猪XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白的制备与鉴定

Preparation and identification of porcine XCR1/FMDV bispecific nanobody fusion protein

摘要

为通过将FMDV抗原靶向提呈至猪DC细胞进而提高疫苗免疫效力，本研究利用原核系统表达了猪XCR1目的蛋白，以该蛋白为免疫原免疫羊驼，提取其外周血淋巴细胞的总mRNA并反转录为cDNA，构建噬菌体展示纳米抗体文库，经过3轮亲和筛选获得猪XCR1特异性纳米抗体；利用SOE-PCR技术将该纳米抗体和猪O型FMDV特异性纳米抗体Nb205连接，构建XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白。结果表明：1）成功原核表达猪XCR1目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot结果显示，其相对分子量大小约35 ku，符合预期。2）羊驼血清效价为1∶64 000，满足建库要求；构建的噬菌体展示文库库容量约为1.91×10⁸ CFU/mL，插入率为91.3%，多样性好；经3轮亲和筛选成功获得了纳米抗体Nb75，间接ELISA结果显示该纳米抗体能特异性与XCR1结合。3）利用SOE-PCR技术成功构建XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白Nb75-205；SDS-PAGE和Western blot显示，该蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，且呈现二聚体结构，间接ELISA结果显示Nb75-205能同时与XCR1目的蛋白和FMDV抗原结合。综上，本研究采用噬菌体展示技术成功获得猪XCR1特异性纳米抗体，并构建XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白Nb75-205，且该蛋白为天然二聚体结构，与XCR1目的蛋白和FMDV抗原均具有较好的结合活性，为进一步开展FMDV抗原的猪XCR1靶向提呈研究奠定基础。

Abstract

In order to enhance the immune efficacy of FMDV vaccine by targeting FMDV to porcine dendritic cells， the target protein XCR1 was expressed using prokaryotic expression technology. Subsequently， alpacas were immunized with XCR1 as an immunogen. The total mRNA of peripheral blood lymphocytes of alpacas was extracted and reverse-transcribed into cDNA. A phage display nanobody library was constructed and XCR1-specific nanobodies were obtained after three rounds of affinity screening. Following this， a bispecific nanobody Nb75-205 targeting both XCR1 and FMDV was constructed by connecting Nb75 with Nb205 anti-FMDV nanobody using SOE-PCR technique. The results showed that： 1） The target protein XCR1 was successfully obtained， SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of this protein was about 35 ku， as expected. 2） Antibody titers of alpacas were 1∶64 000， meeting the requirement for database construction. The phage display library size was approximately 1.91×10⁸ CFU/mL， with an insertion rate of 91.3% and good diversity. After three rounds of affinity screening， the nanobody Nb75 was successfully obtained which could specifically bind to XCR1 as detected by Indirect ELISA. 3）The XCR1/FMDV bispecific nanobody Nb75-205 was constructed through SOE-PCR technique. SDS-PAGE and Western blot results demonstrated that this fusion protein could be expressed in a soluble form in Escherichia coli， with a dimeric structure. Indirect ELISA results indicated that Nb75-205 was capable of binding to both XCR1 target protein and FMDV antigen. In summary， anti-porcine XCR1 nanobody was successfully obtained by phage screening technology， and XCR1/FMDV bispecific nanobody Nb75-205 was successfully constructed through SOE-PCR technology in this study. Nb75-205 was a dimer and could react with both XCR1 and FMDV， which laid a foundation for the further study on the presentation of FMDV targeted by porcine XCR1.

Graphical abstract

关键词

趋化因子受体1 / 双特异纳米抗体 / 二聚体 / FMDV

Key words

chemokine（C-motif）receptor 1 / bispecific nanobody / dimeric protein / FMDV

趋化因子受体1（Chemokine（C-motif）receptor 1，XCR1），属于趋化因子受体家族，作为传统1型树突状细胞（Conventional dendritic cells 1，cDC1）特异性的抗原提呈受体，特异性表达于cDC1表面，且在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（Natural killer cells，NK）、粒细胞、单核细胞和浆细胞样DC（Plasmacytoid dendritic cells，pDC）均不表达，是DC表面高度保守的跨物种分子^［1］，在抗原提呈过程中发挥着重要作用。研究显示，与非靶向抗原相比较，通过将抗原靶向至XCR1，可以提高抗原提呈效率，激活CD4⁺和CD8⁺T细胞应答，在抗病毒感染和肿瘤治疗方面取得了较好的研究进展^［2-5］，XCR1靶向人用疫苗也已进入临床试验阶段^{［1， 6-7］}。猪FMD疫苗在口蹄疫防控中发挥着重要作用，但仍存在抗原免疫剂量较大、不能诱导有效的细胞免疫等不足。XCR1靶向在兽医领域研究日益受到关注，作为新型FMD疫苗研发的一个重要方向，通过将FMDV的OB7蛋白靶向至XCR1，可以在牛体内产生较好的中和抗体水平，但攻毒保护率最高为80%^［8］。目前，抗原的XCR1靶向主要是利用其相应的配体或特异性的单克隆抗体和单链抗体，通过化学偶联或基因融合表达的方法与抗原进行组装而实现^［9-11］，该过程较为繁琐，易影响抗原结构，且现有研究均采用FMDV蛋白质抗原作为靶向抗原，其抗原表位有限，往往不能产生较为理想的免疫效果^［8］。因此，设计更加有效的靶向抗原、探索新的抗原组装策略，对于改善XCR1靶向FMDV的免疫效力具有重要意义。纳米抗体（Nanobody，Nb）作为目前已知的具有完整功能的最小抗原结合片段，与传统抗体相比，具有相对分子质量小（约15 ku）、免疫原性低、亲和性高等特点，已被广泛应用于疾病的诊断、治疗及靶向药物的研制^［12］。纳米抗体在DC靶向研究方面已表现出了较好的应用前景。研究表明，通过制备针对MHCⅡ、CD11b和CD36的特异性纳米抗体，采用流感病毒HA进行DC靶向研究，均可以产生较好的免疫反应，且可以在小鼠体内产生针对流感病毒的攻毒保护作用^［13］。关于XCR1的纳米抗体未见报道。

本研究拟利用噬菌体展示技术筛选获得针对猪XCR1的特异性纳米抗体，代替传统的单克隆抗体及单链抗体，并通过PA连接肽将猪XCR1特异性纳米抗体和猪O型FMDV特异性纳米抗体连接，制备XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白，避免化学偶联或基因融合表达等传统靶向技术对于FMDV抗原结构的影响，同时利用双特异纳米抗体的桥联作用，实现FMDV全病毒代替蛋白质抗原进行靶向，突破FMDV蛋白质抗原表位的单一性和局限性，充分发挥全病毒完整抗原表位的潜能，进一步提高FMDV抗原的免疫效力，为进一步开展猪XCR1靶向FMDV抗原提呈、解析其靶向提呈作用机制奠定了基础，也为新型FMD疫苗设计提供思路和参考。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1 细菌、质粒、病毒、实验动物和主要试剂

大肠杆菌BL21、DH5α、WK6、TG1和质粒pET-32a、pMECS均由本团队保存，猪O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）灭活抗原由中农威特生物科技股份有限公司惠赠，猪O型FMDV纳米抗体Nb205^［14］和连接肽PA^［14］由本团队筛选获得，3只2周龄雌性羊驼由南京市红山动物园提供并饲养。RNA抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA Marker DL2 000、DNA Marker DL10 000、限制性内切酶、T4连接酶、反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Anti-HA tag鼠单抗购自北京康为世纪公司，Anti-his鼠单抗及HRP标记羊抗鼠IgG（H+L）二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 PCR引物的合成

根据NCBI公布的猪XCR1基因序列（登录号为NM_001001622.1），以及本团队保存的Nb205、PA和Nb75的基因序列设计引物（表1），并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2　猪XCR1目的蛋白的原核表达

1.2.1 重组表达载体的构建

利用TRIzol法提取猪脾脏组织的总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模版，采用XCR1的上下游引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物回收后采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切。利用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a载体连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板上，37 ℃培养过夜后随机挑选单菌落进行PCR鉴定，选择阳性克隆送上海生工生物有限公司测序鉴定。

1.2.2 目的蛋白的表达及纯化

将1.2.1测序正确的阳性克隆接种至含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃培养过夜，次日以 1∶500比例接种至LB培养液中，37 ℃ 200 r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5时（约3.5 h），加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行28 ℃低温过夜诱导，诱导结束后收集菌体，用PBS重悬后进行超声破碎，离心收集上清。采用Ni-NTA亲和层析柱对上清进行纯化，利用SDS-PAGE和Western blot对纯化后的猪XCR1目的蛋白进行鉴定。

1.3　猪XCR1目的蛋白特异性纳米抗体的获得

1.3.1 动物免疫

取纯化后的猪XCR1目的蛋白（1 mg）与弗氏完全佐剂等体积混合进行乳化，对3只雌性羊驼进行颈部皮下多点免疫；每周免疫一次，每只羊驼免疫 1 mg，共免疫6次。采用间接ELISA方法测定羊驼血清中抗体效价。

1.3.2 VHH噬菌体展示文库的构建

6免后第3天分离羊驼外周血淋巴细胞，提取其总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模版，分别利用VH-Linge和VHH的上下游引物进行巢氏PCR扩增，获得大小约为350 bp的VHH片段，经Pst Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后连入pMECS载体，并转化至大肠杆菌TG1感受态细胞中，37 ℃培养过夜后，随机挑选单克隆菌落，以VHH的上、下游引物进行PCR鉴定。收集上述平板中的菌落，加入终浓度为30%的甘油，分装保存于∶-80 ℃备用。

1.3.3 文库库容及多样性鉴定

利用1.3.2所构建的噬菌体展示纳米抗体文库进行倍比稀释，并均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜后进行菌落计数，计算出所构建文库的库容，并随机挑选23个单克隆菌落，使用载体特异性引物pMECS进行PCR扩增，鉴定文库的插入率，并将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析，利用MegAlign软件对测试结果进行比对分析，验证所构建文库的多样性。

1.3.4 猪XCR1目的蛋白特异性纳米抗体的筛选

利用1.3.2所构建的噬菌体展示纳米抗体文库，经扩大培养、噬菌体侵染、浓缩纯化及滴度判定后用于第一轮亲和筛选。利用纯化后的猪XCR1目的蛋白作为包被抗原，并设置未包被抗原的对照组，每孔100 μL，4 ℃过夜；次日采用5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤5遍后，每孔加入100 μL稀释后的噬菌体展示文库，室温作用1 h，PBST洗涤5遍后，每孔加入100 μL浓度为100 mmol/L的三乙胺溶液，室温静置10 min，加入200 μL 1 mol/L的Tris-HCl（pH 7.4）进行中和，收集洗脱液进行滴定，计算回收率。重复上述亲和筛选2次，3轮亲和筛选流程如表2所示。

1.3.5 猪XCR1目的蛋白特异性纳米抗体的鉴定

利用纯化后的猪XCR1目的蛋白（1 μg/mL）作为包被抗原，并设置未包被抗原的对照组，每孔100 μL，4 ℃过夜；在各轮次亲和筛选的洗脱产物中随机挑选95个单克隆菌落，分别接种至96孔板37 ℃振荡培养3 h，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，进行28 ℃低温过夜诱导，诱导结束后裂解菌体，离心收集上清，获得纳米抗体粗提物，将各纳米抗体粗提物依次编号为1~95；次日采用5%脱脂乳封闭抗原包被板，PBST洗涤5遍后，分别取100 μL纳米抗体粗提物依次加入各酶标孔，室温孵育1 h；PBST洗涤5次后加入100 μL 1∶2 000稀释的Mouse anti-HA抗体，室温孵育1 h；PBST洗涤5次后加入100 μL 1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG （H+L）二抗，室温孵育1 h；PBST洗涤5次后加入TMB显色液，37 ℃孵育15 min；每孔各加50 μL 2 mol/L的硫酸溶液终止反应，测定其OD₄₅₀值。当样品孔OD₄₅₀数值大于对照孔2.5倍以上时判为阳性，并送至生工生物有工程（上海）限公司测序，根据测序结果进行氨基酸序列分析。

1.4　XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白的制备

1.4.1 XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白重组表达载体的构建

以表达猪XCR1特异性纳米抗体Nb75的质粒为模板，采用Nb75的上、下游引物扩增出纳米抗体Nb75的基因片段；以FMDV纳米抗体Nb205的质粒为模版，采用Nb205的上、下游引物，扩增出纳米抗体Nb205的基因片段。以扩增的Nb75、Nb205和PA基因片段为模板，通过重叠延伸拼接（Splicing by Overlap Extension，SOE） PCR构建双特异纳米抗体片段Nb75-205。Nb75-205经Pst Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后，插入到pMECS载体中，并转化至大肠杆菌WK6感受态细胞中，37 ℃培养过夜。随机挑选单个菌落，经PCR鉴定及测序分析后获得表达双特异纳米抗体的重组菌。

1.4.2 XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白的表达与纯化

将1.4.1获得的重组菌接种至含氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃培养过夜，次日以1∶500的比例接种至TB培养液，37 ℃ 200 r/min振荡培养至OD₆₀₀值达到0.5时（约3.5 h），加入终浓度为 1 mmol/L的IPTG进行28 ℃低温过夜诱导，诱导结束后收集菌体，用PBS重悬后进行超声破碎，离心收集上清。采用Ni-NTA亲和层析柱对上清进行纯化，利用SDS-PAGE和Western blot对纯化后的目的蛋白进行鉴定，为验证所表达的双特异纳米抗体Nb75-205是否为二聚体结构，设置不添加还原剂β-巯基乙醇的样品对照组。

1.4.3 XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白结合活性的鉴定

分别利用纯化后的猪XCR1目的蛋白（1 μg/mL）和猪O型FMDV灭活抗原（1 μg/mL）作为包被抗原，并设置未包被抗原的对照组，每孔100 μL，4 ℃过夜；次日采用5%脱脂乳进行封闭，PBST洗涤5遍后，每孔分别加入100 μL 1 μg/mL的纯化后的Nb75-205，同时分别设置加入Nb75和Nb205的对照组，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤5次后加入100 μL 1∶2 000稀释的Mouse anti-his抗体，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤5次后加入100 μL 1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG （H+L）二抗，37 ℃孵育 1 h；PBST洗涤5次后加入TMB显色液，37 ℃孵育15 min；每孔各加50 μL 2 mol/L的硫酸溶液终止反应，测定各孔OD₄₅₀值。

2　结果与分析

2.1　猪XCR1目的蛋白的表达及纯化

以猪脾脏组织来源的cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因序列，并用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，片段长度930 bp，符合预期目的。测序验证正确的猪XCR1重组表达菌，经诱导表达和镍柱纯化，得到纯化后的猪XCR1目的蛋白，经SDS-PAGE和Western blot鉴定，如图1所示，猪XCR1目的蛋白相对分子量大小约为35 ku，与预期大小一致，纯度在90%以上。

2.2　噬菌体展示纳米抗体文库的构建

利用猪XCR1目的蛋白免疫羊驼，图2为羊驼免疫程序图及噬菌体展示纳米抗体文库构建策略图。经6次免疫后，使用间接ELISA方法测定其抗体效价。如图3所示，羊驼抗体效价可达1∶64 000，满足建库要求。采集6免后的羊驼外周血淋巴细胞，提取总RNA，经反转录获得cDNA，并以其为模板进行PCR扩增，获得纳米抗体基因片段，经酶切、连接和转化后，获得噬菌体展示纳米抗体文库。通过平板计数，测得库容约为1.91×10⁸ CFU/mL，任意选择23个单克隆菌落进行PCR扩增，其中21个单克隆可扩增出大小约为750 bp的目的条带，表明所构建的文库中目的基因的插入率为91.3%（图4），序列比对分析结果显示（图5），所测试克隆的序列框架结构完整，其中CDR3区的氨基酸种类及数量均存在较大差异，表明所构建的文库具有较好的多样性。

2.3　纳米抗体的筛选与鉴定

利用纯化后的猪XCR1目的蛋白作为包被抗原，经过3轮亲和筛选后，抗猪XCR1目的蛋白的特异性噬菌体的富集率分别为6.4×10^-8、4.27×10^-6和2.8×10^-5，第三轮的富集率约为第一轮的437倍，表明抗猪XCR1目的蛋白的纳米抗体得到了很大程度的富集（表3）。自第二轮、第三轮亲和筛选后的洗脱产物中随机挑选95个单克隆菌落进行间接ELISA鉴定，并选取其他任一含his标签的蛋白作为对照。如图6所示，共有5个单克隆菌落可以与猪XCR1目的蛋白发生特异性的结合，经序列测定后，根据纳米抗体CDR3区域进行氨基酸序列比对，如图7所示，共筛选出5个针对猪XCR1目的蛋白的特异性纳米抗体，选取OD₄₅₀数值最高的Nb75纳米抗体进行后续试验。

2.4　XCR1/FMDV双特异纳米抗体重组表达载体的构建

分别以Nb75、连接肽PA和Nb205的基因片段为模版，采用SOE-PCR方法将其连接，获得XCR1/FMDV双特异纳米抗体串联基因片段，如图8所示，串联基因片段大小为1 000 bp左右，与预期大小一致。上述串联基因片段经双酶切后插入pMECS载体，转化至大肠杆菌WK6感受态细胞后，获得重组表达载体，随后对质粒进行酶切验证，载体片段及目的基因片段大小相符合，表明重组表达载体构建成功。

2.5　XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白的表达与纯化

将pMECS-Nb75-205重组表达菌接种TB培养基，经诱导表达和镍柱纯化后，得到纯化的目的蛋白Nb75-205，同时设立不添加β-巯基乙醇的对照组，经SDS-PAGE和Western blot鉴定，如图9所示，目的蛋白相对分子量大小约为35 ku，与预期大小一致，纯度在90%以上，而未添加β-巯基乙醇的对照组相对分子量大小约为70 ku，表明目的蛋白为二聚体结构。

2.6　XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白结合活性的鉴定

采用间接ELISA方法鉴定所制备的XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白与猪XCR1目的蛋白和猪O型口蹄疫病毒灭活抗原的结合特性，如图10显示，所制备的XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白与猪XCR1目的蛋白和猪O型FMDV灭活抗原均具有较好的结合活性，其结合活性与单价纳米抗体对照组无明显差异，表明所制备的XCR1/FMDV双特异纳米抗体融合蛋白展现了与单价纳米抗体相类似的作用功能，与目的抗原均具有较好的结合活性。

3　讨 论

cDC可捕获外源物质并将其提呈至抗原特异性T细胞，对于细胞免疫的启动和体液免疫中抗体的极化均具有重要作用^{［2， 15］}。cDC根据功能不同可分为cDC1和cDC2^［16］，cDC2主要诱导CD4⁺T细胞向Th2转化，产生以IgG1为主导的体液免疫反应；而cDC1不但可以诱导CD4⁺T细胞向Th1转化，产生以IgG2a为主导的体液免疫，还可以将抗原交叉提呈至CD8⁺T细胞，增强细胞毒性免疫应答^{［1-2， 17］}。

将抗原靶向至DC细胞是提高疫苗抗原免疫效率的有效途径。XCR1作为cDC1特异性的抗原提呈受体，在抗原提呈过程中发挥着重要作用。研究显示，与非靶向抗原相比较，通过将黑色素瘤抗原和胸腺瘤抗原靶向至XCR1，可以引起IFN-γ⁺CD8⁺T细胞应答，诱导抗原特异性细胞毒性T细胞反应（Cytotoxic lymphocyte，CTL），抑制黑色素瘤及胸腺瘤生长^［3］；通过将流感病毒HA抗原靶向至XCR1，可以诱导较高的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞反应以及较强的细胞毒性，提升小鼠体内生发中心B细胞以及长寿浆细胞比例，提高特异性抗体水平，产生攻毒保护作用^{［1-2， 4］}；通过将新型冠状病毒S蛋白靶向至XCR1，可以在小鼠体内诱导产生特异性中和抗体以及T细胞免疫应答，并提高骨髓中长寿浆细胞比例^［5］。上述研究报道显示，XCR1靶向抗原提呈在抗病毒感染和肿瘤治疗方面具有很大潜力，已成为新型疫苗制剂研发与应用领域的前沿热点。

抗原的DC靶向主要是通过化学偶联或基因融合表达的方法，将DC表面受体相应的配体或特异性抗体与抗原进行组装，该过程较为繁琐，易影响抗原结构。此外，由于物种、靶向抗原以及靶向策略的不同，产生的免疫效果也不尽相同，现有研究均采用蛋白质抗原作为靶向抗原，由于蛋白质抗原的抗原表位有限，往往不能产生较为理想的免疫效果^［8］。因此，设计更加有效的靶向抗原、探索新的抗原组装策略，对于改善XCR1靶向免疫效力具有重要意义。为实现猪O型FMDV抗原的猪XCR1靶向，本研究尝试利用抗原与抗体的特异性结合以及双特异纳米抗体的桥联作用，实现猪O型FMDV抗原的猪XCR1靶向，先后利用重组表达的猪XCR1目的蛋白对羊驼进行免疫，构建了噬菌体展示纳米抗体基因文库，经3轮亲和筛选及ELISA鉴定后，获得了多个猪XCR1目的蛋白的特异性纳米抗体，并将纳米抗体Nb75与猪O型FMDV纳米抗体Nb205融合表达，制备双特异性纳米抗体Nb75-205融合蛋白，该融合蛋白不仅可以在大肠杆菌中实现可溶性表达，还具有二聚体结构；与此同时，Nb75-205能同时与XCR1目的蛋白和猪O型FMDV特异性结合，且结合活性与Nb75和Nb205无明显差异。Fossum等^［1］在研究中报道，较单体结构C11A-HA而言，二聚体结构XCL1-HA不仅能诱导机体产生高水平的IgG2a抗体，还能激活CTL反应，这为本研究后续开展FMDV抗原靶向至猪XCR1提高FMDV抗原免疫效力的研究提供了可能性。本研究以纳米抗体为技术手段，代替传统的单克隆抗体及单链抗体，通过构建Nb75-205双特异性纳米抗体融合蛋白，可以采用FMDV全病毒代替蛋白质抗原进行XCR1靶向，发挥全病毒天然抗原表位的优势，同时避免化学偶联和基因融合表达方法对抗原结构的影响，同时，本研究获得的双特异性纳米抗体Nb75-205融合蛋白只需要与抗原孵育后就可以直接使用，操作简便快捷，适用于兽医临床应用场景。预期研究结果，与非靶向FMDV抗原相比较，通过将FMDV抗原靶向至猪XCR1，可以大幅提高抗原的提呈效率，诱导产生更高的抗体水平以及细胞免疫应答，减少临床中抗原的免疫剂量和免疫频次，为新型FMD疫苗设计提供思路和参考。

4　结 论

本研究利用噬菌体展示技术获得了抗猪XCR1的纳米抗体Nb75，采用连接肽将Nb75和抗猪O型FMDV纳米抗体Nb205连接，构建了双特异性纳米抗体Nb75-205融合蛋白，经鉴定Nb75-205为天然二聚体结构，可同时与XCR1和FMDV发生特异性结合，为进一步解析猪XCR1靶向提呈FMDV抗原的作用机制奠定了基础，也为新型FMD疫苗设计提供思路和参考。

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基金资助

江苏省自然科学基金项目(BK20231389)

国家自然科学基金项目(32102690)

“十四五”重点研发专项(2022YFD1800800)