马BMSCs成软骨细胞诱导分化及其关键lncRNAs-mRNAs的筛选分析

Induction differentiation of equine BMSCs into chondrocytes and screening analysis of key lncRNAs-mRNAs

摘要

为进一步筛选BMSCs（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成软骨细胞诱导分化中关键lncRNAs、mRNAs，本研究以马BMSCs为研究对象，对向软骨细胞诱导不同分化阶段的细胞开展全转录组测序，筛选出在BMSCs成软骨细胞分化中具有重要功能的 lncRNAs和mRNAs，并对mRNAs和lncRNAs及其靶基因进行验证，并构建 lncRNAs对 BMSCs成软骨细胞分化的调控网络。结果表明：1）体外成功建立了马BMSCs系，并成功诱导分化成软骨细胞。2）对不同分化阶段的BMSCs进行高通量转录组测序后，共鉴定出3 592个lncRNAs，其中，差异高表达的lncRNAs有250 个，低表达的116 个，差异高表达的mRNAs有280 条，低表达的105 条。3）筛选并验证了5个调控马BMSCs向软骨细胞诱导分化中的潜在候选因子，包括lnc-cpm、lnc-traf3、lnc-22173、lnc-acvr2a及lnc-pde4d，以及9个对应靶标基因MDM2、TRAF3、USP25、ACVR2A、PDE4D、BCL2、WAF1、SIRT1及NRF2。4）构建了差异表达的lncRNA与mRNA互作调控网络，主要富集于Wnt信号通路、p53信号通路、MAPK及NF-κb信号通路中。综上，本研究经全转录组测序与分析，成功筛选到马BMSCs分化为软骨细胞过程中表达显著的差异基因，可为后续进一步揭示软骨细胞分化过程中lncRNAs与靶基因的互作机制奠定了必要的前期基础，为BMSCs用于软骨修复的细胞治疗提供了科学依据。

Abstract

In order to further screen for the key lncRNAs and mRNAs of bone marrow mesenchymal stem cells induced differentiation into chondrocytes， equine BMSCs were selected as the research object， and whole transcriptome sequencing of cells were carried out at three different induced differentiation stages into chondrocyte. And then lncRNAs and mRNAs with important functions in the differentiation of BMSCs into chondrocytes were screened out. At the same time， mRNAs， lncRNAs and their target genes were verified， and then the regulatory network of lncRNAs in the differentiation of BMSCs into chondrocytes were constructed. The results showed that： 1） Equine BMSCs line was established in vitro and the cells were successfully induced and differentiated into chondrocytes. 2） A total of 3 592 lncRNAs were identified by high-throughput transcriptome sequencing of BMSCs at different differentiation stages， including 250 differentially high expression lncRNAs and 116 differentially low expression lncRNAs， 280 differentially high expression mRNAs， and 105 differentially low expression mRNAs. 3） Five potential candidate factors regulating the differentiation of horse BMSCs into chondrocytes were screened and validated， including lnc-cpm， lnc-traf3， lnc-22173， lnc-acvr2a， lnc-pde4d， as well as nine corresponding target genes MDM2， TRAF3， USP25， ACVR2A， PDE4D， as well as BCL2， WAF1， SIRT1， NRF2. 4） A differentially expressed lncRNA-mRNA interaction regulatory network was constructed， which was mainly enriched in following signaling pathway， including Wnt， p53， MAPK and NF-κb. To sum up， in this study， differential genes were successfully screened out during the equine BMSCs into chondrocytes through whole transcriptome sequencing and analysis， which will lay a necessary foundation for further revealing the interaction mechanism between lncRNAs and mRNAs during chondrocyte differentiation， and provide a scientific basis for BMSCs been used in cell therapy for cartilage repair.

Graphical abstract

关键词

马 / BMSCs / 诱导分化 / 软骨细胞 / lncRNA

Key words

horse / BMSCs / induced differentiation / chondrocyte / lncRNA

随着我国经济的快速发展，马术行业也随之应运而生，其中速度赛马是最吸引人的项目之一。但马匹由于经历长时间高强度训练，关节处软骨发生过度摩擦，从而导致受伤，因此为避免马匹软骨挫伤导致运动性能下降，研究者开始尝试各类预防及治疗措施，其中细胞因子、种子细胞等是近年来针对软骨修复研究的热点^［1］。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），可从骨髓、脂肪、肌肉、软骨、骨膜^［2］等组织中分离出来，在再生组织工程方面有着广泛的应用前景^［3-4］。上个世纪七十年代，Friedenstein等^［5］和Wakitani等^［6］首先采用骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）进行体外贴附，发现其具有向成骨、成软骨细胞分化的潜力。上世纪九十年代，BMSCs已成功实现向肌肉和脂肪组织分化^［7］。BMSCs具有免疫原性低、体外易扩增、富集和多向分化潜力的特点，是组织工程细胞治疗中理想的种子细胞^［8-9］。根据研究资料显示，干细胞转录因子Sox2，整合素CD29以及细胞表面标志物CD44、CD90和CD105是干细胞鉴定的标志基因，而collegeII、aggrecan和软骨分化相关基因Sox9是软骨细胞鉴定的标志基因^［10］。有研究发现小鼠BMSCs具有明显抑制膝关节骨性关节炎的作用，并能加速半月板的生长^［11］。软骨缺损的治疗方法分为自体软骨细胞和种子细胞移植。自体软骨细胞能够提供持续、透明的软骨^［12］，但其局限性也很大，现在诸多研究都采用种子细胞来进行软骨修复。因此，优质种子细胞的分离和诱导分化对软骨修复是至关重要的。

长链非编码RNA （lncRNA）通过调节基因在转录和转录后水平的表达，参与了基因的表观修饰^［13-14］。研究表明lncRNAs在人和许多动物发育、生理代谢及细胞分化中发挥着重要的调控作用^［15］。Wang等^［16］通过基因芯片技术对人成软骨细胞内lncRNAs的表达进行了研究，结果表明有2个高水平的 lncRNAs （ZBED3-AS1和CTA-941 F9.9）参与了成软骨的分化。信使RNA（mRNA），是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。Wang等^［17］利用大鼠骨折模型和体外骨折环境证实了PIA加速BMSCs增殖和迁移的作用。采用高通量测序和RT-PCR对组织外泌体lncRNAs-mRNAs网络进行分析，结果显示PIA处理大鼠的组织来源外泌体在BMSCs中49个基因及3个lncRNAs上调，28个基因及1个lncRNA下调。

研究表明，BMSCs体外分离培养及鉴定已在人、小鼠、大鼠、绵羊、兔子等中被相继突破^［18-20］，但在马中研究较少，且马BMSCs分化为软骨细胞相关lncRNAs-mRNAs调控机理尚未有相关研究。因此，本研究以蒙古马为研究对象，建立其BMSCs体外分离培养、分化培养及鉴定体系，对BMSCs分化获得的软骨细胞进行转录组测序，应用生物信息学方法筛选蒙古马BMSCs 分化为软骨细胞过程中差异表达显著的lncRNAs、mRNAs，筛选鉴定关键lncRNAs-mRNAs，并分析其与靶基因的互作关系，探讨lncRNAs分子在BMSCs向软骨细胞分化过程中可能发挥的调控作用。本研究可为体外培养软骨细胞分化效率的提升奠定必要的基础，对蒙古马BMSCs分化为软骨细胞机制的阐明提供理论支持，为BMSCs应用于赛马运动损伤的临床细胞治疗提供科学依据，同时对人类临床医学的细胞治疗提供方法借鉴。

1　材料与方法

1.1　试验材料

试验用2 岁蒙古马（公马）1 匹，来自内蒙古农业大学动物医学学院，安乐处死后，采集股骨备用。本试验经内蒙古农业大学动物实验伦理委员会批准（批准号：NND2021102）。

1.2　试验方法

1.2.1　马BMSCs的原代培养

将股骨骨头用75%酒精擦拭后，放入超净台，将股骨两端的松质骨粉碎，用含有1%青霉素（P）与硫酸链霉素（S）的PBS将含有骨髓的红色浆体冲出并收集在15 mL离心管中，1 200 r/min离心5 min。弃上清，用5 mL完全培养液（含10%FBS及1% PS的低糖DMEM/F12）重悬细胞沉淀，以1×10⁵个/瓶接种于T25卡式瓶中，置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养，2 d后首次半量换液。

1.2.2　马BMSCs的传代培养

当细胞长至70%~80%汇合时进行传代。PBS冲洗1 次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃培养箱中消化40 s。当大部分细胞形态由长梭形回缩变圆时，加入等体积的完全培养液终止消化，后将细胞悬液移至15 mL离心管中，离心5 min（1 200 r/min）。弃掉上清液，用1 mL完全培养液重悬细胞，进行细胞传代培养，分别于培养7、12和17 d时观察记录细胞生长形态变化。

1.2.3　马BMSCs向软骨细胞的诱导分化

将BMSCs接种至4个35 mm的培养皿中进行传代培养，当细胞生长到培养皿70%~80%时，分为分化组和对照组。将分化组更换为软骨细胞诱导培养液（含高糖DMEM、0.1% PS、0.1% iTS、100 ng/mL BMP7、10 ng/mL TGF-β3、10^-6 mol/L地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸）培养，对照组更换为无血清的完全培养液（含低糖DMEM/F12，1% PS）培养，分别在诱导0、7、12和17 d时观察拍照记录细胞生长形态变化。

1.2.4　马BMSCs向软骨细胞诱导分化后的阿尔新蓝染色鉴定

将诱导0、7、12和17 d的细胞进行阿尔新蓝染色鉴定，每个35 mm培养皿中加入1 mL PBS，清洗3 次；用10%多聚甲醛固定30 min后弃液，再用PBS洗涤3 次，加入 Alcian 酸化液浸泡3 min后，弃液；加入 Alcian 染色液染色30 min。流水冲洗1 min。加入核固红染色液复染5 min。流水冲洗1 min后，显微镜下观察，拍照。

1.2.5　马BMSCs向软骨细胞诱导分化后的细胞表面标志物鉴定

马BMSCs生长到培养皿70%~80%时，更换培养液为软骨细胞诱导培养液，诱导0、7、12和17 d收集细胞，提取RNA，进行反转录后，鉴定CD44、CD34、CD45、CD90和CD105、整合素CD29以及干细胞转录因子Sox2。根据NCBI上公布的马mRNA基因序列来设计引物，引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相关引物信息见表1。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.6　马BMSCs向软骨细胞诱导分化中差异表达lncRNAs和mRNAs的筛选及分析

1.2.6.1 lncRNA转录组测序分析

将培养0 d的对照组和诱导14 和21 d的分化组分别进行液氮处理（生物学重复3 次），用于全转录测序和后续的试验验证。然后利用生物信息学软件对不同分化阶段的数据开展lncRNAs和mRNAs的筛选，从中发现具有显著差异表达的lncRNAs和mRNAs，并确定它们之间的交互作用。

通过最新的转录本组装软件StringTie对Reads进行组装后，去除已知的mRNA和小于200 bp的转录本，再对余下的转录本进行lncRNA预测。预测软件为CPC （Coding potential calculator）和CNCI（Coding-non-coding index）。通过严密的过滤条件，最后得到lncRNA序列。

利用StringTie通过计算FPKM来判断lncRNA和mRNA的表达水平。通过perl脚本选择100 000个上游和下游的编码基因，之后利用内部脚本分析lncRNA的靶基因，以log₂>1或log₂<-1， P<0.05的条件筛选靶基因。

1.2.6.2　筛选出的lncRNAs和mRNAs荧光定量PCR验证

根据TAKARA公司公布的lncRNA转录说明书，利用lncRNA自身序列作为5'端引物，所有的lncRNA 3'端引物来自TAKARA公司lncRNA 反转录试剂盒。引物序列见表2。

荧光定量PCR反应条件：1）预变性：模式：Reps： 1；95 ℃ 30 s；2）PCR反应：模式：Reps：40；95 ℃ 5 s；58 ℃ 30 s；3）溶解曲线：模式：Reps：1；95℃ 5 s；60 ℃ 1 min； 95 ℃；4）降温：模式：Reps：50 ℃ 30 s。

2　结果与分析

2.1　马BMSCs形态鉴定及向软骨细胞分化的鉴定

马BMSCs经原代与传代培养后，BMSCs呈现长的纺锤型或成纤维细胞型，细胞中央有卵圆形核，生长密度较高时呈涡旋状或放射状（图1（b））。

经RT-PCR鉴定，分离培养的马BMSCs表达MSCs表面标志物CD44、CD90和CD105、整合素CD29以及干细胞转录因子Nanog和Sox2，均未表达CD34和CD45等造血细胞因子，由此可证实分离细胞为BMSCs（图1（a））。在培养7、12和17 d后，对照组的细胞形态并没有随时间增加而改变。随着诱导时间的增加分化组细胞形态由长梭形逐渐转变为三角形；7 d后大多数细胞形态呈多边形；12 d后，呈现软骨细胞典型“铺路石”形态；17 d后，软骨细胞的形态变得更为清晰，初步判定BMSCs分化为软骨细胞（图1（b））。

阿尔新蓝对蛋白聚糖染色结果表明，随着诱导时间增加，分化组细胞颜色逐渐加深，表明蛋白质聚糖含量逐渐增多，对照组细胞未见着色（图1（c））。之后以GAPDH为内参基因，通过PCR对软骨细胞标志基因 collegeⅡ和 aggrecan、软骨分化相关基因Sox9进行鉴定。结果表明， collegeⅡ、aggrecan和Sox9在分化组中均表达，而对照组不表达。表明经诱导的BMSCs已分化为软骨细胞，并表达了软骨细胞特异标记基因（图1（d））。

2.2　马BMSCs向软骨细胞诱导分化中差异表达lncRNA和mRNA的筛选

根据RNA 6 000试剂盒说明书在Agilent 2 100上进行测试，测试结果均满足RNA质量检验需求。利用Cuffdiff软件FPKM分析了分化组与对照组基因的差异，并利用FPKM=1筛选出表达差异显著的 lncRNAs、mRNAs。结果显示： lncRNAs与 mRNAs均高表达（图2（a））。为评估分化组与对照组在不同试验条件下 lncRNAs及 mRNAs的表达差异，采用 log₂>1或log₂<-1， P<0.05的条件筛选出差异表达显著的 lncRNAs和 mRNAs。其中 lncRNAs 显著上调表达的有250个，显著下调表达的有116个（图2（b）），mRNAs显著上调的有280 个，显著下调的有105个（图2（c））。将差异表达量较高的5个lncRNAs和9个mRNAs作为重点进行后续分析。

2.3　马BMSCs向软骨细胞诱导分化中差异lncRNAs和mRNAs的GO和KEGG分析

通过对lncRNAs共表达的蛋白编码基因进行GO功能注释和KEGG通路分析（图3（a）~（b）），结果表明，许多GO条目与软骨细胞的分化和增殖相关，如软骨细胞分化、软骨细胞转录调控及软骨细胞生物过程等。KEGG富集分析显示，蛋白质主要富集在黏连功能、TNF信号、RIG-i样受体信号转导及NF-κb信号通路等。

对差异mRNAs进行GO和KEGG富集分析（图3（c）~（d）），GO分析结果显示（P<0.05），在分子功能方面，靶基因主要在蛋白质结合、聚合物结合及锌离子结合中显著富集。对细胞成分方面，靶基因在细胞核、细胞质、膜的整体成分显著富集。在生物过程方面，靶基因主要在转录调控、DNA模板及RNA聚合酶II的转录调控显著富集。KEGG信号通路分析显示（P<0.005），差异mRNAs在8条通路中显著富集，主要包括细胞周期、嘌呤代谢、癌症相关微小RNA、嘧啶代谢、p53、氨基酸生物合成、HIF-1及cGMP-PKG信号通路等。

2.4　与软骨细胞形成相关lncRNAs和mRNAs的荧光定量PCR验证

筛选出5 个可能调控软骨细胞形成的 lncRNAs（lnc-acvr2a、lnc-pde4d、lnc-22173、lnc-cpm和lnc-traf3）进行RT-qPCR验证。结果显示，RT-qPCR结果与测序结果表达趋势一致，证明测序数据的准确性，如图4（a）所示。通过对与 lncRNAs靶向作用的5个靶基因（USP25、TRAF3、PDE4D、MDM2和ACVR2A）及参与p53信号通路、NK-κb信号通路的4个基因（BCL2、WAF1、SIRT1和NRF2）进行验证，结果如图4（b）所示。分析 p53信号通路和NF-κb信号通路基因以 GAPDH为内参，WAF1、TRAF3、SIRT1、MDM2、NRF2、USP25、ACVR2A、BCL2和PDE4d在分化组和对照组中的表达情况。结果显示，与对照组相比除PDE4d表达下调外，其他基因全部上调表达，与测序结果显示的基因表达趋势一致。通过GO、KEGG信号通路分析发现，lncRNAs可能与软骨细胞分化相关。lnc-cpm、lnc-traf3、lnc-22171和lnc-acvr2a的表达明显升高，而lnc-pde4d的表达明显降低。利用软件 TargetScan对差异表达的lncRNAs进行了靶标分析，结果表明，其中多数lncRNAs与NF-κb相关。为随后进行的验证性试验奠定基础（表3）。成功筛选到马BMSCs分化为软骨细胞过程中差异表达显著的5个lncRNAs和9个mRNAs。

2.5　差异lncRNA及其靶基因功能信号通路分析

基于 GO和 KEGG信号通路分析结果，进一步对筛选到的 P53、NF-κb、MAPK及 Wnt信号通路进行研究。相关通路调节机制见图5（a）~（c）。由图5（a）可知，p53活性的关键负调节细胞因子 MDM2上调时，抑制 p53活性，调控 BCL2抑制凋亡因子表达上调，导致BCL2下游靶基因WAF1的上调，维持软骨细胞的形成。而BMP-2的表达也诱导 WAF1的上调表达，表明其参与软骨形成功能。线粒体呼吸因子 NRF2的上调，正调节 SIRT1蛋白，抑制NF-κb表达，导致 PDE4D下调表达，从而阻止破骨细胞形成，抑制软骨基质的降解。USP25上调减少泛素化，抑制 TRAF3降解，阻止破骨细胞生成，有利于软骨细胞的存活。从图5（b）可知，MAPK20上调导致MAP2K6上调引起 MAPK8表达增加，引起更多 JUND磷酸化，会导致软骨细胞分化。lncRNA-B9D1靶向引起MAPK7下调，抑制软骨细胞的分化。说明激活 MAPK信号通路引起磷酸化增加可以调控软骨细胞分化。图5（c）分析可得，Wnt5a和Wnt11的下调表达，会引起 plcd1下调，导致 RUNX1降低，抑制 MSCs向成骨分化，导致 MSCs向软骨细胞的诱导分化，促进软骨细胞的形成。

上述信号途径分别从 P53、NF-κb、MAPK和 Wnt信号途径等多个层面对软骨细胞的分化和功能进行了深入研究。结合之前的数据分析显示，lnc-cpm、lnc-traf3、lnc-22171、lnc-acvr2a表达上调，lnc-pde4d表达下调，其中MDM2为lnc-cpm靶标；ACVR2A是lnc-acvr2a靶标；USP25是lnc-22173靶标；TRAF3是lnc-traf3靶标；plcd1是lnc102150170的靶标；MAPK7是lnc-B9D1的靶标。

3　讨论

BMSCs 来源于中胚层，除具有分泌多种细胞因子及生长因子外，还有多向分化潜能^［21］，且 BMSCs来源于多种组织，由于广泛的易得性和多向分化潜能使其在组织工程领域备受关注^［22］。

软骨是在骨骼发育初期形成的，在胚胎时期，MSCs增殖和聚集，然后定型和分化为软骨细胞，MSCs填充合成早期的骨骼细胞，并利用这些细胞的生长和增殖来促进软骨细胞的生长和分化。大多数终末分化后的软骨细胞出现了凋亡，少数转化为成骨细胞^［23-24］。在由MSCs向软骨到软骨转变为硬骨的过程中，有大量的转录因子、细胞信号分子和GLI基因的整合作用，其中包括 Sox9、RUNX2和GLI蛋白家族，成纤维细胞生长因子（FGF），Hedgehog，骨形态发生蛋白（BMP），转化生长因子（TGF-β）和Wnt信号通路共同调控软骨和骨骼的发育^［25-26］。随着转录组测序技术的不断发展，大多数的非编码 RNA在机体基础代谢和生理功能中扮演了非常重要的角色，是调节细胞生长和发育的关键因素^［27-29］。但目前有关 lncRNAs调控软骨细胞生成机制的研究较少。本研究利用转录组测序技术，从不同角度筛选出差异表达的 lncRNAs，从而建立起 lncRNAs的调控网络。通过对马 BMSCs成软骨细胞分化后0、14和21 d进行基因数据分析，发现 BMSCs向软骨细胞诱导分化中，有365 个差异显著的 lncRNAs。采用荧光定量 PCR方法对5 个候选 lncRNAs进行了检测，并与目标基因的相关性进行了检测。结果表明，RT-qPCR的表达趋势与 lncRNAs测序结果相符，从而证明了测序数据的正确性。

通过分析 lncRNAs及其靶基因，本研究主要针对软骨发育过程中细胞凋亡信号通路以及Nk-κb信号通路进行深入分析，其中 BCL2、WAF1、SIRT1构成一条通路，通过激活细胞周期抑制蛋白/分化因子（p21/WAF1）抑制软骨细胞凋亡，对软骨分化具有积极影响。在软骨形成过程中，线粒体生物发生是一个复杂的过程，涉及线粒体基因组与细胞核之间的密切合作^［30］。当靶基因 SIRT1脱乙酰化并激活线粒体生物发生的转录因子、核呼吸因子（ NRF1/2）增加氧耗率和细胞内 ATP水平以促进软骨合成^［31］。且 SIRT1上调表达抑制了 NF-κb信号通路进而遏制破骨细胞的生成^［32］，防止软骨细胞走向凋亡或衰老^［33］。

软骨形成中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在软骨形态发生和组织模式中起重要作用。作为非经典 Wnt信号，Wnt5a在阶段特异性环境中特异性地促进软骨细胞肥大^［34］。研究表明抑制 Wnt5a表达会延缓软骨细胞的成熟和骨骼形成的发生^［35］。另一方面，几种非经典 Wnt同种型如 Wnt5a和 Wnt11参与IL-1β诱导的关节软骨细胞去分化^［36］。同时抑制内源性 Wnt5a促进 PKCα和p38 MAPK活性，增加TGFβ3刺激软骨形成^［37］。软骨细胞的增殖、分化在软骨形成过程中发挥重要作用，揭示抑制该组基因（Wnt11、Wnt5a、plcd1）则会抑制成骨细胞的分化，促进软骨细胞的形成。而且通过lncRNAs-mRNAs的调控网络，plcd1的下调可能受到lnc102150170的调控。MAPK是真核细胞中关键细胞内信号转导物，影响到细胞分化^［38］、增殖^［39］、迁移^［40］和细胞凋亡^［41］。数据分析显示 MAPK家族成员（MAPK20、MAPK8、MAP2K6）显著上调表达，引起 JUND磷酸化，磷酸化的 JUND可促进软骨细胞的分化，因此 MAPK信号通路对于维持软骨细胞的分化是必要的。

综上，MSCs向软骨分化过程中 lncRNAs可能存在重要调控作用，但目前的研究方法主要在生物信息学分析的层次上，对于大部分 lncRNAs的生物学功能、相互作用机制以及如何区分功能性和非功能性非编码转录物仍需要进一步的深入研究。

此外，因 lncRNAs转录本长度超过200 nt，容易形成二级结构，作用机制复杂多样，且不同的 lncRNAs研究结果之间一致性较差，需要更多有效的方法系统性研究 lncRNAs的结构及其功能，例如高分辨率的活体成像技术、高通量的蛋白质检测技术、高灵敏的 lncRNAs检测技术、高效预测 lncRNAs二级结构和靶标基因的生物信息学技术等，这也将是 lncRNAs今后研究中的热点和重点。

4　结 论

本研究成功分离建立了马 BMSCs系并诱导为软骨细胞。经全转录组测序与分析，筛选到马 BMSCs分化为软骨细胞过程中差异表达显著的5 个 lncRNAs和9 个 mRNAs。经GO和KEGG pathway 分析，初步明确了关键 lncRNAs与mRNAs参与的生物学过程及主要信号通路。对细胞凋亡信号通路及 NF-κb炎症信号通路分析发现，相关 lncRNAs通过调控靶标 mRNAs的表达来促进软骨细胞的增殖，抑制软骨细胞胞外基质降解，进而阻遏软骨细胞凋亡及破骨细胞生成。

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基金资助

内蒙古自治区自然科学基金项目(2020MS03045)

国家自然科学基金项目(32260871)