乙烯响应因子LlERF12调控卷丹珠芽发生机制的初步解析

Preliminary analysis of the mechanism of ethylene response factor LlERF12 regulating bulbil formation in Lilium lancifolium

摘要

为探究乙烯（Ethylene）对卷丹珠芽发生的作用，以卷丹（Lilium lancifolium）为试验材料，利用不同浓度的乙烯利（Ethephon， ETH）和乙烯信号转导抑制剂1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene， 1-MCP）处理卷丹茎段，对其进行表型统计、生理指标测定和下游基因表达情况分析；通过卷丹珠芽形成过程的转录组数据筛选到可能参与调控珠芽发生的乙烯响应转录因子——LlERF12（Ethylene responsive factor 12），利用生物信息学软件对其生化特性分析预测；利用实时荧光定量法检测LlERF12基因在不同时期、不同组织、不同百合品种以及不同浓度ETH和1-MCP处理下的表达；最终通过基因沉默技术验证LlERF12在卷丹珠芽发生过程中的作用。结果表明：1）卷丹珠芽的发生发育过程共划分为4个时期：S0~S3；2）1-MCP处理导致叶腋处葡萄糖含量增加，通过促进腋芽发生标志基因LlSTM（SHOOTMERISTEMLESS）的表达量而促进卷丹珠芽的发生数量，而ETH处理则通过抑制LlSTM表达而抑制了珠芽发生数量；3）LlERF12在珠芽准备发生时期表达量较高，并且在自然能发生珠芽的百合品种中的表达量显著高于其他百合品种；4）ETH处理显著抑制LlERF12的表达，1-MCP处理则相反；5）沉默LlERF12基因导致LlSTM表达下降，进一步抑制了卷丹珠芽的发生数量，证明了LlERF12在珠芽发生过程中的正调控作用。综上，LlERF12通过响应乙烯信号转导，促进叶腋处葡萄糖积累，影响下游腋芽发生标志基因LlSTM的表达，从而调控卷丹珠芽的形成。

Abstract

To explore the effect of ethylene on bulbil formation of Lilium lancifolium， the stem segment of Lilium lancifolium was treated with different concentrations of ethephon （ETH） and ethylene signal transduction inhibitor 1-methylcyclopropene （1-MCP）. The phenotypic statistics， physiological index determination and downstream gene expression analysis were carried out. The ethylene responsive factor LlERF12 that may be involved in the regulation of bulbil formation was screened by using transcriptome data of L. lancifolium bulbil formation process. Bioinformatics software was used to analyze and predict its biochemical characteristics. The expression of LlERF12 gene in different periods，different tissues， different lily varieties and different concentrations of ETH and 1-MCP treatment was detected by real-time fluorescence quantification. Finally， the role of LIERF12 in the process of bulbil formation of L. lancifolium was verified by VIGS technology. The results showed that： 1） The development process of L. lancifolium bulbils was divided into four periods， which were S0， S1， S2， and S3； 2） 1-MCP treatment increased the glucose content in leaf axils and promoted the number of bulbils by promoting the expression of axillary bud marker gene LISTM （SHOOTMERISTEMLESS）， while ETH treatment reduced the number of bulbils by inhibiting the expression of LISTM. 3） The expression level of LIERF12 was higher in the period of bulbil preparation， and the expression level of LIERF12 in lily varieties with natural bulbils was significantly higher than in other lily varieties. 4） ETH treatment significantly inhibited the expression of LIERF12， while 1-MCP treatment was the opposite. 5） Silencing the LIERF12 gene resulted in a decrease in the expression of LISTM， which further inhibited the number of bulbils of L. lancifolium， demonstrating the positive regulatory role of LlERF12 in the process of bulbil formation. In summary， LIERF12 promotes the accumulation of glucose in leaf axils and affects the expression of the downstream axillary bud marker gene LISTM by responding to ethylene signal transduction， thereby regulating the formation of bulbils of L. lancifolium.

Graphical abstract

关键词

卷丹 / 珠芽 / LlERF12 / 乙烯 / 基因沉默

Key words

Lilium lancifolium / bulbil formation / LIERF12 / ethylene / gene silencing

百合（Lilium spp.）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）植物，是世界上具有重要商业价值的球根花卉。我国是世界百合属植物的自然分布中心，分布于我国的野生百合资源占世界百合属植物的50%以上，种质资源丰富^［1］。然而，我国百合种球繁育技术相对落后，种球退化严重，约90%以上的观赏百合种球依赖进口^［1］。目前，鳞片扦插是我国百合种球生产中常用的繁殖方式，但该种繁殖方式易受母鳞片营养供应和病毒积累等因素限制，影响种球质量。此外，百合还可以通过珠芽繁殖、组织培养与种子繁殖等方式进行繁殖。近年来相关研究发现，珠芽繁殖具有病毒含量低^［2-3］、容易脱毒^［4］、繁殖效率高和生产均一化程度好^［5］等优势。因此，珠芽繁殖是百合种球生产中具有开发潜力的无性繁殖方式之一。

珠芽是植物为了抵御不良环境和保障物种延续的一种进化策略，主要存在于百合属（Lilium L.）、半夏属（Pinellia Tenone）和薯蓣属（Dioscorea L.）^［6］。植物的珠芽主要着生在叶腋、茎节、花序和叶柄上，形态学和解剖学表明珠芽是由着生部位的分生组织分裂分化而来^［6］。百合珠芽主要着生于叶腋，是由腋生分生组织（Axillary meristems，AMs）发育而来^［7-8］。自然界能够产生珠芽的百合有卷丹（Lilium lancifolium）、泸定百合（Lilium sargentiae）、淡黄花百合（Lilium sulphureum）和珠芽百合（Lilium bulbiferum）等，大部分亚洲百合杂种等系列在经过人为打顶或外源激素处理下也能够产生珠芽^［9］。卷丹作为自然三倍体植物，珠芽繁殖是其自然状态下繁殖的主要方式。研究发现，卷丹珠芽产生于植物中上部叶腋处，首先由叶柄基部表皮下的薄壁细胞经过平周分裂和垂周分裂形成隆起的腋生分生组织，即发生过程；之后通过分裂分化产生具有鳞片和顶端分生组织的成熟珠芽，即发育过程^［10］。

已有研究报道，百合珠芽的发生和发育过程受到多种激素调控，包括生长素（Auxin）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和独脚金内酯（SL）等^［6］，但是乙烯对珠芽形成的调控机制鲜有报道。乙烯是最早被确立为植物激素的植物调节物质之一，能促进种子萌发、叶片扩展、根毛伸长、侧根生长，诱导花芽分化和打破休眠，并参与果实成熟以及叶片脱落等过程^［11-15］。乙烯在植物腋芽的发生发育过程也起到关键作用，植物茎顶端高水平且自由扩散的乙烯有利于腋芽的发生，但叶腋处高水平的乙烯往往会抑制腋芽的发生^［16］。ERF（Ethylene-responsive transcription factors）属于AP2/ERF（APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR）亚家族，在乙烯信号转导通路中发挥重要作用，参与植物多种生命活动及逆境胁迫应答^［17］。有研究报道，水稻突变体基因DSP（Defective stigma and panicle）编码包含识别GCC基序的AP2/ERF结构域的转录因子，通过调控PID（PINOID）而作用于柱头起始过程；通过间接调控LAX1（LAX PANICLE1）而作用于分蘖起始过程，并且DSP与LAX1协同调控穗型的发育^［18］。水稻AP2/ERF转录因子OsEATB（For ERF protein associated with tillering and panicle branching）会降低成熟期水稻的植株高度和穗长，促进分蘖和小穗的分枝潜力^［19］。此外，拟南芥AP2/ERF转录因子AtEBE（ERF BUD ENHANCER）在增殖细胞中强烈表达，并在植株打顶后在AMs中迅速且短暂地上调，并且过表达AtEBE会刺激腋芽的形成^［20］。但目前乙烯参与调控植物AMs发生以及腋芽发育过程的研究较少，其具体机制还有待探究。

本研究拟通过对卷丹珠芽的形成过程进行形态学观察和对卷丹茎段进行外源乙烯利（ETH）和1-甲基环丙烯（1-MCP）处理，并利用转录组分析、荧光定量（qRT-PCR）分析和TRV（烟草脆裂病毒）介导的VIGS（Virus induced gene silencing）等方法初步探究LIERF12在卷丹珠芽发生过程中的作用，以期为优化百合珠芽繁殖技术提供理论参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料

卷丹选自北京市农林科学院国家百合种质资源库，将卷丹独头种球栽植于北京市农林科学院玻璃温室中。结合张雪敏等^［3］的划分方式，将卷丹珠芽形成过程划分为S0、S1、S2和S3共4个时期，并对其进行形态学观察和取材。每个时期包含3个生物学重复，每个重复来源于3株卷丹叶腋的混样，每株卷丹取同一部位相邻的2个叶腋；迅速放入液氮后于-80 ℃储存，用于转录组测序与基因表达量检测。

用不同浓度的ETH和1-MCP处理卷丹茎段。茎段组培参考体外小鳞茎诱导系统^［21-22］。待冷藏的卷丹种球定植后萌芽至20 cm左右时，选用生长良好、状况一致的植株，截取约10 cm长的上部茎段，剪去2/3的叶片，于流水中冲洗1 h。之后用75%乙醇处理30 s，3%二氯异氰尿酸钠溶液处理30 min，用无菌水清洗3~5次。将茎段接种在含有不同浓度ETH和1-MCP并以脱脂棉为支撑物的液体MS（Murashige and Skoog）培养基上，组培室温度为（25±1）℃，光照强度2 000 μmol/（m²·s），光照16 h，黑暗8 h。为探讨乙烯在卷丹珠芽形成中的作用，采用不同浓度的ETH和1-MCP对茎段进行了5组处理^［23-24］（表1）。待叶腋处发生珠芽时进行统计取材，每个处理包含3组生物学重复，每个重复来源于随机选择的5个卷丹茎段的30个叶腋混样。将样品迅速放入液氮后于-80 ℃储存，用于葡萄糖含量测定及基因表达量检测。

1.2　试验方法

1.2.1　总RNA提取和LlERF12表达分析

卷丹叶腋总RNA由多糖多酚植物离心柱型RNA快速提取试剂盒（Vazyme，RC401-01）提取。根据反转录试剂盒（Vazyme，R223-01）获得cDNA。将cDNA模板稀释至300 ng/μL进行qRT-PCR^［25］。荧光定量PCR反应条件和体系参考吴健^［26］方法，以FP（F‑BOX FAMILY PROTEIN）基因为内参基因，采用2^-∆∆Ct法进行定量数据分析。

目的基因序列来源于转录组数据（NCBI登录号：PRJNA916842），其开放阅读框（Open reading frames，ORF）序列在ORF Finder在线网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）搜索获得，定量引物使用Gen Script在线网站（https：//www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool）进行设计，在线界面Organism参数选择其他，产物片段大小范围选择180~220 bp，退火温度≥60 ℃^［27］。按照引物设计原则，进行定量引物筛选。本试验所用引物均由北京擎科生物技术股份有限公司合成（表2）。

1.2.2　卷丹珠芽转录组数据中ERF基因家族的表达热图

基于卷丹珠芽转录组数据，利用TBtools绘制ERF基因家族在卷丹珠芽发生发育时期的表达热图，筛选出在卷丹珠芽形成过程中差异表达的关键ERF基因。

1.2.3　蛋白质理化性质分析、多序列比对及系统进化树构建

从TAIR数据库下载拟南芥的AP2/ERF家族基因蛋白序列，利用ClustalW软件进行蛋白的多序列比对，导出比对结果后，利用MEGA 7软件对拟南芥目的基因蛋白序列进行多序列比对，然后采用邻接法（Neighbor-Joining method）构建系统发育进化树。

借助Prot Param在线软件分析LlERF12蛋白的理化性质，使用Prot Scale在线软件预测LlERF12蛋白的亲疏水性，使用在线软件TMHMMServerv2.0分析LlERF12蛋白氨基酸的跨膜结构域，使用Net Phos 2.0 Server在线软件预测LlERF12蛋白质磷酸化位点^{［3，27-28］}。

1.2.4　 LlERF12的基因功能验证

选择目的基因长为263 bp的特异序列进行沉默，并设计上游引物LlERF12-TRV2-F、下游引物LlERF12-TRV2-R（表2）。使用卷丹珠芽S0时期cDNA 为模板进行PCR扩增，扩增体系50 μL，退火温度设为58 ℃，其中包括25 μL 2×Phanta Master Mix，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL和ddH₂O 21 μL。PCR仪反应程序：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，56 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，35个循环，最后以72 ℃延伸5 min，4 ℃保存^［27］。扩增产物经质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段使用DNA通用型纯化回收试剂盒（DP214，TIANGEN）进行纯化回收。使用EcoRⅠ内切酶对TRV2载体进行单酶切，与回收后的PCR产物使用同源重组法（TSV-S1，擎科生物）连接后，转化DH5α大肠杆菌感受态，测序后将构建成功的LlERF12-TRV2载体和TRV1、TRV2空载分别转化至EHA105农杆菌中。

利用VIGS方法沉默LlERF12基因，选择生长良好、大小均一、芽长约5 cm的卷丹种球为材料，分别将LlERF12-TRV2或TRV2、TRV1农杆侵染液（OD₆₀₀=1.0）以体积比1∶1混合，28 ℃避光静置3~5 h^［29］。对卷丹种球进行扎孔处理后，放入配制好的农杆菌重悬液中抽真空（0.8 MPa，5 min，重复2次）。将处理好的种球种植在北京市农林科学院玻璃温室中生长，以进行后续的表型观察。待种植后约60 d，对沉默植株进行珠芽数量统计^［30］，进行3个生物学重复，每个重复由3个植株组成；然后迅速放入液氮后于-80 ℃储存，并取材进行后续的定量检测和生理指标测定。

1.2.5　葡萄糖含量测定

选取ETH、1-MCP处理的茎段和VIGS植物的上部未发生珠芽的叶腋组织进行取材，迅速冻存在液氮中并储存于-80 ℃。使用葡萄糖含量测定试剂盒（BC2500，Solarbio）测定卷丹叶腋处的葡萄糖含量。样品为0.1 g，并进行3个生物学重复。

1.3　数据处理

数据通过SPSS软件进行显著性差异分析，采用One-way ANOVA和Post hoc Tukey’ s HSD方法，P<0.05代表差异显著；采用Student’s t检验进行统计分析，*表示具有显著性差异（P<0.05），**表示具有极显著性差异（P<0.01）。

2　结果与分析

2.1　卷丹珠芽发生发育的时期划分及形态学观察

为了解卷丹珠芽形成，通过连续观察，将卷丹珠芽发生发育过程划分为4个时期，分别是：植株中上部第1个叶腋处产生小白点状珠芽的S1时期、S1时期上部（约2 cm处）待发生珠芽的叶腋处为S0时期、小白点状珠芽发育为绿色珠芽的S2时期以及最终发育成具有紧密鳞片结构的紫色成熟珠芽的S3时期（图1）。其中，S0~S1时期为珠芽发生时期，S1~S3时期为珠芽发育时期。在种植后约60 d，对整个卷丹植株进行整体观察，发现茎下部的黑色珠芽比上部的珠芽形成时间早，表明珠芽从下到上成熟，并且卷丹产生珠芽的位置主要集中在植株的中上部叶腋处。

2.2　ETH和1-MCP处理对卷丹珠芽发生的影响

为了探究乙烯对卷丹珠芽发生的影响，将卷丹茎段在含不同浓度ETH和1-MCP的MS液体培养基上进行培养，16 d后观察表型并统计取材（图2（a））。2 mg/L的1-MCP可以显著促进卷丹茎段珠芽的形成，50和100 mg/L的ETH则显著抑制珠芽的形成（P<0.05，图2（b））。由于已有研究表明葡萄糖对百合珠芽发生具有促进作用^［30］，本研究对不同浓度ETH和1-MCP处理的卷丹茎段上部叶腋进行葡萄糖含量测定发现，与对照相比，2 mg/L的1-MCP处理导致叶腋处葡萄糖含量显著增加（P<0.05），8 mg/L的1-MCP处理和50 mg/L的ETH处理则显著降低了叶腋处的葡萄糖含量（P<0.05），而100 mg/L的ETH处理与对照无显著差异（图2（c））。通过qRT-PCR方法测定了ETH、1-MCP处理茎段叶腋处的AMs发生标志基因LlSTM的表达量，结果发现，LlSTM被1-MCP处理激活，被ETH处理抑制（P<0.05，图2（d））。以上结果表明：乙烯可能通过影响LlSTM的表达而抑制珠芽的发生，而乙烯信号转导抑制剂1-MCP的处理则通过增加葡萄糖含量、激活LlSTM表达而促进珠芽发生。

2.3　乙烯响应因子ERF家族基因在卷丹珠芽发生发育阶段的表达

为了进一步探究乙烯在卷丹珠芽发生过程中的分子机制，本研究利用卷丹珠芽发生发育阶段的转录组数据对乙烯响应因子ERF家族基因的表达进行分析（图3（a）），并从中筛选出在S0和S1时期差异表达的ERF基因，发现LlERF12［log₂（S0）>1.5，log₂（S1）<0.5］在卷丹珠芽S0时期有较高的表达，在S1时期表达量较低（图3（b）~（c））。

2.4　LlERF12蛋白系统进化树构建

为了解LlERF12的生化特性，本研究将筛选出的LlERF12转录因子与拟南芥AP2/ERF转录因子家族进行聚类（图4）。LlERF12与拟南芥At1g77640亲缘关系最近，处于同一个进化分支上；其次，At1g44830（AtERF14）、At1g21910（AtDREB26）、At1g01250（AtERF23）、At1g71520（AtERF20）和At1g22810（AtERF19）聚类到相邻进化枝上，表明其与LlERF12蛋白的亲缘关系较近。

2.5　LlERF12蛋白生物信息学分析

为了进一步探究LlERF12的生化特性，对LlERF12蛋白理化性质进行预测分析。LlERF12基因序列全长642 bp，编码214个氨基酸。该蛋白由22种氨基酸组成，丝氨酸（Ser）的含量最丰富（约占17%）（图5（a））。LlERF12蛋白质的分子式为C₁₇₆₃H₂₉₄₀N₅₈₈O₇₂₂S₁₇₆，相对分子质量为49 568.80，理论等电点（pI）为5.12。蛋白质不稳定系数为53.77，蛋白脂肪系数为24.66，亲水性平均系数为0.943，因此LlERF12为不稳定亲水性蛋白（图5（b））。LlERF12蛋白定位于膜外的概率约为1，且序列不包含跨膜区域，推测其不属于跨膜蛋白（图5（c））。LlERF12蛋白序列包含52个磷酸化预测位点，涉及到Ser磷酸化位点有35个、苏氨酸（Thr）磷酸化位点有13个、酪氨酸（Tyr）磷酸化位点有4个（图5（d））。

LlERF12蛋白的二级结构预测由3种类型组成，其中包括69.74%的无规则卷曲（Coil）、24.62%的α螺旋（Alpha helix）、5.64%的延伸链（Extended strand），预测LlERF12蛋白的主要二级结构是无规则卷曲（图6（a））。另外，通过预测LlERF12的三级结构发现，LlERF12是以AP2/ERF domain-containing protein作为目标建立了三维结构模型（图6（b））。

2.6　LlERF12的表达模式分析

为了探究LlERF12的表达模式，本研究首先通过qRT-PCR测定了LlERF12在卷丹珠芽发生时期植株上下部叶腋处、珠芽发生发育各时期和各组织中的表达量。在S0时期，LlERF12在卷丹植株上部叶腋处的表达量要显著高于下部叶腋，也显著高于珠芽发育过程的S1~S3时期（P<0.05，图7（a）~（b）），推测LlERF12在卷丹植株上部叶腋处珠芽准备发生的S0时期的高水平表达有利于珠芽的发生。此外，通过测定LlERF12在卷丹各个组织中的表达量，发现其在叶片中表达水平最高（P<0.05，图7（c））。

选取6个来自不同系列的百合品种探究LlERF12在其它百合品种珠芽发生阶段的表达模式，分别是A系列品种（‘弗洛尔普雷诺’（Flore Pleno）、‘红色天鹅绒’（Red Velvet）、‘永远的琳达’（Forever Linda）、‘私语’（Easy Whisper））、LA重瓣系列（‘精选’（Must See））和OA系列（‘加州旅馆’（Hotel California））。其中A系列的‘弗洛尔普雷诺’和OA系列的‘加州旅馆’可以自然产生珠芽，LA重瓣系列的‘精选’是花后产生珠芽，其余3个品种在自然条件下均不能产生珠芽。自然状态下能够发生珠芽的‘弗洛尔普雷诺’上部叶腋中，LlERF12表达量显著高于其他品种（P<0.05）；无法发生珠芽的‘红色天鹅绒’‘永远的琳达’显著低于除‘精选’之外的其它品种（P<0.05）；‘精选’上部叶腋的LlERF12表达量低于‘弗洛尔普雷诺’和‘红色天鹅绒’，这可能是由于此时尚未发生珠芽（图7（d））。综上表明，LlERF12可能在珠芽发生阶段发挥正调控作用。

为了深入探究ETH和1-MCP是否会影响珠芽形成过程中LlERF12的表达，本研究通过qRT-PCR测定了不同浓度ETH、1-MCP 处理下卷丹茎段叶腋处LlERF12的表达量（图8）。与对照相比，2和8 mg/L 1-MCP可诱导LlERF12和LlSTM的基因表达，而50和100 mg/L ETH可以抑制LlERF12和LlSTM的基因表达（P<0.05）。由此推测，LlERF12可能介导了乙烯对卷丹珠芽发生的抑制作用。

2.7　 LlERF12在卷丹珠芽发生过程中的功能分析

本研究通过VIGS技术沉默了卷丹种球中的LlERF12以探究LlERF12在卷丹珠芽发生过程中的功能，并选择第60天作为采样点进行取材和珠芽表型统计（图9（a））。沉默LlERF12导致珠芽发生数量极显著降低，且叶腋处葡萄糖含量极显著减少（P<0.01，图9（b）~（d））。LlERF12沉默株系中的LlSTM基因表达量极显著降低（P<0.01），说明腋生分生组织的发生过程被抑制（图9（e））。以上结果表明，LlERF12在卷丹珠芽发生过程中起正调控作用。

3　讨论与结论

3.1　乙烯抑制剂1-MCP对叶腋处葡萄糖含量的影响

植物的生长发育除了依赖植物激素的调节，还需要糖为其提供能量。蔗糖可通过蔗糖合成酶（SUS）可逆地转化为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖，或通过蔗糖转化酶（INV）不可逆地转化为葡萄糖和果糖^［31-32］。在唐菖蒲和石蒜中，GhSUS2和LsSUS4分别通过促进蔗糖转化过程而增加籽球的数量^［33-34］。此外，植物激素可作为上游信号来调控蔗糖代谢的过程。在卷丹中，外源生长素吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）处理显著降低珠芽发生数量，而生长素极性转运蛋白抑制剂（N-1-naphthylphthalamic acid，NPA）处理则增加珠芽发生数量；并且沉默生长素合成基因LlTAR1（TRYPTOPHAN AMINO‑TRANSFERASE 1）或LlYUC6（YUCCA FLAVIN MONOOXYGENASE‑LIKE 6）通过降低叶腋处生长素水平而激活下游基因LlSusy1（SUCROSE SYNTHASES 1）和LlCWIN2（CELL WALL INVERTASE 2），进而加速蔗糖代谢，促进叶腋处葡萄糖积累而促进珠芽形成^［30］。同时，葡萄糖的处理也能促进卷丹珠芽的发生^{［30，35］}。本研究发现对卷丹茎段施加乙烯抑制剂1-MCP会促进珠芽形成，并且叶腋处的葡萄糖含量显著增加。因此，推测卷丹叶腋处高水平的乙烯可能会抑制珠芽的形成，而1-MCP处理可能通过降低叶腋处乙烯含量，诱导下游与蔗糖代谢相关基因的表达，促进叶腋处葡萄糖积累，进而促进珠芽发生。

3.2　 LlERF12响应上游乙烯信号并正调控卷丹珠芽形成

在维管植物中，主茎是来自茎尖分生组织（SAM），而分枝是由腋生分生组织（AM）分化而成的。某些植物中的腋芽处于休眠状态，这是由于内源发育信号与环境因素之间复杂的相互作用造成的^［36-39］。以生长素IAA为主要代表的植物激素，通过在植物组织内的差异分布来调节植物的顶端优势和腋芽起始^［40-41］。而乙烯和生长素具有相同的生理作用，可以作为信号调控下游转录因子参与植物的器官形成和发育。ERF转录因子作用于乙烯信号转导通路的最下游，参与了植物对乙烯的响应过程。有研究发现，油菜基因BnERF114.A1在拟南芥中异源过表达会抑制IAA扩散，促进生长素在顶端积累而导致植株矮化、分枝增多和顶端优势丧失^［42］。菊花乙烯响应因子CmERF053在植株打顶后表达迅速上调，并且参与细胞分裂素和生长素相关的枝条分枝途径^［43］。本研究结果表明，LlERF12在卷丹准备发生珠芽的S0时期和自然状态下能够发生珠芽的品种表达量较高，在沉默之后珠芽数量会降低。并且，LlERF12在ETH处理的卷丹茎段叶腋中表达水平下降。结合前人的研究结果推测，LlERF12会响应上游乙烯信号，并可能与其它植物激素共同调控卷丹珠芽发生。

3.3　乙烯通过LlERF12影响下游分生组织发生标志基因LlSTM调控卷丹珠芽形成

大量研究表明，生长点通过植物激素及转录因子控制干细胞维持^［44］。参与生长点干细胞维持与分化的基因STM、CUC2（CUP‑SHAPED COTYLEDON 2）等在植物顶端分生组织、器官边缘的形成及生长发育等过程中发挥作用^［44-45］。其中一个对侧芽起始至关重要的基因STM，在叶腋处的持续表达维持了AM分生组织活性，促进侧芽的起始^［46-47］。此外，有研究发现高水平的葡萄糖能通过激活TOR激酶而控制拟南芥全基因组组蛋白H3K27me3甲基化，FIE（FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM）作为PRC2（POLYCOMBREPRESSIVECOMPLEX2）复合体的组成成分，通过被TOR磷酸化而降低一系列靶基因（包括STM基因）的H3K27me3修饰，从而激活靶基因的表达^［48］。本研究结果表明，在1-MCP处理的卷丹茎段叶腋处以及LlERF12基因沉默的植株中，LlSTM的表达水平升高。推测乙烯信号会通过转录因子LlERF12影响叶腋处葡萄糖含量变化，从而调控下游分生组织发生标志基因LlSTM的表达。

本研究表明LlERF12响应乙烯信号转导，促进叶腋处葡萄糖积累，进一步影响下游分生组织发生标志基因LlSTM的表达，调控卷丹珠芽的形成。本研究初步解析了LlERF12调控卷丹珠芽发生的分子机制，为深入解析其功能奠定了理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32171864)

国家自然科学基金项目(32371954)

北京市农林科学院优秀青年基金项目(YXQN202303)

北京市农林科学院国际科技合作平台建设项目(2024-13)