趋化因子受体CXCR3在狂犬病病毒感染中的作用研究

The role of chemokine receptor CXCR3 in rabies virus infection

摘要

为分析CXC趋化因子受体3（CXC chemokine receptor 3， CXCR3）在狂犬病病毒（Rabies virus， RABV）感染中发挥的作用，首先将RABV强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别滴鼻感染小鼠，以实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）检测不同时间点RABV感染的小鼠脑内CXCR3相关配体的转录水平，以及蛋白质印迹法（Western blot）检测CXCR3的蛋白表达水平；此外，将C57BL/6小鼠和CXCR3^-/- 小鼠分别滴鼻感染RABV街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury，检测小鼠血清中和抗体水平及记录临床表现，同时以qPCR检测鼠脑白细胞分化抗原、细胞因子和RABV基因组等的转录水平。结果表明：1）感染强毒株CVS-11可极显著提高鼠脑趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的转录水平（P<0.000 1）。2）与强毒株CVS-11相比，感染弱毒株HEP-Flury可显著提高鼠脑CXCR3蛋白表达水平（P<0.000 1）。3）敲除CXCR3对小鼠血清中和抗体的产生、存活率、体重和临床症状影响差异均不显著（P>0.05），但显著增加了弱毒株HEP-Flury感染后第9天鼠脑内的病毒载量（P<0.05）。4）敲除CXCR3对感染RABV后鼠脑的CD4、IL-2和IL-6的转录水平有显著的调节作用（P<0.01），但对鼠脑中CD8、IFN-γ和IgG κ-L chain转录水平的影响差异不显著（P>0.05）。综上，趋化因子受体CXCR3通过调控鼠脑免疫应答，即CD4、IL-2和IL-6的表达以抵抗RABV感染，但其不是唯一的决定因素。本研究为预防和治疗狂犬病提供理论基础。

Abstract

In order to analyze the role of CXC chemokine receptor 3（CXCR3） in rabies virus （RABV） infection，RABV virulent strain CVS-11 and attenuated strain HEP-Flury were intranasally infected mice， and the transcription levels of ligands of CXCR3 in the brains of RABV-infected mice collected at different time points were detected by real-time quantitative PCR（qPCR）， and the protein expression level of CXCR3 was detected by western blot. In addition， C57BL/6 mice and CXCR3^-/- mice were infected with RABV street strain GD-SH-01， virulent strain CVS-11 and attenuated strain HEP-Flury， respectively， and the RABV neutralizing antibody in the peripheral blood and clinical manifestations of each group of mice were monitored. At the same time， the transcription levels of some cluster of differentiation （CD） macromolecules， cytokines and RABV genome were detected by qPCR. The results showed as follows： 1） Infection with virulent strain CVS-11 could extremely significantly increase the transcription levels of CXCL9， CXCL10 and CXCL11 in brain tissue of mice （P<0.000 1）. 2） Compared with the virulent strain CVS-11， infection with attenuated strain HEP-Flury could significantly increase the expression level of CXCR3 in brain tissue of mice（P<0.000 1）. 3） CXCR3 knockout had no significant effects on the production of RABV neutralizing antibody， survival， body weight change and clinical symptoms of mice （P>0.05）， but the viral load in the brain tissue of mice on the 9th day after HEP-Flury infection was significantly increased （P<0.05）. 4） CXCR3 knockout significantly regulated the transcription levels of some cytokines such as CD4， IL-2 and IL-6 in brain tissue of RABV-infected mice（P<0.01）， but had no significant influence on the transcription levels of CD8， IFN-γ and IgG κ-L chain （P>0.05）. In conclusion， CXCR3 had effect on the resistance to RABV infection by regulating immune response in brain tissue of mice， namely the expression of CD4， IL-2 and IL-6， but might not play a decisive role. This study lays the foundation for the prevention and treatment to rabies.

Graphical abstract

关键词

狂犬病病毒 / CXC趋化因子受体3 / 致病机理

Key words

rabies virus / CXC chemokine receptor 3 / pathogenesis

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus， RABV）引起的一种嗜神经性人兽共患传染病，目前依然是我国乃至全球公众健康的重大威胁。狂犬病目前尚无特效治疗药物，人感染RABV后一旦出现临床症状，几乎100%死亡^［1］。病毒感染机体后，免疫应答启动，通过早期的先天性免疫和后期的获得性免疫清除感染的病毒。然而，RABV感染机体后，逆神经轴突进入脑组织，但由于血脑屏障的防护作用，外周免疫因子、免疫细胞和特异性抗体无法进入脑组织，致使RABV在中枢神经系统大量复制，最终导致死亡。研究证实，RABV弱毒株感染机体后，于CNS中诱导产生大量趋化因子，进而导致血脑屏障的通透性增强，外周的免疫因子和免疫细胞进入CNS，清除感染的RABV^［2-4］。然而，街毒株在感染前期和中期无法诱导CNS产生趋化因子，血脑屏障无法打开，故免疫因子和免疫细胞不能进入CNS，最终机体因RABV的大量复制引起严重的神经炎症而发病死亡，其中的具体机制尚不明晰。

趋化因子受体CXCR3是CXC趋化因子受体家族中的G蛋白偶联受体，又称CD183，具有7个跨膜结构域，其参与免疫细胞募集和炎症反应，可能在神经系统疾病的发展中发挥关键作用^［5-6］。CXCR3受体在Th1细胞、CTL细胞、NK细胞和NKT细胞上高表达，具有多个趋化因子配体，包括CXCL4、CXCL9、CXCL10和CXCL11，这4种趋化因子仅结合于CXCR3受体；趋化因子发挥生物学功能依赖与特定的趋化因子受体结合，CXCL9、CXCL10、CXCL11/CXCR3轴主要作用于免疫细胞的迁移、分化和激活，其调控幼稚T细胞向Th1辅助细胞（Th1 cell）的分化，并使免疫细胞迁移至病灶部位^［6-8］。研究表明，小鼠肺炎病毒感染导致不同的Treg细胞亚群募集、扩增到小鼠肺部和纵隔淋巴结，从而介导免疫反应清除病毒，然而低纤维饮食可减少表达CXCR3的Treg细胞的募集，增加了小鼠下呼吸道感染的严重程度^［9］；此外，CXCR3可以显著增强CD8⁺ T细胞迁移至病灶部位的能力，进而发挥抗病毒作用，且CXCR3缺陷的小鼠在感染登革热病毒后，脑组织内的病毒载量和小鼠死亡率比未感染病毒的对照组更高^［10］。尽管病毒感染后的炎症反应对于控制病毒增殖至关重要，但一些证据表明，过度的免疫反应和侵袭性炎症反应是感染后病情恶化甚至死亡的主要原因。AMG487是一种IP-10-CXCR3拮抗剂，通过减少产生IFN-γ的CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞等淋巴细胞来减轻H1N1病毒诱导的过度的肺部炎症^［11］。总而言之，CXCR3在多种病毒感染中参与免疫细胞的迁移和浸润，介导正常或过度的免疫反应，然而CXCR3在RABV感染中是否参与免疫应答的调节，尚不清楚。

RABV的前期研究表明，与街毒株相比，弱毒株在感染前期能诱导更高水平的趋化因子，进而更有效地打开血脑屏障，使免疫因子和免疫细胞进入CNS。但是，结果同时显示感染前期弱毒株在CNS中的病毒载量显著高于街毒株（高3~4个数量级）。因此，弱毒株诱导的高水平趋化因子可能是其高病毒载量导致的^［12］。田钦^［1］通过体内转录组学研究发现，RABV强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别滴鼻感染小鼠后，鼠脑中CVS-11的病毒载量显著高于HEP-Flury（高3~4个数量级），CVS-11诱导的趋化因子水平高于HEP-Flury或者相当，然而高水平的趋化因子依然没有改变小鼠死亡的结果，同时，CVS-11组小鼠脑组织中趋化因子受体CXCR3的转录水平显著低于HEP-Flury组。此外，Callahan等^［13］于2004年通过体外血脑屏障模型试验发现，能通过血脑屏障的T（CD4）细胞表面高表达CD45RO和CXCR3，进一步研究发现，CXCR3是免疫细胞穿过血脑屏障的标志物。而在RABV感染中，小鼠血脑屏障通透性的差异是强毒株和弱毒株致病性不同的主要原因之一。

因此，为分析趋化因子受体CXCR3在RABV感染中的作用，本研究先用RABV强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury感染昆明小鼠以分析CXCR3表达水平的差异性，然后用街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别感染CXCR3敲除小鼠以进一步验证。

1　材料与方法

1.1　毒株和实验动物

RABV街毒株GD-SH-01、标准攻击强毒株CVS-11以及弱毒株HEP-Flury由华南农业大学兽医学院微生物学教研室保存。因本研究涉及RABV街毒株GD-SH-01，故所有涉及RABV活毒的相关试验均于华南农业大学动物生物安全三级实验室进行。

实验动物SPF级6~8周龄昆明小鼠购自南方医科大学实验动物中心，SPF级6~8周龄C57BL/6小鼠购自珠海百试通生物科技有限公司，B6.129P2-Cxcr3<tm1Dgen>/J基因敲除小鼠（CXCR3^-/- 小鼠）购自美国Jackson Laboratory，CXCR3^-/- 小鼠购买2雌1雄，于华南农业大学实验动物中心屏障环境中进行繁育。所有动物均在华南农业大学实验动物中心进行严格的饲养管理。动物试验由华南农业大学实验动物中心进行伦理审查及批准。

1.2　主要试剂

RPMI-1640细胞培养基及胎牛血清均购自Life Technologies公司。用于提取RNA的Trizol试剂盒购自Mangen公司。反转录试剂HiScriptII Q RT Supermix for qPCR（+gDNA wipER）、用于qPCR的试剂盒ChamQTM SYBR^® qPCR Master Mix购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技公司。相关引物均由生工生物（上海）科技有限公司合成。抗β-actin一抗购自碧云天生物技术研究所、抗CXCR3一抗购自Abcam公司。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗RABV核蛋白荧光抗体购自美国Fujirebio Inc.公司。用于中和试验的国际标准狂犬病免疫球蛋白为WHO产品。

1.3　RABV接种小鼠与脑组织的采集

用RPMI-1640培养基将3株毒株GD-SH-01、CVS-11以及HEP-Flury的TCID₅₀调整为1.0×10^-6 PFU/mL，对昆明小鼠、C57BL/6小鼠与CXCR3^-/- 小鼠进行保定与麻醉，昆明小鼠分别滴鼻感染RABV强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury，C57BL/6小鼠和CXCR3^-/- 小鼠分别滴鼻感染RABV街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury，每只小鼠滴鼻接种的病毒量为30 µL，同时设置空白对照，即滴鼻等量的RPMI-1640培养基，GD-SH-01、CVS-11以及HEP-Flury感染组各设置9只小鼠。

于感染后第3天、第6天以及第9天，从3个感染组中各取3只小鼠进行心脏灌流。灌流结束后，无菌取出鼠脑，置于1.5 mL离心管中，置于冰上或4 ℃暂存。

1.4　RABV感染后小鼠脑组织转录因子、白细胞分化抗原以及细胞因子等的测定

将RABV强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别滴鼻感染昆明小鼠，将RABV街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别滴鼻感染C57BL/6小鼠和CXCR3^-/- 小鼠，在感染后第3天、第6天和第9天收集小鼠的脑组织，将采集的鼠脑加入Trizol，并用电动组织研磨器研磨均匀，提取总RNA，反转录成cDNA。参照ChamQTMSYBR^® qPCR Master Mix荧光定量试剂盒说明书，以qPCR检测RABV感染的昆明小鼠脑内CXCR3相关配体CXCL9、CXCL10和CXCL11的转录水平，以qPCR检测RABV感染的C57BL/6小鼠和CXCR3^-/- 小鼠脑内白细胞分化抗原CD4和CD8，IL-2、IL-6和IFN-γ等细胞因子以及IgG К-L chain和RABV基因组的转录水平。所用引物信息如表1所示，RABV genome的qPCR引物基于RABV先导RNA序列设计。

1.5　Western blot检测RABV感染对小鼠脑组织CXCR3表达的影响

将采集的昆明小鼠鼠脑加入配置好的蛋白裂解液，并用电动组织研磨器研磨均匀，提取总蛋白，超声5 s，100 ℃金属浴10 min后10 000 r/min离心5 min，取上清进行SDS-PAGE电泳，转膜。使用5%脱脂牛奶将PVDF膜37 ℃封闭1 h后，用PBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，再分别孵育抗CXCR3一抗和抗β-actin一抗过夜。次日，用PBST清洗PVDF膜3次，然后37 ℃孵育二抗1~2 h，再次用PBST清洗PVDF膜3次，随后将PVDF膜置于蛋白成像系统并使用ECL发光液进行曝光。最后，利用Image J软件对Western blot图像进行灰度值分析。

1.6　感染RABV小鼠临床症状、死亡率及体重监测

按照材料与方法1.3对C57BL/6小鼠与CXCR3^-/- 小鼠进行滴鼻攻毒，每天监测其发病、死亡和体重变化情况，持续21 d。发病小鼠会出现体重下降、精神沉郁、反应迟钝、怂毛、瘫痪等临床症状。将各种可能出现的临床症状进行赋分^［14］：其中无临床症状记为0分，厌食、竖毛和精神沉郁等前驱症状记为1分，兴奋狂躁或运动失调等初期症状记为2分，麻痹或抽搐等记为3分，瘫痪或昏迷等后期症状记为4分，死亡记为5分。利用Excel绘制小鼠存活曲线，体重变化曲线以及临床症状变化曲线。

1.7　感染RABV小鼠血清中和抗体的检测

将RABV街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别滴鼻感染C57BL/6小鼠和CXCR3^-/- 小鼠，于感染后第14天和第21天检测小鼠血清中和抗体水平。因感染GD-SH-01和CVS-11的小鼠均于第一个检测时间点前发病、死亡，故于检测时间点仅采集了感染HEP-Flury的C57BL/6小鼠与CXCR3^-/- 小鼠的外周血。通过眼眶静脉丛采血后，将血液样本置于37 ℃ 1 h，然后于4℃静置过夜。随后1 500 r/min离心10 min，取血清于56 ℃水浴30 min灭活补体，随后参照WHO的RABV中和试验标准操作流程检测小鼠血清RABV中和抗体水平。

1.8　数据分析

使用GraphPad Prism 8.0.1软件，采用双因素方差分析法进行数据分析（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1）。

2　结果与分析

2.1　感染不同致病性的RABV对小鼠脑组织趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11转录水平的影响

qPCR结果显示，RABV感染后的第6天和第9天，CVS-11感染组的小鼠脑组织中趋化因子受体CXCR3的配体CXCL9（图1（a））、CXCL10（图1（b））和CXCL11（图1（c））的转录水平均显著高于HEP-Flury感染组（P<0.000 1），并且在感染的前中期有明显的上升趋势，而在中后期有所下降（图1）。结果表明，RABV强毒株CVS-11可以诱导比弱毒株HEP-Flury更高的趋化因子转录水平。

2.2　感染不同致病性的RABV对小鼠脑组织CXCR3表达水平的影响

趋化因子发挥作用需要与趋化因子受体结合，本试验检测了趋化因子受体CXCR3在RABV感染后的表达水平。Western blot结果显示（图2），在感染后第3天、第6天和第9天，HEP-Flury感染组的小鼠脑组织中趋化因子受体CXCR3蛋白表达水平均高于CVS-11感染组和对照组，即于感染后，与强毒株CVS-11相比，弱毒株HEP-Flury可以诱导小鼠脑组织表达更高水平的CXCR3，差异极显著（P<0.000 1）。

2.3　 CXCR3敲除对RABV致病性的影响

为进一步探究CXCR3对RABV致病性的影响，RABV街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11以及弱毒株HEP-Flury分别通过滴鼻途径感染C57BL/6小鼠与CXCR3^-/- 小鼠，每天监测小鼠发病、死亡和体重变化情况，持续21 d。如图所示，两组小鼠的存活率（图3）、体重变化率（图4）以及临床症状评分（图5）均差异不显著（P>0.05）。

2.4　 CXCR3敲除对感染RABV小鼠血清中和抗体的影响

研究表明，若外周血中和抗体水平大于或等于0.5 IU/mL，则可及时清除感染的RABV而起到保护作用。RABV感染小鼠后，GD-SH-01感染组和CVS-11感染组均于感染后第10~12天死亡，在这两组小鼠濒临死亡时采集外周血，检测发现该两组小鼠均无产生或只产生极低水平的中和抗体（<0.5 IU/mL）。对于HEP-Flury感染组，于感染后第14天，C57BL/6组有4只小鼠产生不足0.5 IU/mL的中和抗体，而CXCR3^-/- 组有3只小鼠没有产生或只产生极低水平的中和抗体（<0.5 IU/mL）。与第14天相比，HEP-Flury感染组所有小鼠于感染后第21天的中和抗体水平均有所提高（图6）。结果表明，CXCR3敲除对感染GD-SH-01、CVS-11和HEP-Flury小鼠血清中和抗体的影响不显著（P>0.05）。

2.5　 CXCR3敲除对感染RABV小鼠脑组织白细胞分化抗原和细胞因子等的转录水平的影响

如图7所示，GD-SH-01感染小鼠后，不同时间点CXCR3^-/- 小鼠和C57BL/6小鼠脑组织中病毒载量差异不显著（P>0.05），而CXCR3^-/- 小鼠的CD4（P<0.01）和IL-6（P<0.01）转录水平分别在感染中前期和感染后期显著低于C57BL/6小鼠；与C57BL/6小鼠相比，HEP-Flury感染CXCR3^-/- 小鼠后第9天，脑组织的病毒载量显著增加（P<0.05），而CXCR3^-/- 小鼠的IL-2转录水平在感染中期显著低于C57BL/6小鼠（P<0.01）。结果表明，敲除CXCR3对感染RABV后小鼠脑组织CD8、IFN-γ、IgG κ-L chain转录水平的影响差异不显著（P>0.05），但对CD4、IL-2和IL-6的转录水平有显著的调节作用（P<0.01）。

3　讨　论

狂犬病是由RABV引起的一种嗜神经性、烈性人兽共患传染病，致死率高达100%，尚无有效的治疗药物。RABV有很长的研究历史，但对于狂犬病具体的发病机制仍不完全清楚，其中RABV强毒株和弱毒株感染人和动物后，致病性差异显著，但人们对此认知有限。研究表明，相较于强毒株，弱毒株感染能更快地激活机体的固有免疫应答，且能提高血脑屏障的通透性，使免疫细胞和某些免疫大分子更快进入CNS清除病毒，而这其中的机制尚不明晰。趋化因子受体CXCR3具有调节免疫细胞浸润的功能，并且是免疫细胞穿过血脑屏障的标志物^［13］，但它在RABV感染中发挥的功能尚不清楚。

本研究通过对RABV强、弱毒株感染小鼠后脑组织趋化因子受体CXCR3及其配体表达进行检测，发现强毒株CVS-11能诱导更高的趋化因子转录水平，这与之前的研究中RABV固定毒能诱导神经元合成分泌大量细胞因子与趋化因子的结果相一致^［15］，但也可能是感染CVS-11小鼠脑内病毒载量更高所致^［12］；而HEP-Flury能诱导更高的趋化因子受体CXCR3蛋白表达，尤其在感染的前期，HEP-Flury诱导的CXCR3蛋白表达比对照组高3倍以上。研究表明，RABV街毒株感染机体后，抑制了趋化因子产生，这可能是导致机体无法清除病毒的因素之一^［12］。本研究中，RABV固定强毒株能诱导高水平的趋化因子，但并不能在RABV感染过程中发挥理想的保护作用，这可能与过度表达的趋化因子会引起严重的炎症和损伤神经元相关^［16］。然而，致病性RABV和非致病性RABV在感染小鼠后CNS诱导不同水平的趋化因子受体CXCR3。

研究表明，CXCR3可以调节免疫细胞浸润CNS以及影响血脑屏障通透性^{［10， 13］}。为分析CXCR3在RABV感染中对免疫应答的调节作用，本研究用街毒株GD-SH-01、强毒株CVS-11和弱毒株HEP-Flury分别感染CXCR3^-/- 小鼠和C57BL/6小鼠，检测小鼠CNS中免疫相关指标的表达水平。若CXCR3可通过调节小鼠CNS的免疫应答以抵抗RABV的感染，则感染不同致病性毒株的CXCR3^-/- 小鼠的免疫应答都应发生变化，理论上，感染弱毒株的CXCR3^-/- 小鼠免疫应答下调应最为显著，最终导致小鼠死亡，而街毒株和强毒株感染的CXCR3^-/- 小鼠应比C57BL/6小鼠更快死亡。然而，本研究探究敲除CXCR3对RABV致病性的影响的结果显示，CXCR3敲除对GD-SH-01、CVS-11和HEP-Flury感染小鼠的临床症状、死亡率和体重变化趋势没有显著影响（P>0.05）。但其他结果表明，虽然CXCR3敲除后对鼠脑内街毒株GD-SH-01的病毒载量影响不显著（P>0.05），但在感染后第9天显著增加了鼠脑内弱毒株HEP-Flury的病毒载量（P<0.05），同时，也确实减少了RABV感染所诱导的CD4、IL-2和IL-6的表达水平（P<0.01），说明CXCR3在RABV感染中确实参与调控部分白细胞分化抗原和细胞因子的表达。由此观之，趋化因子受体CXCR3虽然不是唯一的决定因素，但小鼠确实可通过调节CNS中的免疫应答而对抵抗RABV感染产生一定的作用，这为研究RABV致病性和免疫逃逸提供基础，同时可能为狂犬病疫苗研制和治疗药物的研究提供新的靶点。结果表明，CXCR3在一定程度上可以调节抵抗RABV的免疫应答，则可应用刺激表达CXCR3的T细胞产生的疫苗佐剂，以期研制更有效和廉价的狂犬疫苗；对于治疗药物的研究而言，可通过将表达CXCR3的T细胞分选出来而后回输至机体，或使用CXCR3激动剂提高T细胞表面CXCR3的表达，达到治疗狂犬病的目的。

然而，本研究并未明确CXCR3在RABV感染中对小鼠血脑屏障通透性的调节作用，这将是今后进一步研究的方向之一。

4　结　论

本研究证实，在RABV感染中，趋化因子受体CXCR3调控了白细胞分化抗原CD4、细胞因子 IL-2和IL-6的表达，且敲除CXCR3后，鼠脑内的HEP-Flury病毒载量于感染后第9天显著增加，但对感染RABV GD-SH-01株、CVS-11株和HEP-Flury株的小鼠的血清中和抗体的产生、临床症状、存活率和体重变化没有显著影响。综上，趋化因子受体CXCR3通过调控小鼠CNS的免疫应答，即CD4、IL-2和IL-6的表达来抵抗RABV感染，但其不是唯一的决定因素。

参考文献

[1] 田钦. 基于基因替换的重组狂犬病病毒生物学性状及其感染小鼠的全脑转录组研究［D］. 广州：华南农业大学，2017

[2] Tian Q. Effect of gene substitution on biological character of rabies virus and transcriptional profiles of mice brain infected with rabies virus［D］. Guangzhou： South China Agricultural University， 2017 （in Chinese）

[3] 龙家慧. 狂犬病病毒疫苗株及致病株感染鼠脑中Ⅰ型干扰素相关基因的差异表达分析［D］. 广州：华南农业大学，2019

[4] Long J H. A study on the differential expression analysis of type Ⅰ interferon-related genes in mouse brain by infected by rabies virus vaccine strain and pathogenic strain ［D］.Guangzhou： South China Agricultural University， 2019 （in Chinese）

[5] Chai Q Q， He W Q， Zhou M， Lu H J， Fu Z F. Enhancement of blood-brain barrier permeability and reduction of tight junction protein expression are modulated by chemokines/cytokines induced by rabies virus infection［J］. Journal of Virology， 2014， 88（9）：4698-4710

[6] Chai Q Q， She R P， Huang Y， Fu Z F. Expression of neuronal CXCL10 induced by rabies virus infection initiates infiltration of inflammatory cells， production of chemokines and cytokines， and enhancement of blood-brain barrier permeability ［J］. Journal of Virology， 2015， 89（1）：870-876

[7] Zhou Y Q， Liu D Q， Chen S P， Sun J， Zhou X R， Xing C， Ye D W， Tian Y K. The role of CXCR3 in neurological diseases［J］. Current Neuropharmacology， 2019， 17（2）：142-150

[8] Tokunaga R， Zhang W， Naseem M， Puccini A， Berger M D， Soni S， McSkane M， Baba H， Lenz H J. CXCL9， CXCL10， CXCL11/CXCR3 axis for immune activation ： A target for novel cancer therapy ［J］. Cancer Treatment Reviews， 2018， 63：40-47

[9] Hosking M P， Lane T E. The role of chemokines during viral infection of the CNS［J］. PLoS Pathogens， 2010， 6（7）：e1000937

[10] Vandercappellen J， Van Damme J， Struyf S. The role of the CXC chemokines platelet factor-4 （CXCL4/PF-4） and its variant （CXCL4L1/PF-4var） in inflammation， angiogenesis and cancer ［J］. Cytokine & Growth Factor Reviews， 2011， 22（1）：1-18

[11] Sebina I， Ngo S， Rashid R B， Alorro M， Namubiru P， Howard D， Ahmed T， Phipps S. CXCR3⁺ effector regulatory T cells associate with disease tolerance during lower respiratory pneumovirus infection［J］. Immunology， 2024， 172（3）：500-515

[12] Hickman H D， Reynoso G V， Ngudiankama B F， Cush S S， Gibbs J， Bennink J R， Yewdell J W. CXCR3 chemokine receptor enables local CD8⁺ T cell migration for the destruction of virus-infected cells［J］. Immunity， 2015， 42（3）：524-537

[13] Ding W B， Li R F， Song T T， Yang Z F， Xu D T， Huang C Q， Shen S R， Zhong N S， Lai K F， Deng Z. AMG487 alleviates influenza A （H1N1） virus-induced pulmonary inflammation through decreasing IFN-γ-producing lymphocytes and IFN-γ concentrations ［J］. British Journal of Pharmacology， 2024， 181（13）：2053-2069

[14] Kuang Y， Lackay S N， Zhao L， Fu Z F. Role of chemokines in the enhancement of BBB permeability and inflammatory infiltration after rabies virus infection［J］. Virus Research， 2009， 144（1/2）：18-26

[15] Callahan M K， Williams K A， Kivisäkk P， Pearce D， Stins M F， Ransohoff R M. CXCR3 marks CD4+ memory T lymphocytes that are competent to migrate across a human brain microvascular endothelial cell layer［J］. Journal of Neuroimmunology， 2004， 153（1/2）：150-157

[16] 罗均. G蛋白替换及点突变对狂犬病病毒生物学特性的影响［D］. 广州：华南农业大学，2018

[17] Luo J. Effect of RABV G protein replacement and mutation on biological characters［D］. Guangzhou： South China Agricultural University， 2018 （in Chinese）

[18] Appolinário C M， Allendorf S D， Peres M G， Ribeiro B D， Fonseca C R， Vicente A F， Antunes J M， Megid J. Profile of cytokines and chemokines triggered by wild-type strains of rabies virus in mice［J］. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene， 2016， 94（2）：378-383

[19] Zhao L， Toriumi H， Kuang Y， Chen H C， Fu Z F. The roles of chemokines in rabies virus infection： Overexpression may not always be beneficial［J］. Journal of Virology， 2009， 83（22）：11808-11818

基金资助

广州市科技局基础与应用基础研究项目(202201010652)

“十四五”国家重点研发计划(2022YFD1800104)