锡兰钩虫ASP4基因的表达与免疫保护效果分析

Expression of ASP4 gene in Ancylostoma ceylanicum and immunprotective effect analysis of recombinant protien

摘要

为克隆锡兰钩虫ASP4基因（Ace-ASP4），评估其重组蛋白在小鼠体内诱导的免疫保护效果，先扩增Ace-ASP4基因序列，并对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析，并原核表达ASP4蛋白。将重组蛋白免疫小鼠，然后利用CCK-8法和间接ELISA方法分别检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力和血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。同时检测首免后小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和L-10水平。最后，在三免后14 d经口感染500条L3幼虫，48 h后检测肺、胃肠道和肌肉的虫体数量，计算减虫率，以评估其免疫保护效果。结果表明：1）Ace-ASP4基因的ORF全长为750 bp，编码249个氨基酸。生物信息学分析显示，Ace-ASP4编码蛋白为亲水性蛋白，具有信号肽序列且无跨膜结构，其三维结构模型质量良好（GMQE值为0.9）。2）Ace-ASP4蛋白分子大小为27 ku，在上清和沉淀中均有表达，但主要以包涵体形式富集于沉淀中，并具有良好的免疫反应性。3）Ace-ASP4重组蛋白可诱导免疫小鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体显著上升，并极显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖（P<0.01）。与PBS对照组相比，在首免后第35 天用Ace-ASP4重组蛋白免疫小鼠后其体内的IFN-γ、IL-2、IL-4和L-10显著升高（P<0.05）。4） 攻虫后，与PBS对照组小鼠相比，50 μg/mL重组蛋白免疫小鼠在肺中获得了52%的减虫率，在胃肠道中获得了46%的减虫率，在肌肉中获得了61%的减虫率。综上，本研究成功克隆表达了Ace-ASP4蛋白，Ace-ASP4蛋白能使免疫小鼠产生抗体，促进其脾淋巴细胞增殖等，为进一步研究ASP4基因的生物学功能奠定基础，也为研制锡兰钩虫疫苗提供参考数据。

Abstract

To clone the ASP4 gene fromAncylostoma ceylanicum（Ace-ASP4） and evaluate the immune protective effect induced by its reconbinant protein in mice， the ASP4 gene sequence was firstly amplified， and the amino acid sequence of its enconded protein was subjected to bioinformatics analysis. The recombinat protein was then expressed in prokaryotic cells to immunize mice. The proliferatin abilitily of mouse spleen lymphocyte proliferation ability and serum IgG， IgG1 and IgG2a antibody levels were detected using CCK-8 and indirect ELISA methods， respectively. In addition， the levels of IFN-γ， IL-2， IL-4 and IL-10 in the serum of mice after the first immunization were also detected. Finally， after three immunizations， the L3 larvae were orally infected at 500 larvae per mouse 48 h later. The number of larvae in the lungs， gastrointestinal tract， and muscles were counted 48 h post-infection， and the reduction rate was calculated to evaluate its immunoprotective effect. The results showed that： 1） The ORF of Ace-ASP4 gene was 750 bp long， encoding 249 amino acids. Bioinformatics analysis showed that Ace-ASP4 encoded a hydrophilic protein with a signal peptide sequence and no transmembrane structure， and its three-dimensional structure model had a good quality with a GMQE value of 0.9. 2） The molecular weight of Ace-ASP4 protein was 27 ku， and it could be expressed both in the supernatant and precipitate， but mainly enriched in the formed of inclusion bodies in the precipitate and had good immunoreactivity. 3） The Ace-ASP4 recombinant protein can induce significant increase of IgG， IgG1 and IgG2a antibodies in immunized mice and promote the proliferation of spleen lymphocytes in immunized mice （P<0.001）. Compared with the PBS control group， levels of IFN-γ， IL-2， IL-4 and IL-10 in mice immunized with Ace-ASP4 recombinant protein on the 35^th day after the first immunization were significantly increased （P<0.05）. 4） After challenge， compared with mice immunized with PBS， mice immunized with 50 μg/mL of recombinant protein achieved a 52% reduction rate in the lungs， a 46% reduction rate in the gastrointestinal tract， and a 61% reduction rate in the muscles. In conclusion， Ace-ASP4 protein was successfully expressed， and can induce strong immune response in immunized mice， which lays a foundation for further study of the biological function of ASP4 gene and provides reference data for the development of A.ceylanicum vaccine.

Graphical abstract

关键词

锡兰钩虫 / ASP4基因 / 原核表达 / 免疫保护效果分析

Key words

Ancylostoma ceylanicum / ASP4 gene / prokaryotic expression / immune protection effect

‍基金项目： 广东省自然科学基金项目（2023A1515011795）；国家自然科学基金项目（31972707）；广东省林业科学院项目（2023CG171）

钩虫是一种寄生于人和犬、猫等动物肠道中的土源性寄生蠕虫。人类感染钩虫的主要方式是通过直接接触感染性幼虫，或摄入被感染性幼虫污染的食物和水^［1］。钩虫病是一种广泛流行但常被忽视的肠道寄生虫病，虽然其致死率较低，但能够给某些贫困地区及国家带来严重的公共安全问题和经济损失^［2］。钩虫成虫可在宿主的小肠内存活多年，并在小肠中吸血液。当宿主肠道内出现大量成虫时，可能会导致个体出现缺铁性贫血。锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）是一种通过土壤传播的人畜共患寄生虫，主要感染犬猫并可通过犬猫传播至人类，并能在人体内发育为成虫。锡兰钩虫被认为是亚太地区感染人类的第二大常见钩虫，其感染病例占总钩虫感染病例的6%~23%^［3-4］。多项研究表明，锡兰钩虫已在中国、泰国和老挝等地的人类和家畜之间传播，并且在犬猫等伴侣动物中尤为流行。据文献报道，在泰国和老挝家养和社区饲养的狗和猫中，其阳性率分别为53%~92%和69%；而在中国广州的流浪猫中阳性率则为20.4%^［5-8］。这些数据均揭示了锡兰钩虫感染人类的潜在风险。目前，钩虫病的防治主要依赖于定期服用驱虫药，然而长期使用驱虫药会导致钩虫产生耐药性，进而降低药物治疗效果^［9］。此外，钩虫对于宿主的重复感染也会使药物的效果受到影响。因此，开发钩虫疫苗已逐渐成为控制钩虫感染的重点。但目前尚未有针对该病的有效疫苗，仍需持续深入研究，以找到更有效的疫苗候选分子，从而实现对锡兰钩虫病的防控。

钩虫分泌蛋白是幼虫激活过程中分泌的主要蛋白，在钩虫生长发育过程中起关键作用^［10］。研究表明，激活相关蛋白（Activation-associated proteins）在钩虫入侵宿主、通过组织迁移、附着在肠壁和取血过程中有免疫调节功能。到目前为止，在已经被鉴定出的3种由钩虫L3释放的分子中，有2种属于钩虫分泌蛋白的多肽家族，分别是ASP1和ASP2。研究表明，用明矾沉淀的rAc-ASP1免疫小鼠，能使免疫小鼠对L3期幼虫的感染产生部分保护效果，可降低免疫小鼠50%~80%的荷虫量^［11］。研究表明，ASP蛋白具有良好的疫苗抗原潜力。Loukas等^［12］研究表明，使用Quil A配制的rAce-ASP2免疫仓鼠可显著减少肠道荷虫量和缩小钩虫体型，而rAce-ASP1未显示保护作用。Sen等^［13］通过犬钩虫同源ASP1和ASP2蛋白进行疫苗接种试验，发现明矾沉淀的rAc-ASP1能显著降低免疫小鼠肺部钩虫荷虫量。此外，使用其他钩虫物种表达的ASP1同系物在小鼠中也能产生交叉保护作用。虽然Siwińska等^［14］和Wiśniewski等^［15］报道了锡兰钩虫ASP4的cDNA的克隆和特性，并且对ASP4及其相关基因家族进行了序列比对分析，但该基因表达蛋白生物学功能尚未被研究。基于此，本研究克隆了锡兰钩虫Ace-ASP4基因，并对其编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析，并对Ace-ASP4蛋白免疫原性及免疫保护效果进行分析，为进一步研究该蛋白的生物学功能及作为钩虫疫苗候选分子的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　虫体及菌株

锡兰钩虫3期幼虫（L3幼虫）从犬粪便中分离所得，成虫通过L3幼虫人工感染仓鼠后获得。将经鉴定的锡兰钩虫虫体置于RNA样品保存液中，于-80 ℃保存备用。大肠杆菌DH5α、BL21，表达质粒pET-28a均由华南农业大学寄生虫教研室保存。

1.1.2　主要试剂

限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ为TaKaRa公司产品；弗氏佐剂为上海Sangon生物工程公司产品；胎牛血清、刀豆蛋白、RPMI 1640培养基、细胞筛均购自广州市凯阁生物科技有限公司；改良BCA 蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒、兔抗犬IgG1-HRP、兔抗鼠IgG1-HPR和鼠His标签单克隆抗体（MAb）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。小鼠IFN-γ ELISA试剂盒、小鼠 IL-2 ELISA试剂盒、小鼠IL-4 ELISA试剂盒、小鼠IL-10 ELISA试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司。

1.2　试验方法

1.2.1　总RNA的提取与反转录

参照Trizol（Invitrogen）方法提取锡兰钩虫成虫的总RNA，用分光光度计检测总RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖变性电泳确保RNA的完整性。按照TaKaRa RNA PCR Kit 3.0试剂盒的说明书合成cDNA第一链。

1.2.2　 Ace-ASP4基因的扩增与测序

根据GenBank收录的锡兰钩虫Ace-ASP4基因序列（AY423766.1）设计特异性引物，ASP4-F：5'- CGGGATCCATGGCTGGACCAAGCTGCG-3'；ASP4-R：3'-CCAAGCTTTGGTTTTAGACACACAATC-5'。以合成的cDNA第一链为模板，ASP4-F和ASP4-R为引物，经PCR扩增Ace-ASP4基因，反应条件为：94 ℃ 5 min；92 ℃ 30 s、59 ℃ 1 min、72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃ 10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物正确后回收目的片段。对纯化回收的目的基因PCR产物和pET-28a，使用BamHI和HindIII进行双酶切，经T4连接酶连接，构建重组质粒pET-28a-Ace-ASP4，并经双酶切鉴定，阳性克隆由生工生物（上海）有限公司测序。

1.2.3　 Ace-ASP4编码蛋白的生物信息学

利用在线软件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析该蛋白的分子量大小、氨基酸组成、等电点（PI）等性质；分别利用在线软件SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP/）、TMHMMServer2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（http：//web. expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）对该蛋白的信号肽序列、跨膜结构域与疏/亲水性进行分析；利用SWISS-MODEL预测软件（http：//swissmodel.expasy.org/）预测并构建该蛋白的三维结构模型。

1.2.4　Ace-ASP4蛋白在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及鉴定

将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，构建重组表达菌。将pET-28a-ASP4重组表达菌在氨苄青霉素抗性的LB培养基中于37 ℃进行培养，当OD₆₀₀达到0.6时，添加终浓度1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃，140 r/min 振荡培养8 h。收集菌体，经PBS重悬、超声破碎后，取上清和沉淀通过SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。将离心收集的包涵体置于8 mol/L尿素溶液中溶解过夜，以去除杂蛋白。在变性条件下，利用Ni-NTA His Bind Resin层析柱纯化重组蛋白，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度。对纯化的Ace-ASP4蛋白用鼠抗His标记单克隆抗体（1∶6 000）作为一抗，兔抗鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，经Western blot进一步分析其纯化效果。

1.2.5　Ace-ASP4的反应原性分析

经锡兰钩虫感染犬和健康犬前肢静脉采血，分离血清。以感染犬血清（1∶5 000）和健康犬血清 （1∶5 000）为一抗，兔抗犬IgG1-HRP（1∶20 000）为二抗，通过Western blot分析Ace-ASP4的反应原性。

1.2.6　小鼠的分组、免疫和攻虫

将36只6~8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为3组：Ace-ASP4 （25 μg/mL） 组、Ace-ASP4 （50 μg/mL）组和PBS对照组，每组12只。首免时分别与弗氏完全佐剂1∶1混合，二免和三免时以弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂，间隔为7 d。试验组小鼠在每次免疫后眼眶静脉丛采血，收集血清，在第35天（第3次免疫后的第3周）进行最后一次采血。

在第35天（第3次免疫后的第3周），将试验小鼠进行眼眶静脉丛采血，随后对Ace-ASP4 （50 μg/mL）免疫组和PBS对照组的9只小鼠分别经口感染500条L3锡兰钩虫，48 h后将所有小鼠断颈处死，分别检测肺、胃肠道和肌肉的减虫率。

1.2.7　免疫鼠脾淋巴细胞增殖试验

末次采血后，将3组中的3只小鼠进行脱颈处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×10⁵个/mL。于96孔细胞培养板中培养细胞，每孔加入50 μL淋巴细胞悬液。阴性对照组的小鼠脾淋巴细胞，使用PBS缓冲液作为刺激物。阳性对照组的小鼠脾淋巴细胞，使用刀豆蛋白（ConA蛋白，10 μg/mL）作为刺激物。试验组使用Ace-ASP4（10 μg/mL）蛋白作为刺激物。每组试验设置3个平行。分别置于37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h，使用CCK-8反应增强液再培养1 h，最后用酶标仪检测OD₄₅₀处读数。

1.2.8　总IgG、IgG1和IgG2a水平的检测

每组小鼠分别于第1次免疫后（0 d），第2次免疫后（7 d）、第3次免疫后（14 d）及第3次免疫后两周（35 d），眼眶静脉丛采血，收集血清。用间接ELISA法检测Ace-ASP4 （25 μg/mL） 组、Ace-ASP4 （50 μg/mL）组、PBS对照组小鼠的血清总IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平。

1.2.9　ELISA小鼠体内细胞因子检测

每组小鼠第0 天和第35 天眼眶静脉丛采血，在收集血清后使用ELISA试剂盒检测3组小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。

1.2.10　测定肺、胃肠道和肌肉减虫率

在L3幼虫感染48 h后断颈处死小鼠（Ace-ASP4 （50 μg/mL）免疫组和PBS对照组），收集小鼠肺、胃肠道和肌肉的虫体并计数，计算减虫率。

肺脏荷虫量：通过切除其肺和气管。将每个肺在含有10~15 mL RPMI 1640 的培养皿中用剪刀切碎，并在37 °C下震荡1~2 h后，在10倍放大倍数下对幼虫进行计数。

胃肠道荷虫量：通过用剪刀对胃肠道进行机械剪切，然后用含0.5%胃蛋白酶和0.7%HCl的PBS进行化学消化，并在37 ℃下持续振荡2 h。将消化的胃肠道放入贝尔曼装置中6 h回收L3，然后进行计数。

肌肉荷虫量：其收集方式和胃肠道收集虫体方式相同，但主要是从小鼠骨骼肌中回收。

［减虫率=（1-免疫组平均虫荷数/对照组平均虫荷数）×100%］

1.2.11　统计分析

GraphPad Prism 8软件用于对收集的数据进行统计学处理及分析，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。采用t检验对不同组别小鼠之间的抗体水平、淋巴细胞平均刺激指数和细胞因子水平进行两两比较。

2　结果与分析

2.1　 Ace-ASP4基因的PCR扩增

以锡兰钩虫的cDNA作为模板，通过PCR扩增得到了全长为750 bp（约800 bp）的Ace-ASP4基因序列，其大小与预期目的片段相符（图1）。

2.2　 Ace-ASP4基因编码蛋白的生物信息学分析

根据Prot-Param软件分析，该蛋白的分子式为C₁₁₆₄H₁₈₂₈N₃₀₄O₃₉₀S₂₂，分子质量为27 ku，理论等电点pI为4.72。锡兰钩虫ASP4蛋白由20种常见氨基酸组成，其中丙氨酸含量最高（10.8%），精氨酸、组氨酸和色氨酸含量最低（0.8%）；负电荷残基（Asp＋Glu）为34个，正电荷残基（Arg＋Lys）为24个（表1）。Ace-ASP4蛋白的总平均疏水系数为-0.402，推测其为亲水性蛋白（图2（a））。根据图2（b）和图2（c）显示，该蛋白有信号肽序列，但不含跨膜结构域；其三维结构模型结果显示（图2（d）），且该蛋白以单体形式存在。Ace-ASP4编码的蛋白的全球性模型质量估值（GMQE值）为0.9，质量良好。

2.3　Ace-ASP4蛋白的表达、纯化及Western blot鉴定

将重组质粒pET-28a-ASP4转化到大肠杆菌BL21（DE3）后对其进行诱导表达，并经Ni-NTA亲和层析法纯化。对诱导前后的菌液进行超声破碎，将破碎后的沉淀和上清经10% SDS-PAGE检测，结果显示：pET-28a-ASP4菌诱导后在27 ku处出现特征蛋白带，与预期相符，且该蛋白在上清和沉淀中均有表达，但主要在沉淀中以包涵体形式存在（图3（a））。

Western blot结果显示，该重组蛋白能被鼠抗His标记单克隆抗体识别，在27 ku有特异性条带（图3（b））。该蛋白能被锡兰钩虫阳性犬的血清所特异性识别（图3（c）），与健康犬血清反应未出现特异性条带。上述结果表明，锡兰钩虫重组蛋白Ace-ASP4具有良好的反应原性。

2.4　小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力分析

免疫小鼠淋巴细胞增殖试验结果显示：用rAce-ASP4蛋白对小鼠进行免疫后，淋巴细胞平均刺激指数较对照组显著升高（P<0.01），促进了小鼠脾淋巴细胞的增殖（图4）。

2.6　小鼠血清中抗体水平的检测

用间接ELISA法检测3组BALB/c小鼠免疫后血清中总 IgG、IgG1和IgG2a 的水平。结果显示，与PBS组相比，用重组蛋白免疫小鼠后，小鼠体内IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均在第7天之后显著升高（P<0.05）（图5（a）~5（c））。与25 μg/mL剂量组别相比，50 μg/mL的重组蛋白剂量组别在第7天和14天能够在小鼠体内产生更高的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平（P<0.05）。在第35 天，与25 μg/mL剂量组别相比，50 μg/mL重组蛋白剂量组免疫小鼠能够引起小鼠体内产生更高的IgG和IgG1抗体水平（P<0.01）；但两者之间产生的IgG2a抗体水平无显著差异（P>0.05）。

2.7　ELISA检测小鼠体内细胞因子变化

用Ace-ASP4重组蛋白免疫小鼠后，血清中Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2，Th2型细胞因子IL-4和L-10水平的变化如图7所示。在第0天，重组蛋白免疫组与PBS对照组相比，小鼠体内产生的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平均无显著差异（P>0.05）（图6（a））。在第35 天，与PBS对照组相比，用rAce-ASP4重组蛋白免疫小鼠后其体内的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10显著升高（P<0.05）（图6（b））。

2.8　rAce-ASP4在小鼠体内诱导的免疫保护效果分析

由表2可知，PBS对照组肺平均虫体数是（55.42±6.39）条/鼠，胃肠道平均虫体数是（58.50±5.90）条/鼠，肌肉平均虫体数是（50.92±6.46）条/鼠。与PBS对照组小鼠相比，50 μg/mL重组蛋白免疫小鼠在肺中获得52%的减虫率，差异不显著（P>0.05），在胃肠道和肌肉中分别获得46%和61%的减虫率（P<0.05）的减虫率。

3　讨　论

钩虫是一种土源性蠕虫（Soil-transmitted helminthiasi），是最易被忽视的人兽共患寄生虫之一^［16］。钩虫病的慢性感染会导致宿主发生腹痛、腹泻、食欲不振、体重减轻和缺铁性贫血等症，对人类以及猫和狗等伴侣动物的健康构成潜在的威胁^［17］。近年来，人们越来越关注基于病原体、病原体-宿主相互作用以及分子和免疫学水平对钩虫疾病的了解，开发新的控制钩虫疾病的方法。寄生虫外表面的分子和排泄/分泌（ES）产物是蠕虫的重要分子^［18］。ES产物是寄生虫通过口腔或外表面分泌的蛋白质、脂质和碳水化合物的混合物，是蠕虫与其宿主之间交互的主要界面。钩虫的ES产物包含多种结构和功能不同的分子，这些分子能与宿主蛋白反应，在寄生虫的生存、发育以及宿主-寄生虫关系中发挥重要作用^［19］。同时，它们在虫体对宿主的渗透、组织迁移、营养、繁殖和逃避宿主免疫等功能中至关重要。这些分子通过抑制炎症反应、促进效应细胞凋亡和扭曲免疫反应表型，帮助寄生虫存活并逃避宿主免疫反应^［20］。

目前，许多钩虫的ES产物已被证明是有效的钩虫候选疫苗^［21］。从犬钩虫的排泄/分泌（ES）产物中已识别出6种激活相关蛋白（ASP-1至ASP-6）^［22-24］。这些钩虫分泌蛋白在寄生虫的宿主选择性、生长发育、入侵与锚定、营养获取、改造宿主环境和免疫逃避中都发挥重要作用^［25］。ASP4主要由幼虫或成虫在感染初期分泌，虽然其详细的生物学功能尚未完全明了，但研究表明它可能对调节宿主的免疫反应具有重要作用。最近的研究证实，犬钩虫ASP4定位于成虫钩虫的角质层表面^［24］，这表明它可能在钩虫的皮肤入侵和局部免疫调节中起作用。然而，针对ASP4在锡兰钩虫中的位置和功能，还需要进一步研究来揭示其在宿主-寄生虫相互作用中的具体机制。

本研究间接ELISA结果显示，Ace-ASP4能诱导小鼠体内的IgG抗体水平显著升高，且随着免疫次数增加，IgG抗体水平呈上升趋势，推测Ace-ASP4在小鼠体内诱导产生的高水平IgG抗体可能与其诱导的免疫保护效果有关。与25 μg/mL剂量组相比，50 μg/mL剂量的Ace-ASP4能显著提升小鼠体内的IgG抗体水平。这一发现提示，在本研究测试的2个剂量下，更高剂量的Ace-ASP4可能更有效地促进了IgG的产生，这一趋势的普遍性和剂量-反应关系的确定还需要通过进一步的研究来验证。有研究表明IgG2a主要激活Th1型辅助细胞，而IgG1主要促进Th0前体细胞向Th2细胞转化^［26］。本研究结果显示，仅在50 μg/mL重组蛋白的剂量下，小鼠在第14天和35天体内产生IgG1水平显著高于IgG2a。因此，我们推测Ace-ASP4可能诱发小鼠产生以Th2型为主、抗锡兰钩虫感染的Th1/Th2混合型免疫应答。此外，不同的免疫剂量可能会影响抗体亚型的产生，进而影响Th1和Th2平衡。于是，在本研究中，对各组别小鼠在第0 天和第35 天，对其血清中的Th1型细胞因子和Th2型细胞因子进行ELISA检测。结果显示，不同浓度的Ace-ASP4重组蛋白能引起小鼠体内的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平显著升高，且Th2型细胞因子的上升趋势更为显著。本研究结果证明Ace-ASP4诱发小鼠产生以Th2型为主的免疫应答。

对于未来的研究方向，考虑到不同动物模型可能对免疫原性有不同反应，建议采用多种动物模型进行测试，以更全面地评估Ace-ASP4的免疫效果和安全性。此外，探索不同的联合免疫策略，如结合使用免疫佐剂或其他钩虫特异性蛋白，可能会进一步增强免疫效果并提高疫苗的实用性。此外，长期免疫保护的评估对于疫苗研发至关重要。未来研究应关注免疫后数月甚至数年的抗体持续性和记忆免疫细胞的功能。此外，考虑不同的免疫途径，例如黏膜给药，可能有助于优化免疫反应和应答的局部化，这对于肠道寄生虫感染尤其重要。

4　结　论

本研究克隆了锡兰钩虫Ace-ASP4基因，对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析后，诱导表达并纯化了Ace-ASP4，对其免疫学特性进行了初步分析，以ASP4蛋白进行小鼠抗锡兰钩虫免疫保护试验，结果表明ASP4重组抗原在小鼠体内诱导产生了一定的免疫保护效果，肺、胃肠道和肌肉减虫率均达到了45%以上，为钩虫病的血清学诊断及钩虫疫苗候选分子的筛选与功能学等研究奠定了基础。

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基金资助

广东省自然科学基金项目（2023A1515011795）; 国家自然科学基金项目（31972707）; 广东省林业科学院项目（2023CG171）