弓首属3种蛔虫卵体外发育的形态观察

Morphological observations ofthe egg developments of three Toxocara spp. in vitro

摘要

弓首蛔虫病是一种严重危害动物和人健康的全球性线虫病，虫卵是该病的主要感染源。为研究弓首蛔虫卵的体外发育形态学变化，本研究采用彩色显微图像智能识别系统对体外培养的弓首蛔虫3个常见种：犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫虫卵进行连续21 d的观察和记录。结果表明：1）犬弓首蛔虫和犊弓首蛔虫虫卵存在12个体外发育阶段，包括1细胞期、2细胞期、3细胞期、4细胞期、早期桑葚期、晚期桑葚期、囊胚期、肠胚期、1期幼虫前期、1期幼虫期、2期幼虫前期和2期幼虫期，猫弓首蛔虫卵因5细胞期的出现而存在13个体外发育阶段。2）比较观察发现，弓首蛔虫卵在培养24 h后出现卵裂，进入2~5细胞期，随后虫卵第3~5天陆续进入桑葚期、囊胚期、肠胚期；猫弓首蛔虫卵第6天出现1期幼虫（2.2%），第7天出现感染性2期幼虫（2.1%）；犬弓首蛔虫卵第7天出现1期幼虫（22.5%），第8天出现感染性2期幼虫（10.7%）；犊弓首蛔虫卵第6天出现 1期幼虫（1.9%），第9天出现感染性2期幼虫（0.9%）；由此可见，猫弓首蛔虫卵是弓首属发育速度最快的虫卵。以上研究结果补充和完善了弓首蛔虫卵体外发育的形态学基础信息。

Abstract

Toxocariasis caused by the species of Toxocara is a global disease with significant threats to human and animal health， and the embryonated egg is the main source of infection for the occurrence and prevalence of this zoonotic disease. To study the morphological changes of Toxocara eggs， an intelligent color microscopic image recognition system was used to track and record the complete developmental processes of eggs from three common Toxocara species including Toxocara canis， Toxocara cati and Toxocara vitulorum within a continuous 21-day egg culture in vitro. The results showed that： 1）The complete development of eggs from either T. canis or T. vitulorum was divided into 12 development stages including one-cell， two-cell， three-cell， four-cell， early-morula stage， late-morula stage， blastula， gastrula， pre-L1 （the first-stage larva）， L1， pre-L2 （the second-stage larva） and L2 stages； in contrast， T. cati eggs was divided into 13 developmental stages because of the presence of the five-cell stage. 2）Comparative observations revealed that Toxocara eggs started with cleavage and entered the two-to-five cell stages after 24-hour culture， followed by the morula， blastula and gastrula stages after 3 day to 5 day culture. Further， 2.2% T. cati egg developed into the L1 stage on the 6th day and 2.1% T. cati egg developed into the infective L2 stage on the 7th day. Correspondingly， 22.5% T. canis eggs developed into the L1 stage on the 7th day and 10.7% T. canis eggs developed into infective L2 stage on the 8th day； 1.85% T. vitulorum eggs developed into the L1 stage on the 6th day and 0.9% T. vitulorum eggs developed into the infective L2 stage on the 9th day， thus it was notable that the T. cati egg had the fastest development rate among Toxocara species. These results updated the basic knowledge on developmental morphology of Toxocara eggs in vitro.

Graphical abstract

关键词

弓首蛔虫 / 人畜共患病 / 虫卵 / 发育形态学

Key words

Toxocara spp. / zoonotic diseases / eggs / developmental morphology

弓首蛔虫（Toxocara spp.）是危害动物和人健康的一类重要寄生性线虫，其常见种类包括犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、犊弓首蛔虫^［1-4］。这些蛔虫卵广泛存在于环境，一旦发育成熟便可对犬科、猫科、牛科动物及人造成直接感染。在动物体内，含2期幼虫的感染性虫卵在小肠孵化，幼虫经血液循环和组织移行，可造成宿主肝、肺等脏器的机械性损伤及炎症；同时部分幼虫还可潜伏于宿主组织，在妊娠期或哺乳期经胎盘或母乳感染年幼动物^［5-8］。在人体内，犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫卵孵出的幼虫可在各组织器官移行，诱发内脏幼虫移行症（VLM）、眼睛幼虫移行症（OLM）、神经幼虫移行症（NLM），造成癫痫、神经性精神障碍及脑退行性病变^{［5，7，9］}。目前世界各国均有人感染弓首蛔虫的病例报道，其中婴幼儿和学龄儿童是感染本病的主体。流行病学调查数据显示，我国学龄儿童的弓首蛔虫病感染为12.1%~19.3%，美国学龄儿童的弓首蛔虫病感染为13.9%，马来西亚学龄儿童的弓首蛔虫病感染为19.6%，而印度尼西亚学龄儿童的弓首蛔虫病感染更是高达85%^［5-7］；由此，弓首蛔虫病已被美国疾病预防与控制中心（CDC）列为全球被忽视的5种寄生虫病之一（https：//www.cdc.gov/parasites/npi/）。

与多数土源性寄生线虫类似，虫卵是弓首蛔虫病最主要的感染源，这些虫卵经宿主粪便排出体外后在外界环境适宜温度和湿度条件下，经历数十天的发育便可具有感染性^［5，9］，因此了解并掌握弓首蛔虫卵的体外发育特征以及发育速度将对弓首蛔虫病的防控具有重要意义。然而遗憾的是，截至目前，有关弓首蛔虫卵体外发育的研究却十分有限，仅个别虫种（如犬弓首蛔虫^［10］、猫弓首蛔虫^［11］）的虫卵发育阶段及特征被报道，且缺乏系统性、完整性以及比较分析。基于此，本研究拟采用彩色显微图像智能识别系统分别对3种弓首蛔虫——犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫卵进行连续观察、记录和比较，以期绘制弓首蛔虫卵体外发育完整的形态变化过程及对应特征，为今后弓首蛔虫病的防控工作提供基础数据。

1　材料与方法

1.1　材料

新鲜的疑似犬弓首蛔虫成虫采自四川成都流浪犬收容中心救助的中华田园犬幼犬，猫弓首蛔虫成虫采自四川农业大学教学动物医院医治的苏格兰折耳猫，犊弓首蛔虫成虫采自甘孜州新龙县农民自养的犊牦牛；3种虫体均为伊维菌素驱虫所得。随机选取各成虫虫体，使用体视显微镜进行头端和前端形态特征观察，参照弓首蛔虫分类鉴别要点做初步形态学鉴定^［7］。

1.2　虫种鉴定

为了进一步确定物种信息，分别截取3种宿主源蛔虫虫体部分组织，提取DNA，使用犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫ITS-1特异扩增引物^［12-13］进行PCR分子鉴定。PCR反应体系为50 μL：DNA模板4 µL、ExTaq 2 µL、dNTP混合液4 µL、10× PCR缓冲液（Mg²⁺）5 µL、ddH₂O 29 µL、上下游引物各3 µL；反应条件：94 °C预变性5 min，94 °C变性30 s，54 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，循环扩增35次，72 °C延伸10 min。扩增产物经凝胶电泳和测序分析，确认物种信息。

1.3　虫卵的体外培养

无菌剖解鉴定的犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫雌性虫体，截其子宫后1/4处用于收集子宫内的成熟虫卵，虫卵经计数后，使用虫卵培养液PSABS（含15 KU/mL青霉素、15 mg/mL链霉素和30 μg/mL两性霉素B）分别对3种虫卵进行稀释，稀释虫卵终浓度为200枚/mL。吸取每种蛔虫虫卵稀释液1 mL依次注入无菌麦克马斯特计数器左右计数室，形成重复。将3种弓首蛔虫对应的3组麦克马斯特计数器置于28 °C培养箱，恒温培养21 d，期间每天观察培养液体积，及时补充培养液。

1.4　虫卵的发育观察与形态记录

利用彩色显微图像智能识别系统，每12 h观察和记录3种弓首蛔虫卵的体外发育形态变化情况，并描述其形态特征，统计各蛔虫卵不同发育阶段的占比。

2　结果与分析

2.1　弓首蛔虫的虫种鉴定

形态学观察结果显示，犬源蛔虫成虫呈乳白色，头端具3片唇，虫体前端两侧有向后延伸的颈翼膜；猫源蛔虫成虫呈白色，头端具3片唇，但虫体前端两侧颈翼膜宽而短，似箭头；牦牛源蛔虫成虫粗大，呈淡黄色，头端具3片唇，虫体颈翼膜不明显（图1）。

PCR扩增结果表明，3种蛔虫均在560 bp左右出现特异扩增目的条带（图2），与预期的片段大小一致^［12-13］。经测序并与BLAST序列比对分析表明，犬源蛔虫与犬弓首蛔虫（GenBank登录号AJ002435.1）序列相似性为100%；猫源蛔虫与猫弓首蛔虫（GenBank登录号OM822767.1）序列相似性为99.98%；牦牛源蛔虫与犊弓首蛔虫（GenBank登录号EU220232.1）序列相似性为100%，证明本研究从中华田园犬、苏格兰折耳猫、牦牛所得蛔虫分别为犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫，且各蛔虫雌虫分离虫卵可用于后续弓首蛔虫卵体外发育形态学观察。

2.2　弓首蛔虫卵发育的形态学变化

与猫弓首蛔虫卵13个体外发育阶段（含5细胞期）不同，犬弓首蛔虫卵和犊弓首蛔虫卵仅包含12个发育阶段，包括1细胞期、2细胞期、3细胞期、4细胞期、早期桑葚期、晚期桑葚期、囊胚期、肠胚期、 1期幼虫前期、1期幼虫期、2期幼虫前期和2期幼虫期（图3）；详细的弓首蛔虫卵体外阶段发育形态特征如表1所示。从虫卵发育速度来看，猫弓首蛔虫卵的发育速度似乎最快，仅7 d便可发育为感染性虫卵；犬弓首蛔虫卵次之，需8 d才能发育为感染性虫卵；而犊弓首蛔虫卵则最慢，第9天才仅有0.93%的虫卵发育为感染性虫卵（图4）。在虫卵发育形态变化方面，3种弓首蛔虫卵存在着相似阶段形态发育特征，即新鲜弓首蛔虫卵呈球形或卵球形，胞质占据整个虫卵，经6 ~12 h培养，虫卵胞质开始浓缩，并与卵内壳间形成一条明显的间隙，从而整个虫卵呈现出标准的1细胞期形态，在随后培养的24 h后，部分虫卵开始出现卵裂现象（图3）。本研究发现，犊弓首蛔虫卵的卵裂速度最快，猫弓首蛔虫卵次之，犬弓首蛔虫卵最慢；如培养的前2 d，犊弓首蛔虫卵已发育至2、3、4细胞期，甚至约45%虫卵发育至早期桑葚期；猫弓首蛔虫卵虽然出现与犊弓首蛔虫卵相似的发育阶段，但仅5%的早期桑葚期；而犬弓首蛔虫卵仅出现2、3、4细胞期（图4）。在虫卵发育中期（3~6 d），猫弓首蛔虫卵的发育速度加快，成为最早出现囊胚期和肠胚期的虫卵（第4天），其次是犊弓首蛔虫卵（第5天）和犬弓首蛔虫卵（第6天）。在虫卵发育晚期时，犬弓首蛔虫卵的发育速度明显增快，成为发育速度第二快的弓首蛔虫卵，具体为猫弓首蛔虫卵在第7天出现感染性2期幼虫、犬弓首蛔虫卵在第8天出现感染性2期幼虫，而犊弓首蛔虫卵在第9天出现感染性2期幼虫。3种蛔虫卵出现的1期幼虫前期、1期幼虫和2期幼虫前期时间差异不明显。

2.3　弓首蛔虫卵发育的各阶段比例变化

在整个弓首蛔虫卵发育过程中，本研究发现所有阶段均可持续出现，且在特定时间内，多个发育阶段的虫卵占比可同时达到峰值（图5），如犬弓首蛔虫卵培养第2天的2和3细胞期以及第7天的1期幼虫前期和2期幼虫前期；猫弓首蛔虫卵培养第4.5天的5细胞期和早期桑葚期；犊弓首蛔虫卵培养第1天的2、3、4细胞期以及培养第6天的肠胚期和1期幼虫前期。进一步对阶段占比比较发现，猫弓首蛔虫卵和犊弓首蛔虫卵发育高峰为前7 d，而犬弓首蛔虫卵整个培养过程前8 d为其发育高峰期（图5）。相较犬弓首蛔虫卵，猫弓首蛔虫卵和犊弓首蛔虫卵每天均有超过16%的虫卵发育至新的阶段，且新发育阶段占比在进入新阶段的第2~7天达峰值。例如，猫弓首蛔虫卵第4天的3细胞期（19.5%）、第5天的晚期桑葚期（20.2%）、第9天的1期幼虫期（35.3%）和第17天的感染性2期幼虫期（78.3%），以及犊弓首蛔虫卵第1天的2细胞期（28.7%）、3细胞期（17.6%）和4细胞期（32.4%）、第3天的早期桑葚期（50.9%）、第4天的晚期桑葚期（84.9%）、第5天的囊胚期（58.3%）、第7天的1期幼虫期（54.6%）和第10天的2期幼虫前期（44.4%）（图5）。相反，犬弓首蛔虫卵每天仅有10%的虫卵发育至新阶段，但它们可在进入新阶段当天达到占比峰值，如第2天的2细胞期（25.4%）、第3天的早期桑葚期（26.6%）、第5天的晚期桑葚期（34.4%）、第6天的肠胚期（28.7%）、第7天的2期幼虫前期（22.5%）以及第21天的感染性2期幼虫期（30.6%）。

3　讨论

众所周知，虫卵是弓首蛔虫病最主要的感染源，然而目前有关弓首蛔虫卵体外发育过程的研究却较为缺乏，对于弓首属不同种类间虫卵体外发育相似性与差异性更是知之甚少。为此，本研究首次通过对弓首属3个常见种——犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫的虫卵连续21 d的体外培养与观察，共记录到12~13个不同发育阶段，其中猫弓首蛔虫卵包括1细胞期、2细胞期、3细胞期、4细胞期、5细胞期、早期桑葚期、晚期桑葚期、囊胚期、肠胚期、1期幼虫前期、1期幼虫期、2期幼虫前期和2期幼虫期等13个发育阶段，犬弓首蛔虫卵和犊弓首蛔虫卵因缺失5细胞期而仅有12个发育阶段，该结果与张艺琳等^［10］的研究结果一致；而与猪蛔虫卵^［14］的9个发育阶段（1细胞期、2细胞期、3细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、囊胚期、蝌蚪期及成熟幼虫期）相比，新增了5细胞期、1期幼虫前期、1期幼虫和2期幼虫前期4个阶段，进而补充了弓首蛔虫乃至蛔目蛔虫卵体外发育形态变化数据的系统性和完整性。值得注意的是，与同属犬弓首蛔虫和猫弓首蛔虫卵相比，猫弓首蛔虫卵多一个5细胞期，其是否与虫种本身有关尚需进一步研究确认，但是考虑到猫弓首蛔虫卵卵裂速度介于犊弓首蛔虫卵与犬弓首蛔虫卵之间，或许将进一步缩短观察和记录的时间间隔（0.25 d/次）可以帮助确认该推测。另外，本研究结果显示，相较犬弓首蛔虫卵，猫弓首蛔虫卵体外发育速度更快，仅需7 d便可发育形成感染性2期幼虫，暗示其可能更易造成潜在的公共卫生危害，该发现提示兽医及相关防疫人员应重视对该蛔虫病的监测和关注。此外，本研究还发现3种弓首蛔虫卵均存在体外发育不同步性，即不同发育阶段可在相同时间点出现，甚至部分已发育至感染性2期幼虫期，但仍有绝大部分虫卵却还处于细胞期，再一次印证张艺琳等^［10］和Azam等^［15］的结论。

本研究发现弓首蛔虫卵各发育阶段形态特征与猪蛔虫卵^［14］极为类似，一定程度上说明蛔虫卵发育过程存在相似性和保守性。然而，就发育特征而言，相较蛔属蛔虫（如猪蛔虫），弓首属蛔虫卵的体外发育早期似乎更活跃，其不仅各阶段持续时间短，而且进入新阶段的虫卵数量也比蛔属蛔虫卵多。结合2个属蛔虫卵结构特征来看^［16-17］，这或许与弓首属蛔虫特有的自我保护行为有关。在形态结构上，蛔属蛔虫卵拥有厚厚的蛋白外壳，而弓首属蛔虫卵壳却较薄，因此当面对外界不利环境因素（如光照、干旱、微生物感染）时，弓首属蛔虫卵更快的体外发育速度可以间接增加虫卵的环境抗逆性。另外，3种弓首蛔虫的感染性2期幼虫表现出对光刺激敏感性降低的现象（存在1~5 min的延迟），推测这可能一方面与感染性2期幼虫体型过长致使活动受虫卵腔室限制有关；另一方面也可能与幼虫进入“休眠”（又称滞育）状态有关。已有研究表明，多数寄生性线虫为增加其虫卵幼虫的环境存活时间，其会主动降低物质和能量代谢，进而表现出活动力较少的现象^［18-19］。与此同时，部分研究表明，相较2期幼虫，弓首蛔虫感染性虫卵亦包含3期幼虫，但本研究并未发现2期幼虫存在卵内蜕皮或幼虫体表附“鞘”的现象，这或许受限于现有光学显微镜无法实现实时画面记录的影响，相信随着将来可实现实时画面记录寄生虫离体培养装置的研发和使用，该结论将会得到进一步确认。此外，本研究还发现，弓首蛔虫卵存在感染性2期幼虫自然孵化现象，这种虫卵自然孵化的现象也可在猪蛔虫卵体外发育观察研究中发现^［14］，所以一些研究人员认为虫卵发育全过程还应包括幼虫的孵化这一阶段^［20-21］，但该说法目前仍然存在争议。

本研究使用经伊维菌素驱虫所得犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、犊弓首蛔虫虫体子宫剖解虫卵为研究对象，有效避免了阿苯达唑等驱虫药物对虫卵后续发育的影响^［22-23］。同时本研究采用麦克马斯特计数器作为虫卵培养容器，不仅实现对同一虫卵的实时观察和记录，而且其腔室薄薄一层培养液也增加虫卵与环境氧气的接触几率，保障弓首蛔虫卵的正常发育以及所得发育数据的准确性。除此之外，本试验使用的虫卵培养液PSABS因替代传统5%福尔马林培养液，较好地规避先前实验人员因高频率观察而带来吸入福尔马林的潜在危险，因此该方法可进一步推广应用于其它寄生虫虫卵及其幼虫的实验室体外培养，为更好开展兽医寄生虫研究提供参考。

4　结论

本研究采用彩色显微图像智能识别系统对弓首属3种蛔虫卵的体外发育过程进行了全面系统的观察和描述，证实弓首蛔虫卵存在12~13个体外发育阶段；然而相较犬弓首蛔虫、犊弓首蛔虫卵，猫弓首蛔虫卵虽多出5细胞期发育阶段，但其仍是弓首属发育速度最快的虫卵，这些发现不仅丰富和完善了弓首蛔虫卵发育形态学变化的基础知识，而且为今后该人畜共患病的防控工作提供了理论依据，具有重要的公共卫生意义。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32273028)