贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种根际土壤AMF群落多样性和组成

Diversity and structure of arbuscular mycorrhizal fungi communities in rhizosphere soil of different wine grape varieties in the eastern foot of Helan Mountain

摘要

为明确酿酒葡萄共生丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的定殖情况和群落多样性，采集来自宁夏贺兰山东麓地区3个主栽酿酒葡萄品种（‘赤霞珠’‘美乐’‘霞多丽’）不同土壤深度（0~20、20~40和40~60 cm）的根段和根际土壤样品，利用醋酸-墨水染色法观察酿酒葡萄根系的AMF侵染状况，采用Illumina MiSeq高通量测序技术全面分析酿酒葡萄根际AMF群落组成与多样性。结果表明：AMF可与酿酒葡萄建立良好的共生关系，定殖于酿酒葡萄根系并形成Arum-type结构。所有土壤样品注释到的AMF共有64个OTUs，分属于1门、3纲、5目、7科、7属和32种。‘赤霞珠’根际土壤AMF的丰富度最高，‘美乐’的群落多样性和均匀度最高，‘霞多丽’的谱系多样性最高。0~20 cm根际土壤AMF的群落多样性、丰富度和均匀度最高，20~40 cm的谱系多样性最高。球囊霉属（Glomus）是3个品种和3个土壤深度间的优势属。‘霞多丽’品种在不同的土壤深度下识别出AMF生物标记物。品种是解释酿酒葡萄根际土壤AMF群落变异的重要因素。本研究为未来探索AMF在提高酿酒葡萄产量、品质和可持续性方面的有益应用提供了坚实的基础。

Abstract

The purpose of this study was to clarify the colonization and community diversity of symbiotic Arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） in wine grapes. The roots and rhizosphere soil samples at a range of soil depths （0‑20， 20‑40， and 40‑60 cm） of three major wine grape varieties （Cabernet Sauvignon， Merlot， and Chardonnay） were collected from the eastern foot of Helan Mountain in Ningxia， China. Acetic acid-ink staining method was used to observe the AMF infection status of wine grape roots. Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology was used to comprehensively analyze the composition and diversity of AMF communities in the rhizosphere of wine grapes. The results showed that： AMF could establish a good symbiotic relationship with wine grapes， colonize in grape roots and form Arum-type structure. A total of 64 operational taxonomic units （OTUs） were obtained and further classified into 1 phylum， 3 classes， 5 orders， 7 families， 7 genera， and 32 species. Cabernet Sauvignon had the highest AMF community richness in rhizosphere soil，and Merlot had the highest community diversity， richness， and evenness， and Chardonnay had the highest pedigree diversity. The community diversity， richness， and evenness of AMF in the rhizosphere soil of 0 to 20 cm were the highest， and the pedigree diversity of 20 to 40 cm was the highest. Glomus was the dominant genera of AMF among 3 varieties and 3 soil depths. Only Chardonnay recognized AMF biomarkers in different soil depths. Variety was the main factor affecting the variation of the AMF community in the rhizosphere soil of wine grapes. In conclusion， this research provides a firm foundation for future exploration on the beneficial use of AMF in enhancing grapevine production， quality， and sustainability.

Graphical abstract

关键词

丛枝菌根真菌 / 高通量测序 / 酿酒葡萄品种 / 土壤深度 / 共生 / 球囊霉属

Key words

arbuscular mycorrhizal fungi（AMF） / Illumina MiSeq / wine grape variety / soil depth / symbiosis / Glomus

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）属球囊菌门专性营养共生真菌，广泛存在于各类生态系统土壤中，能与80%以上的陆地高等植物根系形成互惠共生体^［1-2］。相关研究表明，AMF具有丰富的多样性，其群落组成会受到管理措施、寄主植物和环境条件等因素的影响^［3-6］。AMF具有特殊的生物学特征和重要的生态功能，作为土壤微生物的重要组成部分发挥着关键作用。AMF可以通过形成复杂的菌丝网络有效促进植物对水分和矿物养分的吸收利用^［7］，有助于植物的生长发育，增强植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力^［8-9］，影响植物的次生代谢过程，并直接或间接地影响着不同生态系统的植物群落结构、多样性和生产力^［10-11］，是目前探究和利用有益微生物资源研究的热点。

葡萄（Vitis vinifera L.）为葡萄科葡萄属藤本植物，种植历史悠久，是栽培最广泛的水果作物之一，具有较高的营养价值^［12］。近年来，对酿酒葡萄的研究主要集中在采后技术、病虫害防治、化合物、品种选育和葡萄酒香气等方面^［13-17］，对其有益微生物资源尤其是共生AMF多样性的报道相对缺乏。Schreiner等^［18］在2009年研究发现葡萄园葡萄根系AMF的多样性受到土壤和葡萄年龄的影响，但无明显季节性变化，并于2020年研究得到土壤深度、管理区域和栽培年份对葡萄根系AMF群落有影响^［19］。宁夏贺兰山东麓是中国葡萄酒地理标志产品保护区之一^［20］，地处世界葡萄种植的黄金地带，在国际具有较高的知名度和美誉度^［21］。房玉林等^［22］对中国西北5个不同葡萄园酿酒葡萄‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）根系AMF的空间分布进行研究，初步证实葡萄与AMF具有良好的共生关系，球囊霉属（Glomus）占绝对优势；其中在宁夏贺兰山东麓地区的葡萄根际鉴定到了Septoglomus constrictum、Rhizophagus intraradices、Funneliformis mosseae和G.versiforme等常见种，Claroideoglomus claroideum、Funneliformis coronatum、C. etunicatum、C. luteum、Acaulospora rehmii和A. rugosa等稀有种。然而该地区不同酿酒葡萄品种及其根系在不同土壤深度中AMF的定殖、二者协同进化产生的具有宿主特异性的菌根真菌多样性和群落组成尚未见报道。

利用高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）探索AMF多样性正成为一种越来越流行的方法，因其具有测序速度快、高通量和低操作成本的优点^［23］，目前已广泛应用于环境修复、农业和林业的AMF研究中^［24-26］。高通量测序技术不仅丰富和完善了AMF的分类体系，而且能够准确地评估宿主植物中AMF的多样性和群落分布^［6］，已在苹果（Malus pumila）、玉米（Zea mays L.）和水稻（Oryza sativa L.）等宿主植物中得到应用^［27-29］。AMF能够与宁夏酿酒葡萄建立良好的共生关系^［22］，但不同品种和土壤深度对酿酒葡萄根际土壤AMF多样性的影响尚不明确。本研究首次采用高通量测序方法对宁夏贺兰山东麓地区酿酒葡萄品种‘赤霞珠’、‘美乐’（Merlot）、‘霞多丽’（Chardonnay）不同土壤深度的根系和根际土壤进行研究，以期探究酿酒葡萄根系AMF的定殖规律，明确酿酒葡萄根际土壤AMF多样性和群落组成分布，为充分利用AMF资源及研发酿酒葡萄专用菌肥提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　研究区概况

宁夏志辉源石酒庄（38°34′18″ N， 106°01′43″ E，海拔1 164 m）位于宁夏贺兰山东麓产区，地处中国西北干旱区、东部季风区和青藏高寒区的交汇地带。气候干燥凉爽，光照充足，昼夜温差大，年平均气温9.8 ℃，年降水量190 mm，年日照时数3 032 h，病虫害少。土壤类型为淡灰钙土、风沙土，且有黄河水灌溉之利。葡萄园面积近1 300 hm²，主栽品种有‘赤霞珠’‘美乐’‘霞多丽’等，树龄10年。

1.2　试验设计及土样采集

本试验于2021年8月在宁夏志辉源石酒庄采集酿酒葡萄根段和根际土样品。选取培育酿酒葡萄品种为‘赤霞珠’（CXZ）、‘美乐’（ML）、‘霞多丽’（XDL）的3个样地，各样地面积约6.67~8.00 hm²，生态环境条件一致，且栽培管理措施相同。在采样之前，提前挖掘该酒庄3个品种的酿酒葡萄根系进行初步观察，发现其根系主要集中分布在地表垂直向下0~60 cm。因此，本研究确定了酿酒葡萄的根和根际土采样范围为土壤表面以下0~60 cm。

每个样地采用对角线采样法设置3个采样点，采样点面积为20 m×20 m，各采样点间隔至少>100 m。每个采样点随机选择3株长势良好的酿酒葡萄植株，在距酿酒葡萄植株主干东西南北4个方位水平方向约0~30 cm内，除去表层碎石及枯枝杂草，垂直向下按0~20 cm（d1）、20~40 cm（d2）和40~60 cm（d3）3个土层挖取酿酒葡萄根段和根际土壤样品。附着在根上的土壤被定义为根际土壤^［30］。参考Liu等^［31］的方法，根际土壤取样即轻轻地抖落根部周围的大块土壤，用无菌小毛刷刷下紧紧附着在根表面的土壤，然后将其通过1 mm的筛网除去根部碎屑。每个样本中的根际土壤充分混合后，采用四分法保留5 g，放入带有编号的2 mL灭菌离心管，于冰盒中带回实验室，-80 ℃冷冻保存用于高通量测序。用无菌剪刀剪下葡萄根段，用无菌水冲洗干净，保存于FAA固定液（V（38%甲醛）∶V（冰醋酸）∶V（75%乙醇）=1∶1∶18）中，用于AMF的形态结构观察和定殖状况检测。在3个品种酿酒葡萄的3块样地的3个土壤深度中共采集27份根段样品和27份土壤样品。

1.3　酿酒葡萄根系中AMF侵染测定及观察

样品参照Phillips等^［32］的方法进行染色。从FAA固定液取出根段，将根段剪成1 cm，每个样品选择100根移入10% KOH中，90 ℃水浴1 h，乳酸酸化5~10 min，利用5%醋酸-墨水染色液（白醋95 mL，Quink墨水5 mL）染色5 min，乳酸甘油（V（乳酸）∶V（甘油）=1∶1）脱色12 h。脱色完成后，于Olympus BX53（奥林巴斯株式会社，日本）显微镜下观察AMF侵染状况、定殖结构并拍照，每个根段观测30个视野，计算根系AMF总定殖率和定殖强度^［33-34］。计算公式如下：

总定殖率=（丛枝视野数+泡囊视野数+菌丝视野数）/总视野数×100%（1）

\mathrm{定殖}\mathrm{强度}=\frac{\sum \left(\frac{\mathrm{每根}\mathrm{段被}\mathrm{侵染}\mathrm{长度}}{\mathrm{每根}\mathrm{段总}\mathrm{长度}}\right)}{\mathrm{被侵}\mathrm{染根}\mathrm{段总}\mathrm{数}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

1.4　土壤基因组DNA提取、PCR扩增及测序

利用基因组DNA提取试剂盒（Fast DNA® SPIN Kit for Soil（QBIOgene Inc.，Carlsbad，CA，USA））提取土壤总DNA，使用ABI GeneAmp® 9700型PCR仪器进行DNA扩增试验。采用2对特异性引物进行PCR扩增，第一轮扩增引物为AML1（5'-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3'）和AML2（5'-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3'）^［35］。第二轮引物为AMV4-5NF（5'-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3'）和AMDGR（5'-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3'）^［5］。20 μL反应体系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L正反引物各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板10 ng/L，ddH₂O补足至20 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min，10 ℃保温。一轮引物：AML1F/AML2R，退火温度55 ℃，循环数为32 cycles。二轮引物：AMV4-5NF/AMDGR，退火温度55 ℃，循环数为20 cycles。PCR产物于2%琼脂凝胶电泳上样3 μL进行检测。上述工作由上海美吉生物医药科技有限公司协助完成，原始数据已上传至GenBank，项目登录号为PRJNA966782。

1.5　生物学信息分析

使用FLASH（version 1.2.7）对MiSeq测序得到双端序列数据，根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，同时使用fastp（version 0.19.6）软件对其进行质控过滤。使用UPARSE软件（version 7.1）按照97%的相似度对序列进行OTU聚类。采用RDP classifier贝叶斯算法（version 2.11）在18S rRNA数据库上对每个OTU代表序列进行物种注释分析^［36］。

1.6　数据分析

采用Mothur软件（version v.1.30.2）计算Alpha多样性指数。采用SPSS 23.0邓肯多重比较（Duncan's multiple range test）进行AMF总定殖率、定殖强度以及Alpha多样性等样本间双因素差异显著性分析。在不同分类学水平上统计各样本的物种组成及各物种相对丰度，通过群落饼（Pie）图和Bar图可视化呈现不同分组（或样本）优势物种的组成。利用维恩（Venn）图展示不同分组间共有和特有的AMF OTU数目，直观地表现出样品间OTU的重合情况。使用LEfSe多级物种差异判别分析^［37］对样本差异产生显著性影响的菌群。基于Qiime软件（version 1.9.1）计算Beta多样性距离矩阵，综合ANOSIM组间差异检验结果，构建主坐标分析（PCoA）图，以此揭示样品间菌群差异^［38］。Permanova即置换多元方差分析（permutational MANOVA），即利用半度量（如Bray-Curtis）或度量距离矩阵（如Euclidean）对总方差进行分解，分析不同分组因素对样品差异的解释度^［39］，并使用置换检验对划分的统计学意义进行显著性分析。上述所有数据处理和生物多样性分析均在Majorbio生信云平台（http：//www.majorbio.com/）完成。

2　结果与分析

2.1　酿酒葡萄根系AMF定殖状况分析

3个酿酒葡萄品种‘赤霞珠’‘美乐’‘霞多丽’根系均能被AMF侵染形成丛枝菌根结构，结构类型为疆南星型（Arum-type，A-型，图1）。AMF定殖于酿酒葡萄根系皮层细胞间隙，延伸生长形成大量胞间菌丝，呈直线形（图1（a₄））、二叉状分枝（图1（a₁）、（b₁）~（b₃））或树枝状（图1（a₁）、（c₁）和（c₂）），之后菌丝连续二分叉式生长形成丛枝（图1（a₁））。菌丝顶端膨胀在细胞内和细胞间隙内形成大小不等、形态多样的泡囊，泡囊多为纺锤形（图1（a₄））、圆形（图1（b₄）和（c₄））、椭圆形（图1（a₃））、矩形（图1（c₃））或不规则形（图1（b₃）），有的泡囊中有内含物（图1（b₄）和（c₄））。不同品种酿酒葡萄品种菌丝形态和泡囊密集程度不同。‘赤霞珠’根系中菌丝多为直线型，‘美乐’多为二叉型，‘霞多丽’多为树枝状，3个酿酒葡萄品种根系泡囊密集程度主要表现为‘赤霞珠’>‘美乐’>‘霞多丽’。

酿酒葡萄AMF在不同品种和不同土壤深度间的定殖状况存在显著性差异（P<0.05，表1）。3个品种间，‘美乐’根系AMF的总定殖率（30.78%）和定殖强度（42.08%）最高，‘霞多丽’的最低。在土壤深度为20~40 cm时，酿酒葡萄根系AMF的总定殖率（31.89%）和定殖强度（40.1%）最高。‘赤霞珠’‘美乐’葡萄根系AMF的总定殖率和定殖强度均随着土壤深度的增加先增加后降低，‘霞多丽’葡萄根系AMF的总定殖率和定殖强度均随着土壤深度的增加逐渐降低。

2.2　酿酒葡萄根际土壤AMF测序结果与α多样性分析

对酿酒葡萄根际土壤的AMF进行高通量测序，共获得有效序列562 284条，碱基数121 210 743个，平均序列长度为216 bp。基于97%相似度的分类水平，共注释得到64个OTUs，分属于1门、3纲、5目、7科、7属、32种。

采用群落多样性（Shannon指数）、丰富度（Ace指数）、均匀度（Shannoneven指数）和物种的谱系多样性（PD指数）评估不同酿酒葡萄品种在不同土壤深度根际土壤AMF群落结构的α多样性（图2和表2）。3个酿酒葡萄品种根际土壤AMF的群落多样性、均匀度有显著差异（P<0.05），而丰富度和物种的谱系多样性无显著差异。‘美乐’根际土壤AMF的Shannon指数、Ace指数和Shannoneven指数最大，‘霞多丽’的Pd指数最大，表明‘美乐’的群落多样性、丰富度和均匀度最高，‘霞多丽’的谱系多样性最高（图2（a）~（d））。在3个土壤深度间，酿酒葡萄根际土壤AMF的群落多样性、丰富度、均匀度和物种的谱系多样性均有显著差异。0~20 cm根际土壤AMF的Shannon指数、Ace指数和Shannoneven指数最大，20~40 cm的Pd指数最大，表明0~20 cm根际土壤AMF、群落多样性、丰富度和均匀度最高，20~40 cm土壤谱系多样性最高（图2（e）~（h））。不同品种根际AMF的Ace指数和PD指数随土壤深度变化不存在显著差异（P<0.05），说明AMF的群落丰富度和物种的谱系多样性受土壤深度影响较小。除‘美乐’外，‘赤霞珠’‘霞多丽’AMF的Shannon指数和Shannoneven指数存在显著差异（P<0.05），且随土壤深度变化整体呈现下降趋势（表2），说明土壤深度可能影响酿酒葡萄根际AMF的群落多样性和均匀度。

2.3　酿酒葡萄根际土壤AMF群落的组成和分布

酿酒葡萄根际土壤AMF共鉴定出1门、3纲、5目、7科、7属、32种。在属水平上，相对丰度较高的4个属有球囊霉属（78.78%~99.96%）、近明球囊霉属（Claroideoglomus，0.54%~16.29%）、球囊菌门未定属（unclassified Glomeromycota，0.01%~2.73%）和多样孢囊霉属（Diversipora，0.03%~2.18%，图3（a））。在种水平上，相对丰度较高的4个种有unclassified Glomus（33.92%~88.18%）、sp. VTX00304（2.97%~48.78%）、sp. VTX00067（0.86%~30.55%）和MO-G6 VTX00214（9.44%~22.37%，图3（b））。3个酿酒葡萄品种不同土壤深度的根际土壤样品中AMF群落组成和优势属存在明显差异。球囊霉属和unclassified Glomus的丰度在3个品种和3个土壤深度间均为最高，占绝对优势。

2.4　酿酒葡萄根际土壤AMF的核心物种分析

目前定义核心菌群采用的分析方法是“成员法”，成员法是通过比较宿主微生物组中是否存在共有的OTU来确定核心微生物组^［40］。Venn图直观地展现了酿酒葡萄品种和土壤深度土壤样本AMF所共有和独有的OTU数量，各AMF群落之间既存在一定程度的交集，又彼此独立（图4）。总体而言，3个品种特有的OTU分别是CXZ 7个、ML 6个和XDL 14个；共有的OTU是24个，代表了品种的核心微生物群（图4（a））。3个土壤深度特有的OTU分别是d1 10个、d2 4个、d3 4个；共有的OTU是32个，代表了土层核心微生物群（图4（b））。每个酿酒葡萄品种不同土壤深度AMF的特有和共有OTU如图4（c）~（e）所示。共有的OTU在分类上是多样化的（图4（f）），但大多数均属于Glomus，仅土层的核心微生物中含Diversispora。

2.5　酿酒葡萄根际土壤AMF的生物标记物分析

LEfSe分析用于识别酿酒葡萄根际土壤的生物标记物，即组间具有显著差异的物种^［37］。就品种而言（图5（a）），在OTU水平上，‘美乐’的生物标志物丰度最高，unclassified Glomus、OTU2和OTU26在‘赤霞珠’根际土壤中显著富集（P<0.05），OTU38、OTU10、sp. VTX00287和OTU43在‘美乐’根际土壤中显著富集，OTU53、sp. VTX00214、OTU52、sp. VTX00304和OTU9在‘霞多丽’中显著富集（P<0.05）。在不同的土壤深度下（图5（b）），仅有‘霞多丽’品种识别出生物标记物，Glomeromycetes、Glomeraceae和Glomus在0~20 cm土层显著富集（P<0.05），VTX00304在20~40 cm土层显著富集，unclassified Glomeromycota在40~60 cm土层显著富集（P<0.05）。

2.6　酿酒葡萄根际土壤AMF β多样性分析

在OTU水平评估不同酿酒葡萄品种根际土壤AMF群落的β多样性（图6）。通过bray-curtis距离算法进行主坐标分析（PCoA，图6（a）），PC1、PC2分别解释了总变异的26.5%和18.33%，总解释度为44.83%（R=0.590 8，P=0.001）。非度量多维标度（NMDS）排序分析显示stress=0.153，R=0.590 8，P=0.001（图6（b））。3个酿酒葡萄品种分别形成了不同的聚集群，其中‘美乐’‘霞多丽’的AMF群落相距最远，表明两者AMF群落结构相似性低，差异最大；‘赤霞珠’‘美乐’AMF群落部分重叠，表明两者菌群结构差异较小。而3个不同土壤深度的AMF群落重叠部分较大，表明3个不同的土壤深度AMF群落结构无明显差异（图6（c）~（e））。这些结果通过酿酒葡萄品种和土壤深度之间AMF群落结构的ADONIS成对比较得到证实（表3）。PERMANOVA分析（表4）揭示不同品种对于酿酒葡萄菌群差异的解释度（0.43）和可信度（0.001）较高，而土壤深度对于AMF群落结构差异的解释度（0.09）和可信度较低（0.30）。上述分析表明，品种是解释酿酒葡萄根际土壤AMF群落变异的重要因素。

3　讨 论

3.1　AMF侵染酿酒葡萄根系的特征

AMF能与陆地生态系统中80%左右的植物形成菌根联合体^［41］，是根际微生物群落的重要组成部分。本研究中，AMF侵染酿酒葡萄根系形成丛枝菌根，总定殖率为15.83%~36.59%，定殖强度为25.13%~42.08%，表明AMF与3个不同酿酒葡萄品种在不同深度采集的根系均能建立共生关系。AMF侵染酿酒葡萄根系形成典型的Arum-type结构。丛枝为AMF结构的关键特征和最重要的结构，包括疆南星型（Arum-type，A 型）、重楼型（Paris-type，P型）以及中间类型（Intermediate type，I型）^［42］。在自然植物群落中，中间类型较为少见，主要见于豆科、大戟科和唇形科等中的部分植物种类；P型较为多见，尤其在苔鲜、蕨类植物、裸子植物和野生的被子植物中占主导地位；而A-型则常见于栽培植物中^［42］。酿酒葡萄长久以来是栽培经济果树之一，这可以解释为何A-型是酿酒葡萄中AMF的主要侵染类型。

3.2　高通量测序技术在获取AMF生物多样性信息方面的应用

研究AMF的方法包括孢子鉴定工作和分子分析^［43-44］。然而，孢子鉴定是一项时间和能量密集型任务，易受区域变化、宿主物种、微生物年龄和孢子形态的可变性影响，因此区分相似物种的孢子具有挑战性^［36］。相比之下，高通量测序是研究AMF群落结构和多样性的一种越来越稳健和普遍的方法^［45-47］。本研究首次采用高通量测序技术从基因组水平对宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄根际土壤AMF的多样性和群落结构进行分析，共检测到1门、3纲、5目、7科、7属、32种、64个OTUs，表明酿酒葡萄根际土壤具有丰富的AMF物种多样性。

3.3　宿主植物对AMF多样性和群落结构的影响

宿主植物影响AMF多样性和群落结构^［4］。Kumar等^［48］研究表明，相较于荔枝树空间分布、树龄和田间管理措施，品种对荔枝树AMF的定殖率影响更大。吕燕等^［49］利用高通量测序技术比较分析了不同品种宁夏枸杞根系AMF多样性，发现品种影响宁夏枸杞根系AMF群落α多样性、优势种，但不影响β-多样性。本研究中3个酿酒葡萄品种根际土壤AMF的总定殖率和定殖强度差异显著，‘美乐’最高，且其群落多样性（Shannon指数）、均匀度（Shannoneven指数）也显著高于其他品种，表明酿酒葡萄的品种是影响AMF定殖和α多样性的重要因素，这与吕燕等^［49］研究结果一致，说明‘美乐’可能是AMF的最佳宿主植物。不同品种中AMF菌群的相对丰度存在一定差异，LEfSe分析所识别到的生物标记物也显著不同，表明不同品种酿酒葡萄AMF群落组成差异明显。此外，3个酿酒葡萄品种根际土壤的β多样性显示‘赤霞珠’‘美乐’‘霞多丽’分别形成了不同的聚集群，且不同品种对于酿酒葡萄菌群差异的解释度和可信度更高，表明品种是解释酿酒葡萄根际土壤AMF群落变化的因素。在物种水平上，不同种寄主植物生理代谢、根系内环境及分泌物不同，必然会影响AMF的侵染策略，从而改变其群落组成^［11］。

3.4　土壤深度对AMF多样性的影响

作为一类重要的土壤微生物，AMF多样性也受到土壤因子的调节。本研究中AMF定殖情况、多样性和群落组成在不同土壤深度有差异，在0~20 cm处较高，随着土壤深度的增加整体呈现下降趋势。这可能是植物残留物通常积聚在土壤表面的结果，这些残留物与土壤高养分含量、良好的通风和有利的水热条件有关，这些条件有利于土壤微生物的生长^［36］。此外，土壤特性（如pH、水分和养分含量）已被确定为AMF物种发生和相对丰度的重要影响因子^［50］。未来可进一步测定土壤的理化性质和酶活等指标，以探索酿酒葡萄AMF多样性与土壤因子的相关性。

3.5　球囊霉属和多样孢囊霉属的功能及应用

据相关报道，球囊霉属在酿酒葡萄根际土壤中高度富集，为进一步研究其特定生态功能提供了有用的信息^{［22，51］}。本研究得到了同样的结论，球囊霉属和多样孢囊霉属不仅是酿酒葡萄根际土壤的优势属，也是核心微生物群，两者在植物生防领域发挥着积极作用。房玉林等^［52］研究发现，给‘赤霞珠’扦插苗接种变形球囊霉（G. versiforme）能促进葡萄幼苗的生长发育。Villani等^［53］研究证明接种AMF黏质隔球囊霉（G. viscosum）能够增强受大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）影响的朝鲜蓟植株的防御抗氧化系统，缓解其氧化应激症状。此外，Wang等^［54］研究发现在中等程度的盐胁迫下，D. versiformis的定殖提高了杭白菊的生长和根系氮吸收。D. versiformis和钠膨润土的联合施用还能够显著改善植物的土壤结构和磷利用率^［55］。AMF是否能促进贺兰山东麓地区酿酒葡萄生长发育还有待进一步研究。

3.6　酿酒葡萄共生AMF资源开发利用的展望

AMF在葡萄园生态系统中发挥越来越重要的作用，对葡萄栽培具有有益的影响^［56］。本研究对宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄共生AMF资源的开发利用具有重要意义，未来可从以下方面进行深入研究：1）挖掘有益的核心或关键AMF菌株，为葡萄植株在减少肥力需求、增强营养元素的吸收、增强抵御生物胁迫或非生物胁迫、改善土壤结构等可持续栽培育种方面提供依据；2）利用AMF调节葡萄果实的酚类代谢（如花青素）和化学成分（如苹果酸和酒石酸等游离有机酸）来促进葡萄果实品质的改良；3）研究AMF对葡萄植株中氨基酸或挥发性化合物等的影响，或许可以提高葡萄酒口感风味和芳香特性，催进葡萄酒产业的发展。

4　结 论

本研究利用Illumina MiSeq高通量测序技术分析了宁夏贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种根际AMF在不同土壤深度的群落组成与多样性，为未来研究酿酒葡萄AMF的功能和探索AMF在提高酿酒葡萄产量、品质和可持续性方面的有益应用提供了参考依据。主要结论如下：

1）AMF与3个不同酿酒葡萄品种根系均能建立良好的共生关系，并形成典型的Arum-type结构。

2）贺兰山东麓酿酒葡萄根际土壤具有丰富的AMF物种多样性，包括1门、3纲、5目、7科、7属、32种、64个OTUs。球囊霉属占主导地位，也是核心微生物群。

3）不同酿酒葡萄品种是影响AMF多样性和分布格局的因素之一，酿酒葡萄栽培品种众多，具有丰富的AMF物种多样性，未来在筛选AMF时应注意到品种与AMF之间的匹配，以达到事半功倍的效果。

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基金资助

宁夏回族自治区重点研发计划项目(2023BCF01026)