基于GWAS对348份玉米种质资源的籽粒容重性状的分析

A GWAS-based research on ketest weight in 348 maize germplasm resources

摘要

为深入挖掘玉米籽粒容重的相关优势基因，以348份包含普通玉米、甜玉米、糯玉米、爆裂玉米等遗传多样性丰富的玉米自交系为关联群体进行全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study， GWAS），分别对2022年浙江东阳、2022和2023年海南乐东收获的自交系种子进行容重测定和全基因组关联分析，分析不同品种玉米籽粒容重性状差异，挖掘容重相关位点和控制容重的候选基因。结果表明：浙江东阳和海南乐东的玉米籽粒容重性状指标的频率分布呈单峰型曲线，符合正态分布。利用SNP标记全基因组关联分析，以阈值P＞8.7筛选出与玉米籽粒容重性状显著相关的SNP位点，2022年浙江东阳地区筛选出SNP位点146个，2022年海南乐东地区筛选出261个，2023年海南乐东地区筛选出705个，重叠SNP位点共67个，最终在相关SNP位点附近筛选出候选基因14个。其中，同时在浙江东阳（2022年）、海南乐东（2022和2023年）不同环境下均检测到的SNP S3_219692500位于Zm00001d044129（Shrunken2）基因区域，该基因为玉米甜度控制基因，即该基因突变后产生超甜玉米，籽粒皱缩，玉米容重下降。

Abstract

To explore the advantageous genes related to maize test weight， a total of 348 maize inbred lines containing common maize， sweet maize， waxy maize， and popcorn as linkage populations were taken for genome-wide association analyses （GWAS）. Test weight measurements and whole genome association analyses were conducted on self-crossing line breeding seeds of Dongyang， Zhejiang in 2022 and Ledong， Hainan in 2022 and 2023 to explore the differences in test weight among different varieties of maize， and to identify test weight-related loci and candidate genes that control test weight. The results showed that：The identification of harvested seed test weight in different regions revealed that the frequency distribution plots of seed test weight trait indicators in the two regions showed a single peaked curve， which was consistent with a normal distribution. Using genome-wide association analysis of SNP markers， the SNP loci significantly associated with maize test weight tolerance traits were screened in the range of threshold P > 8.7. 146 SNP loci were screened in the Dongyang region in 2022， 261 loci were screened in the Ledong region in 2022， 705 loci were screened in the Ledong region in 2023， and a total of 67 overlapping SNP loci were screened in the Ledong region. Finally， a total of 14 candidate genes were idendified. Meanwhile， the SNP S3_219692500 detected in Dongyang and Ledong was located in the Zm00001d044129 （Shrunken 2） gene region， which is a corn sweetness control gene.The mutation of the gene produces super sweet corn，grain shrinkage and maize test weight decrease.

Graphical abstract

关键词

玉米 / 籽粒容重（KTW） / 全基因组关联分析（GWAS） / 候选基因

Key words

maize / kernel test weight / genome-wide association analysis / candidate gene

玉米（Zea mays L.）作为中国第一大作物，是我国重要的粮食、饲料以及工业原料^［1］。玉米容重（Test weight，TW）指玉米籽粒在单位容积内的质量，属于复杂的数量性状。玉米籽粒容重能够真实地反映玉米的籽粒均匀程度、饱满程度、成熟度以及使用价值^［2］，因此容重可以作为玉米的重要品质指标。玉米容重是一种品质性状，与其他物理性状有密切的关系。容重的大小由籽粒的形状、含水量^［3］、内部结构^［4］等多方面因素决定。由容重的定义可知，等体积情况下，籽粒数目越多、质量越大，籽粒容重越高^［5］。胚乳细胞的增殖与发育也决定了籽粒的重量与质量^［6］。籽粒水分含量也与容重密切相关，已有研究表明玉米的籽粒容重与玉米粒重呈正相关关系^［7-8］。容重作为国际贸易中的重要质量定级因素，已经引起了国内外农业工作者的重视^［9］。解析容重的调控机制对培育高容重玉米新品种具有非常重要的意义。

随着测序技术、分子标记等技术的快速发展，为探究数量性状的分子机制提供基础^［10］，许文理等^［11］利用240个双单倍体构建了群体的连锁图谱，最终找到了5个控制玉米容重性状的位点；韩新桐^［12］以RIL群体为材料，共检测到2个容重相关QTL，分别位于第3、7号染色体上，各解释5.61%和3.32%的表型变异。Ding等^［13］通过F_2∶3群体，共检测到5个控制容重的QTL位点，分别位于chr 1、chr 2、chr 3、chr 4和chr 5上， 共解释了25.2%的表型变异。

浙江省有丰富的玉米种质资源^［14］，但受到国内外优良品种的冲击，再加上本地品种自身表型及基因型鉴定的深度和广度有所不足，导致大部分浙江玉米品种开发利用程度不高。容重偏低是限制我国玉米商品品质提升的主要原因之一^［15］，目前关于玉米容重相关性状基因挖掘的研究鲜见报道，本研究以348份玉米种质为材料，对容重性状进行全基因组关联分析，利用SNP标记全基因组关联分析，探究不同品种玉米籽粒容重性状差异，挖掘玉米品种容重相关位点和控制容重的候选基因，以期为选育高容重玉米品种提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

以 348 份玉米种质资源为材料，其中包括296份普通玉米、13份甜玉米、37份糯玉米和2份爆裂玉米。对玉米种质进行自交授粉 4 代提纯。2022和2023年，分别种植于浙江省东阳市（120.33’ E， 29.28’ N，海拔161 m）、海南省乐东黎族自治县（108.93’ E， 18.52’ N，海拔 212 m）。

1.2　试验方法

1.2.1　田间试验和取样

共348份玉米种质分别于2022和2023年在浙江东阳、海南乐东进行繁种和容重测定。在2022年浙江东阳繁种过程中，待玉米长至五叶一心期，收集348个自交系的玉米种质叶片分别采样，-80 °C保存。每个试验点种植3个随机区组重复。每个材料种植2行，行距65 cm，每行种植 20 株，株距30 cm，按玉米种植标准进行田间种植和管理。在自交系果穗吐丝前进行套袋，抽雄散粉后辅助人工授粉，待玉米成熟后收获果穗并经过风干、脱粒，取3个果穗中部均匀的种子混合编号备用。

1.2.2　玉米籽粒容重测定

在籽粒水分含率≤14%后脱粒，用浙江托普云农科技股份有限公司的GHCS-1000AP KTW 测定仪按照GB 1353—2009《玉米》^［16］中容重测定方法检测容重指标。玉米种质收获后在籽粒水分含率≤14%后，脱粒编号保存，同时测定每一批玉米籽粒的容重性状，试验数据测量重复3次，取平均值。

1.2.3　数据分析

利用Excel 2016软件和SPSS Statistics 对不同环境下测得的籽粒容重性状数据进行分析，剔除异常值并计算最大值、最小值、平均数、标准差、变异系数，绘制正态分布图、群体频率分布图、群体描述图，对玉米籽粒容重表型指标进行方差分析等（表1）。

1.3　玉米基因型数据的获得

在2022年春季繁种过程中，待玉米长至五叶一心期，收集348个自交系的玉米种质叶片分别采样，其中包括纯合度较高的248个玉米种质自交系和100个国内外骨干自交系，送往北京百迈客生物科技有限公司进行基因组重测序构建基因型图谱。筛选最小基因型频率（MAF）≥5%和SNP检出率≥5%，同时杂合率≤5%的高质量SNP标记用作后续分析，基因型数据参见基因组变异数据库GVM（https：//ngdc.cncb.ac.cn/gvm/getProjectDetail？Project=GVM000819）。

1.4　最佳K估算及群体结构分析

群体结构图使用Structure软件2.3.4进行分析，其中最佳K预估使用Structure Harvester软件进行可视化处理。

1.5　全基因组关联分析

利用前期筛选出的高质量SNPs进行全基因组关联分析。进行关联分析时采用Tassel 5.0软件的一般线性模型（MLM）中的主成分分析（PCA）以及亲缘关系矩阵（K）作为混合模型对玉米籽粒容重性状进行标记点位的关联分析。亲缘关系评估（Kinship K）通过Tassel 5.0构建。自交系间的PCA利用R软件里的SNP Related packet构建。以P<0.05为标准，根据0.05/SNP数量计算得到阈值，并根据此标准筛选显著关联的SNP点位用于下一步分析。2个模型的关联分析结果得出后利用Excel 2016、R软件（R version）及ggplot 2等作图，绘制Quantaile-quantile散点图做比较分析，选择最优的关联模型，做出关联的曼哈顿图（Manhattan Plots）、QQ散点图，通过阈值筛选出2个地区显著关联的SNPs位点，在经过2个地区SNP位点的匹配筛选出重叠的候选基因，在2个环境中的重叠位点表明该位点较稳定，受环境因素影响更小，更适合进行进一步的候选基因选择解析。

2　结果与分析

2.1　表型数据分析

对348份玉米种质资源进行整理，将所有玉米分为普通玉米、甜玉米、糯玉米、爆裂玉米4类，分别在浙江东阳、海南乐东两地进行种植，在收获后测定玉米籽粒容重。2022年浙江东阳共检测样品193份，其中普通玉米151份、甜玉米12份、糯玉米28份、爆裂玉米2份；2022年海南乐东共检测样品215份，其中普通玉米170份、甜玉米13份、糯玉米30份、爆裂玉米2份；2023年海南乐东共检测样品233份，其中普通玉米197份、甜玉米10份、糯玉米24份、爆裂玉米2份（表2）。

由表3可知，籽粒容重均值最大的为种植于2022年海南乐东试验点的爆裂玉米，容重均值为675.00 g/L。容重均值最小的为种植于2022年浙江东阳试验点的甜玉米，容重均值为355.30 g/L。极差最大的为种植于2023年海南乐东试验点的普通玉米，为512.90 g/L，2022年浙江东阳试验点的爆裂型玉米籽粒极差最小，为42.11 g/L。

由表4可知，玉米容重性状平均值按类型由高到低分别为：爆裂玉米（713.01 g/L）>普通玉米（670.54 g/L）>糯玉米（648.57 g/L）>甜玉米（401.31 g/L）；不同地点的联合分析容重值最大为爆裂玉米；联合分析的玉米籽粒容重极差为593.47，总体跨度较大，种类多样丰富，变异较大，平均变异系数（CV）达13.86%，各种类的总体CV处于11.65%~19.9%，其中在不同种类中CV最大的为甜玉米，CV为19.9%，且甜玉米的容重均值在所有种类中最低。

由图1可知，2022年浙江东阳、2022和2023年海南乐东的容重频率分布图都属于正态分布状态，符合关联分析的原则。2022年浙江东阳，籽粒容种主要集中于600~630 g/L，570~600 g/L频率次之；2022年海南乐东籽粒容种的最高频率出现在690~720 g/L，其次是在660~690 g/L；2023年海南乐东，玉米籽粒容重范围主要集中在690~720 g/L，720~750 g/L频率次之。

2.2　不同地区容重联合方差分析

由表5可知，以种质品种容重值为因变量，不同地区、玉米品种为自变量分组进行分析，设置α=0.05。F检验结果说明，容重受品种、环境以及品种与环境交互作用的显著影响，差异水平达到极显著水平（P<0.001）。

2.3　348份玉米种质资源分级

根据GB1353—2009《稻谷及玉米标准实施指南》^［16］中等级定级标准分类，将不同地区玉米种质容重分档（表6）。从表中可看出，一级容重标准占比最高的为2023年海南乐东地区，前三等次容重合计占比最高的为2023年海南乐东地区，相比之下，2022年浙江东阳地区一级、二级容重种子占比最少，由此看来，3个地区相比，2023年海南乐东试验群体的种子具有更高的容重。从不同地区容重性状联合分析占比数据看，一级容重籽粒占比30.07%，二级容重种质占比22.48%，前2个等级的容重种质占比超过1/2，群体容重性状整体较为优质。未来培育高容重玉米新品种时，可以选取其中优质种质进行选育。

2.4　全基因关联分析及候选基因挖掘

利用基因型测序 （GBS） 对348份种质进行基因测序，其中包括248份纯合度较高的种质和100份骨干自交系。使用贝叶斯模型对群体分群状况进行分析发现，当K=2时ΔK最大，即该群体分为2个亚群较为合适（图2（a）），进一步按照K =2绘制了该群体结构分布图（图2（b））。筛选出最小等位基因频率 （MAF）≥5%，SNP检出率≥5%同时杂合率≤5%的高质量SNP用于后续分析。从Maizeggo网站获得高密度SNP类型的数据。利用348个玉米品系的籽粒容重测量值和前期从maizeggo网站获得的高密度SNP数据，通过混合线性模型 （MLM） 以及一般线性模型（GLM）的PCA+K模型对浙江东阳、海南乐东的玉米籽粒容重性状进行全基因组关联分析。通过全基因组关联分析挖掘到与玉米籽粒容重性状显著相关的SNP点位在2022年浙江东阳、2022年海南乐东以及2023年海南乐东分别有146、261、705个，分布在10条染色体上。

由图3可知，本研究群体共包含22 642 752个标记，107 312个/Mb。1号染色体共包含3 243 773个SNP标记，10 566个/Mb；2号染色体共包含2 518 888个SNP标记，10 323个/Mb；3号染色体共包含2 543 280个SNP标记，10 822个/Mb；4号染色体共包含3 028 482个SNP标记，12 261个/Mb；5号染色体共包含2 402 212个SNP标记，10 724个/Mb；6号染色体共包含1 692 094个SNP标记，9 725个/Mb；7号染色体共包含1 974 320个SNP标记，10 848个/Mb；8号染色体共包含1 949 885个SNP标记，10 773个/Mb；9号染色体共包含1 646 592个SNP标记，10 291个/Mb；10号染色体共包含1 643 225个SNP标记，10 882个/Mb。

通过一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）对不同地区容重性状关联位点进行分析。在2022年浙江东阳检测到261个显著位点，主要分布于第3、4、8号染色体上，分别包含63、105和57个显著性SNP位点，平均解释了表型变异约1.68%（图4）。在2022年海南乐东检测到146个与容重显著相关SNP位点，主要分布于第3、4、5和8号染色体上，分别包含25、32、29和37个显著性SNP位点（图5），平均解释了表型变异约2.56%。在2023年海南乐东检测到705个显著位点，主要分布于第3、4、5和8号染色体上，分别包含10、92、521和33个显著性位点，平均解释了表型变异约3.29%（图6）。

对不同容重性状关联的显著位点进行分析，共发现4个重叠位点（图7）。从显著SNPs的位置分布来看，容重相关的显著SNP位点主要分布在1、3、4、8号染色体（表7），解释表型变异的范围在0.99%~4.35%，其中位于第3和第4染色体上的S4_82474714、S4_227536020和S7_92563528解释了相对较高的表型变异率，分别为4.35%、4.17%和4.12%。

在所有重叠的67个显著SNP位点附近共发现14个候选基因，分布在1、3、4、8号染色体上，通过基因功能注释发现14个候选基因功能涉及淀粉合成、蛋白翻译、信号传导等（表7），其中在重叠位点S3_219692500、S3_219696442、S3_219986753SNP附近发现的候选基因Zm00001d044116、Zm00001d044129、Zm00001d044130。Zm00001d044116（Rae1）编码RNA export factor 1，该基因通过促使ABA受体降解负调控ABA信号途径，在胚、穗的原始细胞、叶、根部分裂细胞、营养器官的分生组织等中均有表达（图8（a））；Zm00001d044129（Shrunken2）编码RNA export factor 1，与玉米籽粒的甜度以及籽粒的淀粉生物合成相关；Zm00001d044130编码50S ribosomal protein L31（核糖体蛋白L31）；Zm00001d044135编码丙氨酸转氨酶是一种吡哆醛酶，与糖酵解过程中丙酮酸的利用有关。

通过公共数据库（https：//qteller.maizegdb.org/generate_figures _B73v4.php）对候选基因的组织表达谱进行查询。Zm00001d044116在授粉后16、18、20、22 d胚中的表达量较高，在胚乳中表达量较低，在整个籽粒中其表达量基本保持稳定（图8（a））；Zm00001d044129在授粉后12、16、18、20、22 d胚乳中的表达量均较高，在胚中基本不表达，在全籽粒中呈现出在种子发育后期表达的趋势；Zm00001d044130在授粉后不同d的胚和胚乳中皆有表达，其中授粉后16 d的胚、12 d的胚乳中表达量较高，在整个籽粒中其表达量基本稳定（图8（c））；Zm00001d044136在授粉后的胚中表达，尤其在授粉后18 d的胚中表达量最高，在胚乳中基本不表达，在整个籽粒中呈现先升高再降低最后又升高的趋势，见图8（d）。

3　讨 论

3.1　玉米籽粒容重性状的影响因素

玉米籽粒容重是复杂的数量性状^［17-18］。本研究选择2022年浙江东阳、2022和2023年海南乐东作为试验点对348份玉米种质资源进行容重性状的差异性分析发现，不同品种间的容重存在差异，浙江东阳地区不同品种的自交系容重差异较大，群体极差达593.47 g/L；从基因型看，不同基因型的玉米籽粒容重差异显著。宋秀娟等^［9］研究发现，容重与籽粒水分含量之间的相关系数达到显著水平，甜质型玉米籽粒因内部含有较高的水溶性多糖、粗脂肪、淀粉以及多种游离的氨基酸和维生素，而其中淀粉的占比较其他种类玉米更少，因此，甜质型玉米的籽粒容重相对低^［19］，这与甜质型玉米的容重在浙江东阳与海南乐东的数值均处于较低水平的结果相符。袁凡等^［5］研究表明，播期对玉米籽粒容重的影响达显著水平。本研究于2022年春、2022年秋以及2023年秋季，分别在浙江东阳、海南乐东两地的玉米种质进行播种，不同气候条件籽粒容重性状也随之变化，2022年春季浙江东阳一级容重种子占比4.2%、2022年秋季海南乐东一级容重种子占比37.67%、2023年秋季海南乐东一级容重种子占比达到50.39%；从播种地区来看，不同试点的同一玉米种质籽粒容重由高到低为：2023年海南乐东>2022年海南乐东>2022年浙江东阳，且差异显著，各地区的玉米容重变异范围在4.7%~27.2%；方差分析结果也显示，环境、品种、环境×品种对容重性状都呈现极显著影响。其原因可能是因为不同地区的空气湿度、降水量以及光照等环境因素造成了所有种质品种在不同地区的变异和差别，影响玉米数量性状的重要因素之一就是基因与环境互作^［20］。本研究中，海南乐东的籽粒容重2023年较2022年整体表现较好的原因可能是2023年降水量充足，病虫害较少。

3.2　分析玉米基因型及筛选显著SNP点位

玉米籽粒容重性状的遗传机制较为复杂^［21-22］。本研究通过对高容重性状群体筛选出SNP位点并进行比较。常规的阈值为0.01/N，其中N为基因型的标记数量（SNP的数量），以此计算出阈值为8.7，因此以阈值8.7为标准筛选出显著相关的SNP位点。在2022年浙江东阳、2022和2023年海南乐东分别定位到104、219和705个容重性状显著相关的SNP位点。使用plink 2对LD衰减平均速度计算得到其为2.05 kb，对关联SNP这个范围内的候选基因进行筛选通过比对海南乐东与浙江东阳地区的显著SNP位点，共发现67个共同定位点位，这些位点分布在1、3、4、8号染色体，解释表型变异的范围为0.99%~4.35%。这些位点可能与玉米籽粒的胚乳、胚基因控制效应相关，遗传机制较复杂同时受到环境因素的影响较大。乔峰^［23］通过CUBIC群体定位到的解释表型变异>5%的位点分别位于1、7、10号染色体，加性效应值范围在 1.19~13.56 g/L。

3.3　候选基因的挖掘

种质资源创新是高品质玉米育种和玉米自交系改良的基础^［24］。结合相关SNP关联位点筛选，对玉米籽粒容重性状进行候选基因匹配搜索，检测到籽粒甜度、淀粉积累相关基因、调控脱落酸ABA相关基因、信号转导相关基因等多种功能基因^［25］，说明容重性状遗传基础复杂，进行分子标记辅助育种对于探索玉米容重遗传机制十分重要。在所有重叠的显著SNP位点附近共发现包括67个候选基因，且多个基因已有相关报道^［26-29］。

S3_219692500位点附近的Shrunken2（sh2，gene id：Zm00001d044129）为已报道的基因^［26］。Ruanjaichon等^［24］在对甜玉米进行全基因组关联分析时筛选到1个SNP位点AX_91848634距离sh2仅65 kb，sh2能显著提高胚乳糖水平。此外，sh2还与玉米籽粒的淀粉生物合成相关，它能编码异四聚体酶的大亚基、二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）和1个限速酶^［26］。sh2功能缺失突变体导致AGP活性显著降低，从而导致蔗糖无法转化为ADP影响淀粉前体的生物合成，最终导致籽粒内淀粉含量低下^［26］。表达谱的数据也发现该基因在胚乳、籽粒发育过程中的表达量很高，进一步说明该基因与玉米籽粒容重形成有关。

在SNP位点S3_219692500和S3_219696442附近的Zm00001d044116（RAE1）具有很高的P，编码RNA export factor 1，该基因在胚、胚乳中的表达量较高（图 8），Li等^［27］在对拟南芥的研究中发现，在拟南芥中过表达AtRAE1会导致植物对ABA的敏感性降低，而抑制AtRAE1则会导致植物对ABA的敏感性增加。该基因可能通过调节ABA受体的降解参与ABA信号转导。但是其调控玉米容重的分子机制仍不清楚。

S3_219986753位点附近的Zm00001d044130也有过相关报道，Ueta等^［28］报道Zm00001d044130编码的核糖体蛋白L31在大肠杆菌中影响翻译活性，缺乏L31的核糖体翻译活性比具有完整L31核糖体低40%，表明在大肠杆菌中L31参与了翻译。通过分析Zm00001d044130的组织表达谱发现，除了在胚乳与籽粒中有表达，Zm00001d044130在受到胁迫时表达量也出现上升的情况，在叶片的表达量也很高，推测Zm00001d044130能够通过增强植株的整体抗逆性来提高叶片的光合能力，保证生物量的积累。

S3_220077926位点附近的Zm00001d044136编码甘油-3-磷酸酰基转移酶1（GPAT1）。在三酰甘油的合成过程中，甘油三磷酸酰基转移酶 （GPAT） 是合成途径中第一步反应的关键酶^［29］，生物合成的限速酶，最终将脂肪酸催化形成三酰甘油，改变GPAT活性影响油脂的组成和积累。GPAT还在植物中参与调节生长发育、脂质的合成^［30］和逆境应答等过程。鲁中爽等^［31］对大豆油脂的合成途径及关键酶GPAT基因的研究发现，GPAT基因的表达影响脂肪酸的合成，对油脂含量起到调控作用。

4　结 论

本研究利用348份玉米自交系群体对2022年浙江东阳、2022和2023年海南乐东收获种子的容重性状进行全关联分析，分别定位到146、261和705个显著SNP位点，不同环境下重叠SNP位点67个，分布在14个基因附近，其中SNP S3_219692500位点附近的Zm00001d044129（Shrunken 2）基因在发育的玉米胚乳中表达，可能通过影响淀粉合成影响容重；Zm00001d044116（RAE 1）、Zm00001d044130（核糖体蛋白编码基因）、Zm00001d044136（甘油-3-磷酸酰基转移酶1编码基因）在玉米胚、胚乳、籽粒中表达，分别与ABA信号通路、蛋白质合成、油脂合成相关。

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基金资助

浙江省玉米种质资源精准鉴定评价项目（2022-2024）

杭州市科技发展计划(202203A02)

浙江省农业（旱粮新品种选育）新品种选育重大科技专项(2021C02064-4-3)

国家自然科学基金(32301833)

浙江省自然科学基金(LTGN24C130001)