青海省高原鼠兔源囊尾蚴的分子鉴定与进化分析

Molecular identification and evolutionary analysis of cysticercus derived from Ochotona curzoniae in Qinghai Province

摘要

为鉴定青海省高原鼠兔源绦虫囊尾蚴种类，本研究对囊尾蚴样本进行体式显微镜观察，对其线粒体COI基因进行扩增并测序比对分析，同时利用Iqtree和BEAST v2.6.2等软件对测序所得的COI基因进行系统发育及分化时间分析。结果表明：1）体式显微镜下该囊尾蚴的形态特征与带科囊尾蚴相似。2）测序结果发现该序列与GenBank中的才氏绦虫（Taenia caixuepengi）基因序列（MT882036）同源，序列相似性达到98.52%，表明该囊尾蚴属于Taenia caixuepengi囊尾蚴。3）系统发育树显示，才氏囊尾蚴与和豆状带绦虫（T. pisiformis）亲缘关系最近，两者形成微小分支。4）分化时间分析表明才氏囊尾蚴与豆状带绦虫在5.79 Mya（95%置信区间，3.15~6.87 Mya）左右分化形成，自展值为100%。综上，经鉴定青海省高原鼠兔源囊尾蚴为才氏囊尾蚴；利用该囊尾蚴线粒体COI基因进行的系统发育及分化时间分析表明该囊尾蚴与豆状带绦虫亲缘关系更近。本研究对青海省高原鼠兔源才氏囊尾蚴进行了鉴定与遗传进化分析，为才氏绦虫的分类、鉴定及分子流行病学调查提供理论依据。

Abstract

To identify the species of cysticercus derived from Ochotona curzoniae in Qinghai Province， the cysticercus samples were observed under a somatic microscopy， the mitochondrial COI gene sequences of cysticercus samples were amplified and sequenced， and the amplified products were compared. At the same time， the phylogeny and differentiation time of the sequenced COI genes were analyzed by Iqtree， BEAST v2.6.2 and other software. The results showed as follows： 1） The morphological characteristics of the cysticercus were similar to those of Taeniidae cysticercus in the family Ceratopsidae. 2） The sequencing results showed that the sequence was homologous to the gene sequence of Taenia caixuepengi in GenBank （MT882036）， with a sequence similarity of 98.52%， indicating that the cysticercus belongs to Taenia caixuepngi. 3） The phylogenetic tree showed that T. pisiformis was closely related to T. pisiformis， forming small branches between the two. 4） The differentiation time analysis showed that T. caixuepengi and T. pisiformis differentiated at around 5.79Mya （95% confidence interval， 3.15-6.87 Mya） with a bootstrap value of 100%. In conclusion， the cysticercus derived from O. curzoniae in Qinghai Province was identified as T. caixuepengi. Phylogenetic analysis and differentiation time analysis using the mitochondrial COI gene of this cysticercus showed that this cysticercus was more closely related to T. pisiformis. In this study， the identification and genetic evolution analysis were performed to provide theoretical basis for the classification， identification and molecular epidemiological investigation of T. caixuepengi in Qinghai province.

Graphical abstract

关键词

高原鼠兔 / 才氏囊尾蚴 / 分子鉴定 / 系统发育

Key words

Ochotona curzoniae / Taenia caixuepengi / molecular identification / phylogeny

青海省位于中国西部，雄踞世界屋脊青藏高原的东北部，具有独特的气候、地形和生物特征，是多种生物演化的重要场所^［1-2］。高原鼠兔（Ochotona curzoniae）是青藏高原特有物种^［1］，主要分布在该地域的高寒草甸和草原地带^［2］。高原鼠兔在青藏高原草原生态中属于初级消费者，同时还是许多自然疫源性疾病的宿主^［3］。目前，高原鼠兔中发现多种病原体且多数为新种，对公共卫生安全构成威胁^［4-5］，因此深入研究高原鼠兔所感染的病原体具有重要意义。

绦虫纲（Cestoda）是扁形动物门中的一类寄生蠕虫，主要寄生于脊椎动物群体的腹腔和胸腔^［6］，包括鱼类、爬行动物、鸟类和哺乳动物^［7-8］，并且会导致寄主出现一系列的感染症状^［9］，其幼虫通常需要在 1或2个中间宿主体内发育^［10］。圆叶目（Cyclophyllidea）是绦虫纲中最大的分类群^［11］。其中的带科一般认为包括2个有效属即带属（Taenia）和棘球属（Echinococcus）。当带属绦虫的虫卵被其终末宿主（犬、狐狸等犬科动物）随粪便排出后，会污染附近环境，其中间宿主（小型哺乳类动物）误食被带属绦虫虫卵污染的食物或水后，虫卵会在其腹腔生长发育形成囊尾蚴。带属绦虫主要分布在非洲、亚洲以及拉丁美洲的发展中国家^［12］；在我国带属绦虫分布相当广泛，主要分布在西藏、四川等西部地区^［13］；但在青海有关带属绦虫感染报道较少。

形态学鉴定是寄生虫鉴定的重要手段之一，但形态学观察很难鉴定变形和受损虫体，也不易区分近缘种、亚种及隐藏种，这给绦虫囊尾蚴的准确分类鉴定造成困难^［14］。许多带属绦虫囊尾蚴在形态上非常相似但虫种不同，因此形态学鉴定在带属绦虫分类和鉴定方面存在明显不足^［15］。随着分子生物学技术的发展，分子鉴定方法可以弥补形态学鉴定的缺陷，尤其是经典分子靶标（如线粒体基因）已成为寄生虫分类、鉴定、起源与进化等方面研究的有效技术手段^［14］。

根据Nakao等^［16］应用线粒体基因在猪带绦虫（T. solium）中的分类，以及Bowles等^［17］在亚洲带绦虫（T. asiatica）的研究可知，线粒体COI基因已广泛应用于带属绦虫的物种分类、系统发育及鉴别诊断，并且线粒体COI基因的遗传特性使其可能比任何单一的核标记在区分近缘物种和研究其系统发育关系方面更灵敏^［18］。目前关于带属才氏绦虫的报道较少，更重要的是才氏绦虫分子鉴定及遗传进化等方面基础资料不足；因此，本研究对青海高原鼠兔源才氏绦虫囊尾蚴在体式显微镜下进行了初步的形态学描述，利用PCR扩增得到的线粒体COI基因对该绦虫的系统发育和分化时间进行了分析，为今后才氏绦虫的分类鉴定、分子流行病学调查以及种群遗传进化研究提供科学依据。

1　方法与材料

1.1　主要材料

2×Easy Taq PCR SuperMix、Trans2K DNA Marker均购自北京全式金生物技术有限公司，荧光染色剂、组织基因组DNA提取试剂盒（W9823）购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR引物合成及PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，其他常规试剂均为国内生产。

1.2　绦虫样本的采集、形态观察及DNA提取

在青海玉树藏族自治州曲麻莱县和果洛藏族自治州玛沁县捕获高原鼠兔（O. curzoniae），在鼠兔腹腔中收集到囊尾蚴并放入75%乙醇中保存。将收集到的囊尾蚴用ddH₂O反复冲洗后，用体式显微镜观察并拍照。根据主要形态特征和文献资料初步诊断囊尾蚴的种类。使用基因组DNA提取试剂盒提取囊尾蚴基因组DNA。

1.3　绦虫COI基因的扩增和序列分析

根据COI序列设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物为：F：TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT； 下游引物R：TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG^19］。

其扩增反应体系如下：PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物（浓度10 μmol/L）各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL、补充H₂O 8.5 μL至PCR反应体系为25 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增完成后，将 PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在120 V电压下电泳40 min，在凝胶成像系统上用紫外灯观察，并拍照保存图像。收集阳性 PCR 产物进行测序（生工生物工程（上海）有限公司）。测序结果在NCBI中进行BLAST比对（URL：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.4　系统发育进化分析

在GenBank数据库中下载30种相关绦虫的线粒体COI基因序列（表1）。使用MAFFT v7.505^［20］和TrimAl v1.2^［21］进行多序列比对，以曼氏血吸虫（Schistosoma japonicum）作为外群，利用Iqtree v2.2.0^［22］的最大似然法构建系统发育树^［23］，使用tvBOT在线工具美化^［24］。

1.5　分化时间分析

系统发育进化树作为分化时间分析参考^［25］。使用软件BEAST2（v2.6.2），选用严格时钟模式（The Strict Clock model），目的是忽略模式中各分支间速率差异。伽马分类计数设定为4，根据位点频率模型的经验，选择HKY模式。Yule模型校准后用作树先验。其他设置如替代率也在本次分析中进行评估。时间校准以之前估计的牛带绦虫（T. sanginata）和亚洲带绦虫（T. asiatica）之间的时间，约为1.66 Mya（95%置信区间，0.26~2.88 Mya），进行校准。从后验样本中每1 000步抽取一次，每次MCMC运行共10 000 000步。其他选项按默认值运行^［26］。

2　结果与分析

2.1　囊尾蚴形态特征

本研究分离到的青海高原鼠兔源囊尾蚴寄生在高原鼠兔腹部，虫体呈细长条形，全虫长37.1 mm左右，头部凹入囊泡，囊泡充满囊液。可大致将虫体分为3部分，头部横截面最大，有皱纹，前端皱纹形成褶皱；中间部占虫体全长80%以上，体表有皱纹，后半段为透明囊体；尾部色浅，体表相对光滑（图1）。该囊尾蚴的形态特征与前人研究中一些带属囊尾蚴的相似^［27］，因此从形态特征上将其暂鉴定为带属绦虫囊尾蚴。

2.2　囊尾蚴PCR鉴定

对提取到的DNA样品基于线粒体COI基因进行PCR扩增，结果得到404 bp左右的目的片段（图2）。将扩增后产物回收纯化后送测序，测序结果放入GenBank中用BLAST进行同源性分析，结果表明，该样本与才氏囊尾蚴（T. caixuepengi）同源，序列相似性为98.52%。

2.3　系统发育分析

采用Iqtree中最大似然法构建基于线粒体COI基因的种系发育树，以曼氏血吸虫（S. japonicum）作为外群。进化树显示，本研究分离出的才氏囊尾蚴（T. caixuepengi）与其他带属绦虫序列聚在相同的一个大分支上，和豆状带绦虫（T. pisiformis）亲缘关系最近，两者形成微小分支，发育树的自展值（Bootstrap）达到100%，与其他带属绦虫如亚洲带绦虫（T. asiatica）、泡状绦虫（T. hydatigena）、肥头绦虫（T. crassiceps）等所属分支较远，能在发育树上得到区分（图3）。

2.4　分化时间分析

基于线粒体COI基因的分化时间分析表明，3种棘球属绦虫的平均分化时间为2.86 Mya（95%置信区间，1.07~3.53 Mya），其中石渠棘球绦虫（E. shiquicus）与多房棘球绦虫（E. multilocularis）的分化时间为1.55 Mya（95%置信区间，1.02~3.74 Mya）^［28］，与之前的研究结果相近；才氏绦虫（T. caixuepengi）与豆状带绦虫（T. pisiformis）的分化时间为5.79 Mya（95%置信区间，3.15~6.87 Mya）（图4）。

3　讨论与结论

青藏高原小型哺乳类动物种类繁多且数量庞大，有大量的关于带属绦虫寄生于小型哺乳类动物的报道^［29］。形态学鉴定带属绦虫种类以及研究虫种分化存在缺陷^［30］，导致带属绦虫的分类一直存在争议^［31］。本研究中得到的高原鼠兔源囊尾蚴虽经体式显微镜观察后形态特征与带科囊尾蚴相似，但存在上述干扰，因此本研究进一步通过分子生物学方法确定了该高原鼠兔源囊尾蚴为才氏绦虫囊尾蚴。线粒体基因是一种典型的母系遗传物质，具有许多特性，是研究寄生虫分子进化的理想标志^［32］。通过对线粒体基因序列变异进行分析，可以为物种分类提供更为准确和可靠的分子水平鉴定工具^［33］。本研究利用才氏绦虫线粒体COI基因对其进行的系统发育分析了才氏绦虫囊尾蚴与其他带属绦虫亲缘关系，结果表明，才氏绦虫与豆状带绦虫亲缘关系最近。

青藏高原板块隆起后，其气候、环境变化导致位于相关地区的寄生虫及其宿主群体都发生进化，这是主要的、非生物性的驱动力^［34］。同地域种群间的遗传漂变和适应性分化会导致物种分化，在寄生虫上，相关联的宿主对其进化有着重要作用^［26］。因宿主可能因环境因素等产生生殖隔离，相应的，寄生虫也会产生同地域物种分化^［35］。古植物学研究表明，在中新世时期，受南亚和东亚板块上季风影响，青藏高原东南部常呈现热带或亚热带气候，环境温暖且潮湿^［36］；而在中新世中期开始时，青藏高原板块加速隆起，其中喜马拉雅山和天山海拔显著升高，加之同时期南极冰盖出现，全球气温下降导致了空气环流发生剧变，使得青藏高原和中亚板块的气候逐渐变得寒冷、干燥^［37］。鼠兔属（Ochotona）起源时间大约在14 Mya左右^［38］，而高原鼠兔（O. curzoniae）分化时间在中新世晚期，与青藏高原加速隆起的时间接近。本研究结果表明，才氏绦虫的分化时间在5.79 Mya左右^［39］，可以推测青藏高原板块隆起后形成的高海拔、低氧和高寒环境与之前常年的热带、亚热带气候相比形成了环境变化，鼠兔中偏好低温的种群逐渐向青藏高原靠拢，随着时间推移最终成为如今的高原鼠兔，这也对才氏绦虫的进化产生了至关重要的作用，即高原鼠兔迁移到青藏高原后，地理隔离使其缺乏与同种群间基因交流，最终导致了才氏绦虫与豆状带绦虫的分化。目前，才氏绦虫中间宿主只发现了高原鼠兔（O. curzoniae）^［12］，然而青藏高原野生小型哺乳类动物种类丰富，以及犬科动物数量繁多且分布范围广，为才氏绦虫完成生活史循环链提供了条件有利于才氏绦虫的传播，提示今后应更广泛地开展青藏高原野生动物才氏绦虫感染风险监测。本研究丰富了才氏绦虫的分子鉴定和遗传学理论基础，为才氏绦虫的分子流行病学调查提供了更科学的依据。该研究除了传统的形态学鉴定，分子生物学方法也提高了对才氏绦虫的认识，尤其是在才氏绦虫囊尾蚴的鉴定方面。本研究对才氏绦虫的遗传进化和分化时间的分析为以后才氏绦虫的研究提供了一定的数据参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32160840)

青海省“昆仑英才·高端创新创业人才”项目