蒙古冰草XTH基因生物信息学及干旱胁迫下表达分析

Bioinformatics and expression analysis of XTH gene in Agropyron mongolicum Keng under drought stress

摘要

为筛选出蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）抗旱相关的XTH基因，利用生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、进化关系及二、三级结构进行分析，并对4个抗旱相关的XTH基因进行表达分析。结果表明：筛选得到的7个蒙古冰草XTH基因，蛋白大小位于70~357 aa，分子质量为7.67~39.46 ku，理论等电点（PI）在4.67~9.81，均为亲水性蛋白；亚细胞定位表明AmXTH‑1定位在细胞壁和细胞质，其余6个定位于细胞壁。XTH基因的二、三级结构以无规则卷曲为主，推测motif1、motif2和motif3为保守基序。进化关系比对发现AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1与已知具有抗旱功能的基因具有较高相似性。qRT-PCR分析表明，4个与蒙古冰草抗旱相关的XTH基因均呈下调表达。推测蒙古冰草中差异表达的4个XTH基因在响应干旱胁迫中起负调控作用。

Abstract

To screen the XTH genes related to drought resistance in Agropyronmongolicum Keng， the physical and chemical properties， subcellular localization， conserved motif， evolutionary relationship and secondary and tertiary structures were analyzed by bioinformatics methods， and the expression of four XTH genes related to drought resistance was monitored. The results showed that： The seven XTH genes of A.mongolicum were hydrophilic proteins with molecular weight of 7.67 to 39.46 ku， the theoretical isoelectric point （PI） of 4.67 to 9.81， and protein size of 70 to 357 aa. Subcellular localization analysed showed that AmXTH‑1 was located in the cell wall and cytoplasm， and the rest 6 genes were located in the cell wall. The secondary and tertiary structures of the XTH gene were mainly random coils， and motif1， motif2 and motif3 were speculated to be conserved motifs. Phylogenetic analysis showed that AmXTH30，AmXTH28‑1，AmXTH‑1 and AmXTH8‑1 had high similarity with known genes with drought resistance. The qRT-PCR analysis showed that the four XTH genes related to drought resistance of A.mongolicum were down-regulated. It is speculated that the four differentially expressed XTH genes in A.mongolicum play a negative regulatory role in response to drought stress.

Graphical abstract

关键词

蒙古冰草 / XTH / 生物信息学分析 / 基因表达

Key words

Agropyronmongolicum Keng / xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase / bioinformatics / gene expression

干旱是危害植物正常生长发育、导致作物减产的非生物胁迫因素之一^［1］。在植物生长发育过程中，干旱会影响其体内的水分平衡，干扰正常生长，改变其生理和形态的特征，从而导致植物萎谢、死亡^［2］。研究发现，干旱胁迫下植物的叶面积呈现降低的趋势，影响植物的光合作用和蒸腾作用，进而影响植物的生长发育。除此之外，干旱胁迫还会影响根、茎和叶的生长，甚至根际的土壤环境^［3］。因此提高农业用水效率，从分子层面对一些抗逆基因进行鉴定和功能研究，从而筛选更多抗旱品种，对于减轻干旱对植物带来的严重危害具有重要意义。

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase，XTH）为细胞壁重构过程中的一种关键酶^［4］，是由多基因家族编码的一类蛋白，具有催化木葡聚糖内糖基转移酶（XET）和木葡聚糖水解酶（XEH）的双重功能，是糖苷水解酶GH16家族成员之一。依照蛋白质功能和氨基酸序列的不同，可以将XTH蛋白分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三大类，第Ⅲ类又可分为ⅢA和ⅢB两类。其中，Ⅰ、Ⅱ类同时具有XET和XEH这2种活性，第Ⅲ类只有木葡聚糖水解酶活性。研究表明，XTH主要作用于初生细胞壁，通过调节其弹性、延展性进而在植物逆境响应的过程中发挥作用^［5］。沈红艳^［6］通过对黑麦草LpXTH8基因以及二穗短柄草中的同源基因BdXTH27在干旱处理下进行定量分析，发现LpXTH8和BdXTH27基因可能在植株应对干旱胁迫中起到一定的作用。Cho等^［7］对辣椒XTH基因的研究中也发现，干旱能够使辣椒CaXTH1、CaXTH2和CaXTH3基因的表达量上调，并且在辣椒和拟南芥中过量表达CaXTH3基因能够显著提高转基因植株对干旱的抵抗能力。

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）原名沙芦草，是禾本科小麦族冰草属多年生草本植物，对干旱、寒冷及风沙具有很强的抵抗能力，春季返青早，蒙古冰草是干旱草原和荒漠地带的重要牧草^［8］。然而目前蒙古冰草中XTH基因抗旱功能研究尚未见有报道。本研究拟通过生物信息学及qRT-PCR方法，对蒙古冰草XTH基因进行筛选及表达分析，以期为蒙古冰草优良抗旱功能基因的挖掘和利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料及干旱胁迫处理

本试验材料为蒙古冰草（A.mongolicum Keng），种子采自于内蒙古农业大学萨拉齐牧草繁种基地。挑选颗粒饱满的种子于室内培养箱水培生长，温度为24 ℃、光周期为16 h。在三叶一心时期用含25% PEG-6000的1/5 Hoagland’s营养液模拟干旱处理，同时设置对照组（CK）；之后在干旱1 d（d₁）、3 d（d₃）、5 d（d₅）、7 d（d₇）及复水1 d（f₁）取样，每个处理3次重复^［9］，用于后续qRT-PCR试验。

1.2　蒙古冰草XTH基因鉴定、序列比对及进化关系分析

从蒙古冰草转录组测序数据（登录号为PRJNA742257）组装的41 793个Unigenes中^［10］，根据功能注释初步筛选出22个XTH基因，用NCBI中的ORFfinder （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，使用NCBI中的 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行分析，筛选出具有保守结构域的氨基酸序列。

利用在线分析软件Expasy中的ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）^［11］对筛选出的蒙古冰草XTH基因的氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点（PI）、脂肪指数和亲疏水性等理化性质进行分析，用Cell-PLOC2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）^［12］对蒙古冰草XTH基因进行亚细胞定位预测。

用在线分析软件The MEME Suite中的MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）^［13］对筛选出来的蒙古冰草XTH基因的保守基序进行分析。通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，筛选出具有抗旱功能的1条大麦（Hordeum vulgare）^［31］、1条玉米（Zea mays）^［16］、1条小麦（Triticum aestivum）^［17］、1条辣椒（Capsicum annuum L.）^［7］、5条水稻（Oryza sativa subsp. japonica）^［18］、3条谷子（Setaria italica）^［19］的XTH核酸序列。使用DNAMAN软件对7个蒙古冰草XTH基因编码的氨基酸序列与12个已知的具有抗旱功能的XTH基因的氨基酸序列进行多序列比对，并与PEG渗透胁迫下蒙古冰草的4个差异表达XTH基因的氨基酸序列用MEGA11.0^［14］的muscle进行多序列比对，用相邻连接法（Neighbor-joining）构建系统进化树。设置参数Boostrap为1 000，其他参数均设为默认。用EvolView（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#mytrees/1/2）^［15］将进化树进行美化。

1.3　蒙古冰草抗旱相关的XTH编码蛋白的二、三级结构预测

利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）对蒙古冰草抗旱相关的4个XTH基因二级结构预测分析，并用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在线软件的同源建模法对其三级结构进行预测分析。

1.4　蒙古冰草抗旱相关的XTH基因表达分析

用SnapGene 3.2.1对筛选出的蒙古冰草XTH基因设计特异性引物，以U6作为内参基因，并委托生工（Sangon，上海）合成，引物序列见表1。用FastQuant RT Kit（with gDNase）试剂盒（KR106）将蒙古冰草处理组及对照组的Total RNA反转录为cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂盒（MQ10201S）进行qRT-PCR试验，每个处理3个生物学重复和4次技术重复。反应体系为MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂10 μL，cDNA模板1.2 μL，上下游引物（0.2 μmol/L）各0.4 μL，Nuclease-Free water 8 μL。反应程序为预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，退火温度在55~57 ℃，反应时间为10 s，延伸72 ℃ 30 s，循环数为40。采用2^-ΔΔCt法^［25］计算基因的相对表达量，并通过SPSS 26.0软件进行表达量差异显著分析。

2　结果与分析

2.1　蒙古冰草XTH基因鉴定及序列

从蒙古冰草转录组测序数据组装的41 793个Unigenes中，筛选出22个XTH基因，通过CDD（Conserved domains）保守结构域预测分析，获得7个具有XTH完整结构域的基因。7个蒙古冰草的XTH基因编码氨基酸数目位于70~357 aa，相对分子质量为7.67~39.46 ku。理论等电点为4.67~9.81，有5个XTH基因理论等电点<7，呈酸性；仅有2个XTH基因理论等电点>7，呈碱性（表2）。脂肪指数最小为42.00，最大值为64.73；XTH基因总平均亲水性全部<0，表现为亲水性。对7个蒙古冰草XTH基因进行亚细胞定位分析，发现有6个XTH基因定位在细胞壁中，只有AmXTH‑1定位在细胞壁和细胞质中（表2）。

对蒙古冰草XTH基因保守基序分析发现3种motif（图1），且不同的XTH基因的motif数量和种类有所差异。AmXTH‑1、AmXTH22‑3、AmXTH8‑1和AmXTH8‑5同时含有motif1、motif2和motif3，AmXTH22‑2仅含有motif3。motif1、motif2和motif3同时出现的次数最多，推测motif1、motif2和motif3是蒙古冰草XTH基因的特征保守基序（图2）。此外，AmXTH30和AmXTH28‑1均含有motif1和motif2。

通过DNAMAN软件进行多序列比对（图3）。7个蒙古冰草XTH基因编码的氨基酸序列与12个已知的具有抗旱功能的XTH基因的氨基酸序列的相似度为38.21%。将7个蒙古冰草XTH基因分别与已知具有抗旱功能的XTH基因比对发现，与大麦HvXTH1基因的氨基酸序列相似度最高，为42.40%；与水稻OsXTH28基因的氨基酸序列相似度最低，为28.21%。7个蒙古冰草均具有DEIDFEFLG保守基序，该基序被认为是XTH的典型结构和活性中心。

2.2　蒙古冰草抗旱相关的XTH基因进化关系分析

在PEG渗透胁迫下，转录组测序结果表明AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1这4个蒙古冰草的XTH基因是差异表达基因，因此将这4个基因与AtXTH10、TaXTH‑7A和OsXTH8等12个具有抗旱功能的XTH基因进行进化关系分析（图4）。结果将XTH分为5个亚族，其中第Ⅲ亚族和第Ⅴ亚族不含有本研究筛选的4个差异表达的蒙古冰草XTH基因。第Ⅱ、Ⅳ亚族各有1个蒙古冰草XTH基因，分别为AmXTH8‑1和AmXTH‑1。AmXTH28‑1和AmXTH30划分在第Ⅰ亚族，其中AmXTH28‑1与OsXTH28聚为一个分支，AmXTH30与OsXTH24聚为一个分支。AmXTH‑1被划分在第Ⅳ亚族，与SiXTH8聚为一个分支。AmXTH8‑1划分在第Ⅱ亚族，与HvXTH1聚为一个分支。因此推测蒙古冰草AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1可能参与干旱胁迫响应。

2.3　蒙古冰草抗旱相关的XTH编码蛋白的二、三级结构

对蒙古冰草AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1编码蛋白的二级结构进行预测（图5），主要以无规则卷曲为主，分别占44.26%、42.86%、48.64%和46.10%；其次是α-螺旋，分别占22.13%、20.63%、13.27%和15.60%；延伸链分别占26.61%、27.94%、31.29%和31.91%；β-转角别占7.00%、8.57%、6.80%和6.38%。

根据SWISS-MODEL的同源建模法对AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1编码蛋白的三级结构建模（图6）。4个XTH基因聚合状态均为单体，其三级结构都具有无规则卷曲、α-螺旋和β-转角的空间结构，与二级结构预测相吻合，都能够不同程度的匹配到木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶。

2.4　蒙古冰草抗旱相关XTH基因的表达分析

对筛选出的与抗旱相关的4个蒙古冰草XTH基因进行qRT-PCR分析（图7）。PEG渗透胁迫下，AmXTH8‑1和AmXTH30基因在PEG渗透胁迫d₁时期呈现上调表达，其余时期均呈现下调表达；AmXTH‑1呈现下调表达；AmXTH‑1、AmXTH8‑1和AmXTH30基因均在f₁时期表达量最低，AmXTH28‑1在渗透胁迫d₅时期表达量最低。在0.05水平上，AmXTH‑1干旱处理各时期相对表达量与CK均存在显著性差异，AmXTH8‑1和AmXTH28‑1在干旱处理d₃、d₅、d₇、f₁时期相对表达量与CK均存在显著性差异，AmXTH30在干旱处理d₁、d₅、d₇、f₁时相对表达量与CK存在显著性差异。4个蒙古冰草XTH基因的qRT-PCR趋势与转录组数据趋势大致相同。通过qRT-PCR分析，蒙古冰草差异表达的4个XTH基因呈现下调表达，说明蒙古冰草XTH基因参与蒙古冰草对干旱胁迫的响应。

3　讨 论

本研究从蒙古冰草转录组测序得到的Unigenes数据中筛选获得22条与抗旱相关的XTH基因，其中7个XTH基因具有完整的结构域。生物信息学分析发现7个蒙古冰草XTH基因均属于亲水性，与甜菜（Beta Vulgaris L.）^［22］、人参（Panax ginseng C. A. Mey.）^［23］、苹果（Malus pumila）^［24］等对XTH基因亲疏水性的研究结果一致。亚细胞定位发现蒙古冰草XTH基因主要定位在细胞壁中，只有1个定位在细胞壁和细胞质中，说明大部分XTH基因在细胞壁中发挥作用，少数在细胞质中行使功能，这与柿子（Diospyroskaki）DkXTH6^［26］、桃（Prunus persica L.）PpXTH33^［21］、荷花（Nelumbo nucifera）NnXTH6^［27］等基因的亚细胞定位结构一致。将7个蒙古冰草XTH基因的氨基酸序列与已知具有抗旱功能的XTH基因的氨基酸序列进行比对发现，其N端具有糖基化位点 NXT/S 和典型的木葡聚糖内糖基转移酶 XET 催化活性的基序（DEIDFEFLG），C端具有可以形成二硫键且有利于XTH蛋白结构稳定的高度保守的半胱氨酸位点等典型的XET特征结构。

XTH基因在植物生长发育和抵御外界胁迫发挥着不同的作用。蒙古冰草XTH基因和已知具有抗旱功能的XTH基因进行系统进化关系分析，谷子SiXTH8、SiXTH5和SiXTH2等基因的启动子区域分析中，绝大部分基因在启动子区含有与响应逆境胁迫有关的顺式作用元件^［28］。ABRE（ABA-responsive element）及光响应元件在植物受非生物逆境胁迫的过程中发挥一定作用^［29］。ABRE对ABA响应诱导大量特异蛋白产生一系列的植物内调节作用；MeJA是植物响应病虫害及机械伤害的元件，同时参与调节作物的生长和发育^［30］。将HvXTH1基因转入到西藏野生大麦耐旱基因型XZ5中，经过不同浓度的PEG模拟干旱处理不同时间后，发现HvXTH1对不同浓度不同处理时间的PEG响应不同，5% PEG-6000干旱处理的表达量变化更为剧烈。水稻OsXTH24和OsXTH28基因的表达量随着干旱胁迫的发展而显著下调。这些被证明与干旱胁迫响应相关的XTH基因均与蒙古冰草XTH基因有较高的同源性，进而推测蒙古冰草的AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1基因也具有相似功能，可能参与干旱胁迫。

元香梅等^［19］通过qRT-PCR分析结果表明，谷子SiXTH9基因在谷子的抗旱品种中相对表达量显著下调；付曼曼^［31］对大麦HvXTH家族成员干旱响应情况分析发现HvXTH17、HvXTH18、HvXTH19、HvXTH20、HvXTH21和HvXTH23均为下调表达。本研究中，PEG渗透胁迫下qRT-PCR分析表明AmXTH30、AmXTH28‑1、AmXTH‑1和AmXTH8‑1均呈现下调表达，与前人研究一致。这些基因如何参与干旱胁迫响应有待进一步试验验证。

4　结 论

本研究基于蒙古冰草转录组测序数据筛选出7个具有完整结构域的XTH基因，通过对其保守基序、进化关系及表达分析，获得4个可能具有抗旱功能的蒙古冰草XTH基因，其二、三级结构主要以无规则卷曲为主。对差异表达的4个XTH基因进行qRT-PCR分析，表明4个XTH基因均呈下调表达，推测蒙古冰草中差异表达的4个XTH基因在响应干旱胁迫中起负调控作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32360338)