究与Targuini等^［14］所用的葡萄品种不同。因此也不能排除因品种差异而造成GPGV-SD未在葡萄上导致症状的可能性。在后续的研究中需要在更多的葡萄品种苗上分析GPGV-SD的致病性。

此外，一些植物RNA病毒的基因组3'末端含poly（A）尾，且poly（A）尾长度可能与病毒侵染及病毒病症状形成具有密切的相关性^［17-18］。GPGV-SD基因组的3'末端也含poly（A）尾，且poly（A）的长度至少有3种，即8、11和17个A。本研究构建的侵染性克隆中，GPGV-SD基因组3'末端的poly（A）尾长度为11。而Targuini等^［14］未说明能引起叶斑驳畸形病的GPGV侵染性克隆是否含poly（A）尾。下一步需要构建含不同poly（A）尾长度的GPGV-SD侵染性克隆来进一步分析其在葡萄上的致病性。

目前对葡萄等木本植物接种病毒的方法主要有农杆菌真空渗透法^［13］和农杆菌浸泡法^［19］。由于后一种方法不仅操作繁琐，且需要超过20 d才能完成病毒侵染过程，因此本研究利用农杆菌真空渗透法对葡萄组培苗接种GPGV-SD。但本研究发现该方法的操作也比较复杂而费时，且葡萄组培苗的移栽成活率（约70%）和病毒侵染率（约60%）也相对较低。如何用简单高效的方法将病毒侵染性克隆接种到葡萄等果树植物，是下一步要解决的问题。

4　结　论

本研究成功构建了GPGV-SD的侵染性克隆，能系统侵染本生烟和葡萄，在本生烟上引起系统叶的褪绿斑症状，但在‘马瑟兰’‘红地球’葡萄上没有导致明显病毒病症状。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32272646)