523份玉米自交系对禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的抗性鉴定

Resistance evaluation of 523 maize inbred lines to Gibberella ear rot and gray leaf spot

摘要

为筛选东北地区抗禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的玉米自交系，2021—2023和2022—2023年分别对523份玉米自交系开展了禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的田间人工接种抗性鉴定，试验采用随机区组设计，在吐丝 10 d后和9—11叶期通过针刺接种法和心叶灌注法分别接种禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的病菌，在蜡熟末期采用单株调查法对禾谷镰孢穗腐病病情级别进行调查，在乳熟后期对灰斑病病情发生级别进行调查。结果表明：在禾谷镰孢穗腐病的抗性鉴定中，‘PHRE 1’3年均稳定表现抗病，‘丹598’ ‘吉A1473’ ‘LN 1’等23份自交系在3年内均达到中抗以上，占总参试自交系的4.2%；在灰斑病的抗性鉴定中，‘丹299’在2年中均稳定表现出抗病，‘LH217’、‘吉1037’和‘吉A1001’等67份自交系2年中均达到中抗以上，占总参试自交系的12.6%。综上，‘吉A1473’、‘A-349’和‘M 67’这 3个自交系对2种病害均能达到中抗以上，可用于培育抗禾谷镰孢穗腐病和抗灰斑病的春玉米新种质。

Abstract

In order to identify maize inbred lines resistant to Gibberella ear rot and gray leaf spot in the northeast region，a precise evaluation of 523 maize inbred lines resistance to Gibberella ear rot and gray leaf spot was carried out by field inoculation from 2021 to 2023 and 2022 to 2023， respectively. The experiment adopted a randomized block design and inoculated Gibberella ear rot pathogen through the needle puncture inoculation method after 10 d of silking and gray leaf spot pathogen through the perfusion methods after 9-11 leaves stage. At the wax ripeness stage， the single plant survey method was adopted to investigate the severity level of Gibberella ear rot disease. At the late milk stage， the whole-line survey method was adopted to investigate the severity level of gray leaf spot disease. The results showed that： The inbred line ‘PHRE1’ was stably resistant to Gibberella ear rot from 2021 to 2023. Twenty-three inbred lines including ‘Dan 598’， ‘JiA 1473’ and‘LN 1’ exhibited moderate resistance or above within three years， accounting for 4.2% of the total materials. The inbred line ‘Dan 299’ was resistant to gray leaf spot disease for two years. Sixty-seven inbred lines including ‘LH 217’， ‘Ji 1037’ and ‘JiA1001’expressed moderate resistance or above in two years， accounting for 12.6% of the total test materials. By comparison analysis， a total of three inbred lines （‘JiA1473’，‘A-349’and ‘M67’） identified were resistant to the two diseases. This study provided valuable resources and a scientific basis for the cultivation and improvement of resistant maize varieties.

Graphical abstract

关键词

玉米 / 自交系 / 抗性鉴定 / 禾谷镰孢穗腐病 / 灰斑病

Key words

maize / inbred lines / resistance identification / Gibberella ear rot / gray leaf spot

玉米是我国主要的粮食作物，在农业生产中占据重要地位^［1］。根据国家统计局发布的数据，2023年我国玉米产量28 884万t，占全国粮食总产量的41.53%^［2］，东北春玉米产区是我国最大的商品粮生产基地，占全国玉米总产量的44.98%。玉米的安全生产一直以来受到生物逆境和非生物逆境胁迫的影响，其中病害是影响玉米产量和品质的重要限制因素，造成的损失常年在6%~10%。对2008—2019年东北三省玉米主要病害进行分析发现，大斑病、丝黑穗病是玉米最主要的病害^［3］。近年来玉米病虫害发生一直呈加重趋势，一些次要病虫害逐渐上升为主要病虫害^［4］。受东北地区近年来频发台风等气候因素影响，造成玉米穗腐病大面积发生^［5］。禾谷镰孢（Fusarium graminearum）是东北地区穗腐病的优势致病菌之一^［6-9］，该致病菌产生的镰孢菌素C毒素等有害产物可严重影响玉米品质安全^［10-11］。灰斑病也是我国玉米生产中常见的叶斑病之一，其造成的产量损失可达10%~60% ^［12-14］，其中由玉米尾孢引起的灰斑病在季风作用下向东向北玉米产区扩散，对我国春玉米主产区构成重大威胁^［15-16］。因此，东北作为我国最大的玉米产区，加快培育高产抗病抗逆玉米品种对支撑保障我国粮食安全具有重要意义。

选育抗病性强的玉米品种是应对这2种病害最经济、快速、有效的方法。从遗传育种领域来看，目前国内外已开展了穗腐病、灰斑病的相关研究，包括玉米种质抗病性鉴定^［17-34］、QTL定位^［35-37］、全基因组关联分析^［38］、基因克隆^［39-40］等，其中抗性种质资源是开展抗病育种的基础。夏玉生等^［17］对346份玉米自交系进行抗拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）与禾谷镰孢穗腐病的鉴定，‘15-TL-1224’等45份自交系对2种镰孢穗腐病同时表现中抗以上水平；段灿星等^［21］对690份玉米种质进行拟轮枝镰孢与禾谷镰孢穗腐病的抗性鉴定，‘H 446’等3份种质均对2种穗腐病表现出稳定抗性；董怀玉等^［33］对413份玉米自交系进行抗灰斑病鉴定，筛选出高抗自交系6份、抗病自交系28份；刘可杰等^［25］评价了300份玉米种质对2种灰斑病菌玉米尾孢（Cercospora zeina）和玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）的抗性，76.99%的种质对玉米尾孢表现中抗以上，38.33%的种质对玉米玉蜀黍尾孢表现中抗以上。已有的研究表明，绝大多数鉴定评价的玉米种质是种质资源库中已有资源^{［17-18，20-22，25，30］}，在当前的育种中应用较少；此外，这些资源研究较早、应用范围针对性不强^{［24，26-28，33］}，适合当前东北玉米育种的资源不多。总体来看，目前对东北春玉米区育种应用的自交系开展抗禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的规模化鉴定研究鲜见报道。本研究以吉林省农业科学院玉米研究所最新选育的自交系、自选骨干自交系、国内骨干自交系、美国公开信息的自交系等523份当前育种应用的玉米自交系分别开展抗禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的鉴定评价，旨在筛选出抗病性强的优异自交系，以期为选育抗禾谷镰孢穗腐病和抗灰斑病的春玉米新品种奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

以吉林省农业科学院玉米研究所收集和选育的523份玉米自交系为试验材料，包括最新自选系195份、自选的骨干自交系98份、国内骨干自交系127份、糯玉米自交系30份、美国公开的自交系73份。

1.2　试验设计

在吉林省农业科学院公主岭试验基地（124°82´ E，43°50´ N，海拔232 m）开展禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的人工接种鉴定试验。试验基地地处吉林省中部，温带大陆性季风气候，温度、雨量、光照等季节性变化明显。2种病害均于7月接种，9月开展抗病性调查。2021年7―9月平均气温分别为26.0、22.2和17.6 ℃，降雨量分别为194.7、171.3和173.9 mm。2022年7―9月平均气温分别为24.4、21.6和17.8 ℃，降雨量分别为300.6、248.7和68.7 mm。2023年7―9月期间平均气温分别为24.6、22.9和19.1 ℃，降雨量分别为103.6、103.9和4.5 mm（图1）。

2021—2023年开展了禾谷镰孢穗腐病抗性鉴定，2022—2023年开展了灰斑病抗性鉴定。采用随机区组试验设计，每个自交系种植2行，行长5 m，行距0.62 m，株距0.25 m。每100行设置1组对照材料，穗腐病对照材料为‘B 73’（高感，HS）^［41］，灰斑病对照材料为‘掖478’（高感，HS）^［42］。生长期栽培管理与常规大田一致。

1.3　试验方法

1.3.1　病原菌准备和扩繁

接种用穗腐病致病菌为禾谷镰孢（F. graminearum），灰斑病为玉米尾孢（Cercospora zeina）和玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）2种致病菌混合。菌株由吉林省农业科学院植物保护研究所分离、鉴定和保存，接种前将菌株在液体培养基上扩繁培养并制备孢子悬浮液。

1.3.2　禾谷镰孢穗腐病接种和鉴定方法

禾谷镰孢穗腐病抗性鉴定采用针刺接种法^［41］，在植株果穗吐丝 10 d后，利用金属针和可定量的连续注射器，在每穗果穗中间部位注射接种 2 mL 浓度为2×10⁶ 个/mL的孢子悬浮液，接种后正常肥水管理。进入蜡熟末期后，对收获的接种病原菌的果穗逐穗鉴定，按照果穗发病面积划分成对应的病情级别（表1）。根据单穗的病情级别，计算每份自交系的平均病情级别，再进行抗性评价和最高抗级评价^［21］（表2），平均病情级别计算公式如下：

\mathrm{E}\mathrm{R}{\mathrm{S}}_{\mathrm{A}}=\frac{{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}\mathrm{E}\mathrm{R}\mathrm{S}}{n}

式中：ERS，禾谷镰孢穗腐病病情级别（ear rot score， ERS）；ERS_A，禾谷镰孢穗腐病平均病情级别（ear rot score on average， ERS_A）；i=1， 为第1个单株； n为最后第n个单株。计算保留1位小数。

1.3.3　灰斑病接种和鉴定方法

灰斑病抗性鉴定采用心叶灌注法接种^［42］，在植株9—11叶期后，利用注射器或胶头滴管平行插入到植株喇叭口处，在心叶中间部位注入 5 mL浓度为5×10³个/mL的孢子悬浮液。接种前进行田间浇灌，接种后正常肥水管理。玉米乳熟后期，对玉米穗位叶及上部3片叶片进行病级调查，根据叶片的感病面积进行病情分级和最高抗级评价（表3）。

1.3.4　接种有效性判读

当穗腐病抗性鉴定的感病对照材料‘B 73’的平均病情级别≥5.6，灰斑病的感病对照材料‘掖478’的发病级别达到7级以上，判定鉴定结果有效^［41-42］。

1.4　数据统计分析

利用Microsoft Excel 2016和SPSS 24.0对抗性鉴定数据进行分析与处理。

2　结果与分析

2.1　禾谷镰孢穗腐病抗性分析

2021—2023年对玉米自交系进行禾谷镰孢穗腐病抗性分析，感病材料‘B 73’的平均病情级别分别为5.8、7.1和6.5，表现为感、高感和感，表明2021—2023年对禾谷镰孢穗腐病的鉴定结果有效。

由图2可知，2021年514份自交系中，‘吉1037’、‘吉803’和‘吉D1392’等34份自交系表现为高抗（HR），占参试自交系的6.6%；‘FBHJ’、‘PHV 78’和‘2FACC’等249份自交系表现为抗病（R），占参试自交系的48.4%；‘PHN 82’、‘LH 205’和‘PHR 25’等149份自交系表现为中抗（MR），占参试自交系的29.0%；‘PHK 42’、‘PHJ 90’和‘LH 172’等58份自交系表现为感病（S），占参试自交系的11.3%；‘PHK 29’、‘PHK 05’和‘PHR 47’等24份自交系表现为高感（HS），占参试自交系的4.7%。

2022年507份自交系中，‘PHKM 5’、‘吉18S304’和‘PHRE 1’这3份自交系表现为高抗（HR），占参试自交系的0.6%；‘PHR 25’、‘PHBW 8’和‘吉854’等21份自交系表现为抗病（R），占参试自交系的4.2%；‘FBHJ’、‘IBC 2’和‘PHK 29’等107份自交系表现为中抗（MR），占参试自交系的21.1%；‘PHK 42’、‘PHK 76’和‘PHN 11’等170份自交系表现为感病（S），占参试自交系的33.5%；‘IBB 15’、‘PHW 52’和‘PHN 82’等206份自交系表现为高感（HS），占参试自交系的40.6%。2023年，仅有‘CH 552’表现为高抗（HR），占参试自交系的0.2%；‘PHJ 90’、‘MQ 305’和‘PHRE 1’等26份自交系表现为抗病（R），占参试自交系的5.0%；‘IBB 15’、‘IBC 2’和‘PHN 11’等48份自交系表现为中抗（MR），占参试自交系的9.2%；‘FBHJ’、‘PHK 29’和‘PHK 05’等99份自交系表现为感病（S），占参试自交系的18.9%；‘PHV 78’、‘PHK 76’和‘PHW 52’等348份自交系表现为高感（HS），占参试自交系的66.7%（图2）。

结合3年的抗性数据，‘PHRE 1’ 在3年均表现出对禾谷镰孢穗腐病稳定的抗性，‘丹598’ ‘吉A1473’ ‘LN 1’等其他22份自交系综合抗性达到中抗（表4）。2021与 2022、2022与 2023、2021 与 2023 年的禾谷镰孢穗腐病综合抗性相关系数（r）分别为 0.24、0.17 和 0.14，年度间综合抗性的结果差异显著（P<0.05）。

2.2　灰斑病抗性分析

2022—2023年对玉米自交系进行灰斑病抗性分析，灰斑病感病材料‘掖478’的发病级别分别为7和9，表现为感（S）和高感（HS），表明2022—2023年对灰斑病的鉴定结果有效。

由图3可知，2022年513份自交系中，‘LH 217’、‘B 414’和‘C 416’等29份自交系对灰斑病表现为高抗（HR），占参试自交系的5.7%；‘IBC 2’、‘PHK 05’和‘PHK 76’等133份自交系表现为抗病（R），占参试自交系的25.9%；‘IBB 15’、‘PHK29’和‘PHR25’等169份自交系表现为中抗（MR），占参试自交系的32.9%；‘FBHJ’、‘PHV78’和‘PHV 63’等127份自交系表现为感病（S），占参试自交系的24.8%；‘PHN 11’、‘PHP 02’和‘PHN 82’等55份自交系表现为高感（HS），占参试自交系的10.7%。

2023年鉴定的513份自交系中，未发现高抗的自交系。‘LH 159’、‘丹299’、‘E 5045’、‘8505’和‘吉A71’这5份自交系表现为抗病（R），占参试自交系的1%；‘LH 217’、‘PHHB 9’和‘PHMK O’等92份自交系表现为中抗（MR），占参试自交系的17.9%；‘PHV 78’、‘PHK 42’和‘PHK 76’等308份自交系表现为感病（S），占参试自交系的60%；‘FBHJ’、‘IBB 15’和‘IBC 2’等108份自交系表现为高感（HS），占参试自交系的21.1%（图3）。

2022和2023年 ‘丹299’均表现对灰斑病抗病；‘LH 217’、‘吉1037’和‘吉A1001’等66份自交系2年均达到中抗以上（图3和表5）。2年的玉米自交系灰斑病综合抗性的r为 0.13，抗性结果差异显著（P<0.05）。

2.3　自交系综合抗病性分析

对523份自交系进行抗禾谷镰孢穗腐病和灰斑病鉴定综合分析结果表明，2021—2023年‘吉A1473’、‘A-349’和‘M 67’这3份自交系同时在抗禾谷镰孢穗腐病和灰斑病鉴定中达到中抗以上，占参试自交系的0.6%（表6）。

3　讨 论

3.1　玉米禾谷镰孢穗腐病抗性鉴定

玉米禾谷镰孢穗腐病抗性鉴定的接种方法有2种，针刺接种法和花丝通道注射法^［41］，区别在于针刺接种法直接扎入果穗中，发病速度快，程度更重，缺点在于对果穗造成的创伤有可能加重其他病菌的侵染^［21］；花丝通道注射法更接近于病原菌的自然侵染方式，自交系抗性水平差异明显，缺点是对接种时期要求较高，接种量和接种时间不易掌握，接种过早或过晚都不利于病菌侵染和发病^［21］。已有研究表明，利用这2种方法接种，在确保被鉴定材料成功接种上孢子悬浮液的情况下， 两者的鉴定结果一致性高，相关系数r≥0.90^［21］。鉴于本研究中需鉴定的自交系数量多，熟期跨越大（早熟、中熟、晚熟等），且要应用于育种实践，需要筛选抗性较强种质，所以采用了针刺接种法，尽量避免接种时环境和生长时期不同可能对结果造成的影响。本研究中采用的一些骨干自交系与已有研究鉴定的自交系表现出一定的一致性，应用针刺接种法，苏爱国等^［22］对324份玉米自交系进行禾谷镰孢穗腐病抗性鉴定，鉴定出9份表现高抗的自交系，其中‘Mo 17’表现高抗，但在王丽娟等^［29］和徐婧等^［30］的鉴定中均表现为感病及以上。本研究中‘Mo 17’在2021和2022年表现为抗病、2023年则表现为感病，由此推断‘Mo 17’的抗病性与王丽娟等^［29］和徐婧等^［30］的结果基本一致；苏爱国等^［22］的两点鉴定研究中，自交系‘CN 1483’表现为高抗和抗，与王丽娟等^［29］鉴定的抗性表现（抗）一致，本研究中表现为2021年高抗、2022和2023年中抗，说明‘CN 1483’对穗腐病具有较稳定的抗性。由此可见，除接种方法外，不同鉴定年份的气候条件差异和同一年份不同鉴定地点的环境均会对鉴定结果产生较大影响。因此，经过多年多点的重复鉴定可更精准有效地明确玉米自交系的抗性水平。

3.2　玉米灰斑病抗性鉴定

玉米灰斑病的主要致病菌包括玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）和玉米尾孢（Cercospora zeina）。赵立萍等^［15］通过分子鉴定分析发现，玉蜀黍尾孢是北方玉米区唯一的致病种，并预测出玉米尾孢将随着季风从西南迅速向东向北扩散。2016年在黑龙江省双城市田间采集的玉米病叶上检测到玉米尾孢，说明玉米尾孢已突破秦岭阻隔扩展到北方玉米产区，将对华北北部及东北的玉米产区产生巨大威胁^［31］。刘可杰等^［25］在2013-2016年对300份自交系分别进行玉米尾孢菌和玉蜀黍尾孢菌的抗性鉴定，筛选出抗病自交系110份，其中‘昌7-2’和‘中106’均表现为抗病。而本研究发现，‘昌7-2’2022年表现为抗病，2023年表现为感病，‘中106’2022年表现为高抗，2023年表现为感病，这可能由于2023年的环境影响，灰斑病发病情况更重。2021年北方灰斑病大发生给春玉米生产带来严重挑战^［5］，本研究采用了玉米尾孢和玉蜀黍尾孢混合的菌液进行人工接种鉴定，以期筛选出对2种致病菌均有较高抗性的自交系。在周雪琴等^［32］、董怀玉等^［33］、吕香玲等^［34］单一菌株侵染的抗性鉴定中，‘444’、‘81162’和‘A632 Ht’表现感病，与本研究结果一致。在接种方法上，以上所有均采用心叶灌注法^［42］，因为该种方法相比喷雾接种法更适合空气湿度变化大的平原地区。玉米灰斑病抗性是多基因控制的数量性状，通过r 可以看出年度间综合抗性的结果差异较大，这也为灰斑病抗病育种增加很大挑战。本研究中，2023年气温较往年升高，2种病害在当年的空气湿度下发生得更为迅猛。目前，仍然缺乏高抗的玉米自交系，仅有‘丹299’1个稳定的抗性种质。因此，今后仍需进一步加强灰斑病抗性玉米种质筛选。

3.3　玉米抗病育种种质分析

抗病自交系的创制对于培育抗病高产稳产玉米品种具有重要意义^［19］。从本研究结果来看，目前禾谷镰孢穗腐病的抗性种质比较缺乏，抗性水平达中抗以上的仅有23份自交系，而灰斑病的有67份。在这些抗病自交系中，最新自选培育的自交系占有一定比例，抗灰斑病的自交系多于抗禾谷镰孢穗腐病，均抗2种病害的自交系非常少，仅有3个。今后，开展抗病广谱多基因聚合育种是选育绿色抗病玉米品种的基础^［5］，‘吉 A1473’综合抗性好，兼抗2种病害，聚合了多个抗性基因，并已衍生创制出‘吉A318’ ‘吉A709’ ‘吉A1209’ ‘吉A383’等自交系，对于拓宽东北玉米抗病种质具有重要的应用价值。

4　结 论

2021—2023年采用人工接种方法鉴定了523份玉米自交系对禾谷镰孢穗腐病和灰斑病的抗性水平。在抗禾谷镰孢穗腐病鉴定中，中抗 （MR） 以上的自交系占比4.4%， 自交系‘PHRE 1’在3年的鉴定试验中均表现为抗（R）以上。在抗灰斑病鉴定中，中抗 （MR） 以上的自交系占12.8%， ‘丹299’在2年的试验中均表现为抗（R）以上。同时筛选出‘吉A1473’、‘A-349’和‘M 67’对2种病害抗性均表现为中抗以上的自交系，可用于培育抗禾谷镰孢穗腐病和抗灰斑病的春玉米新种质。

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基金资助

国家重点研发计划课题(2021YFD1201002)

长白山人才工程-科技创新领军人才项目(000029)