CO₂麻醉致死对草鱼生理应激和肌肉品质的影响

Effect of CO₂ anesthesia on physiological stress and muscle quality of grass carp (Ctenopharyngodon idella)

摘要

为探究CO₂麻醉作为一种友好致死方式对草鱼生理应激及肌肉品质的影响，本研究设置CO₂麻醉浓度、麻醉时间和温度3个麻醉因素处理草鱼，测定血清生化指标、僵直指数、白度和持水力等品质指标，并以传统击晕方法为对照，进一步探究CO₂麻醉致死对草鱼贮藏期间鱼肉品质的影响。结果表明：1）不同的麻醉因素对草鱼的应激水平和肉质有不同的影响，根据测定结果和实际工厂的生产需求，CO₂浓度为（650±50） mg/L，麻醉时间70 min，水温4 ℃时，草鱼的应激水平较低，鱼肉品质较好。2）在贮藏期间，与击晕组比较，CO₂处理明显延迟草鱼僵硬期的开始和消退，并进一步延缓IMP的分解和Hx的形成，更好地保证了鱼肉的新鲜度。综上，在合适的参数下，CO₂处理对草鱼是一种有效且友好的致死方式，与传统击晕相比，可以减少应激反应，提升鱼肉品质。本研究可为CO₂技术在水产加工业的应用提供新的理论支持和研究思路，对开发一种能够提升淡水鱼品质、保护鱼福利且能应用于加工生产的宰杀技术具有重要意义。

Abstract

This study aimed to explore the effect of CO₂ anesthesia as a humane slaughtering method on the physiological stress and meat quality of grass carp. Three anesthetic factors including CO₂ anesthesia concentration， anesthesia time， and anesthesia temperature were set to treat grass carp， and serum biochemical indexes， rigor index， whiteness， and water holding capacity were measured. Additionally， the effects of CO₂ treatment on the quality of grass carp muscle during storage was explored， taking traditional stunning methods as a control. The results showed that：1） Different factors had varying impact on the stress level and meat quality of grass carp. According to the measurement results and actual production needs of the factory， the optimal settings were determined to be a CO₂ concentration of （650±50） mg/L， anesthesia time of 70 minutes， and water temperature of 4 °C. These settings resulted in reduced stress levels for the grass carp and improved fish meat quality.2） During storage， compared with the stunning group， CO₂ treatment significantly delayed in rigor onset and resolution， and further delayed the decomposition of IMP and the formation of Hx， better ensuring the freshness of the fish meat. In summary， under appropriate parameters， CO₂ treatment is an effective and humane method of slaughtering grass carp， which can reduce stress response and improve the quality of fish meat compared to traditional stunning methods. This study provides new theoretical support and research ideas for the application of CO₂ technology in the aquatic processing industry， with significant implications for the development of slaughter technology to enhance the quality of freshwater fish， protect fish welfare， and advance processing and production practices.

Graphical abstract

关键词

草鱼 / CO₂麻醉 / 应激 / 贮藏品质 / ATP关联物

Key words

grass carp / CO₂ anesthesia / stress / storage quality / ATP-related compounds

鱼类在捕捞、运输、宰杀过程中会受到各种应激压力，导致鱼体发生代谢紊乱、酶功能障碍等不利的生理变化，从而影响鱼类的品质和价值^［1-2］。当前，鱼类能否感受到外源应激以及是否存在应激反应一直存在争议^［3］。致死是鱼类加工的第一个环节，该过程中产生的应激与鱼体尸僵和解僵、鱼肉品质、蛋白质理化和功能特性的变化密切相关，因此有必要在宰杀过程中提供适当的条件，并尽可能快速、无痛地致死鱼类，最大限度地提高鱼类的品质和福利，提升其食用价值及商业价值^［4］。鱼类的致死方法有多种，如击晕头部、CO₂麻醉、去鳃、放血、电击等^［5］。其中，由于CO₂具有化学惰性、价格低廉、鱼体无残留、对操作者和环境安全等优势，CO₂麻醉一直被广泛用于大西洋鲑鱼、大菱鲆等海水鱼类和淡水鱼类的保活运输当中^［6-7］。Dong等^［8］研究发现饱和CO₂处理能减少大黄鱼的死前痛苦和应激反应，相较于敲头击晕，CO₂处理的大黄鱼肌原纤维蛋白（Myofibrillar protein， MP）结构变化小、羰基含量低、表面疏水性好。Oliveira等^［9］探讨CO₂麻醉、低温和电击晕3种致死方法对细磷鲳（Piaractus mesopotamicus）生理应激和肌肉品质的影响，结果显示CO₂致死的细磷鲳鱼片黄度更高，且CO₂麻醉组的血浆皮质醇更低，宰杀时的应激反应压力更小。陈名帅^［10］研究了宰前CO₂饱和水溶液处理对罗非鱼和金鲳鱼品质的影响，发现相较于敲头致晕，常温CO₂水溶液麻醉更适合罗非鱼片的生产加工，冰水CO₂水溶液麻醉更适合应用于金鲳鱼的宰杀工艺。

目前CO₂麻醉技术大多应用于保活运输中，用于鱼类致死方式的研究相对较少且主要聚焦于海水鱼等鱼类。随着我国居民对于淡水鱼需求的不断增加，使得淡水鱼产品的质量安全面临更多挑战。其中草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国“四大家鱼”之一，且草鱼肉质鲜嫩，价格适中，深受消费者喜爱^［11］。目前，尚缺乏CO₂麻醉草鱼的针对性致死研究，因此本研究将CO₂麻醉作为一种友好致死方式，探讨麻醉因素（CO₂浓度、麻醉时间和温度）对草鱼应激水平和贮藏品质的影响，并与传统击晕法进行比较，通过僵直指数、血清生化指标、鱼肉白度和持水力、ATP相关化合物及K值等指标，评估草鱼鱼片在4 ℃贮藏期间的品质变化，旨在为淡水鱼的品质保持和质量控制提供新的理论支持和研究思路。

1　材料与方法

1.1　材料及试剂

鲜活草鱼（均重（1.21±0.25） kg，长度（42.50±2.50） cm）购于浙江湖州秋山水产市场，试验前禁食暂养24 h。腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）标准品、二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP）标准品、肌苷酸（Inosine monphosphate，IMP）标准品、次黄嘌呤（Hypoxanthine，Hx）标准品、氢氧化钠、酚酞，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，色谱纯，杭州邦易化工有限公司。

1.2　仪器及设备

Color Quest XE色差仪，上海韵鼎国际贸易有限公司；PHS-25 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；F6/10高速分散剂，德国 Fluko 公司；HH-4数显恒温水浴锅，上海邦西科技仪器有限公司；AR2 130分析天平，上海力衡仪器仪表有限公司；TU-1 900双束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CR21GIII高速冷冻离心机，日立Hitachi公司；UltiMate 3 000高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司；QH-1 500型汽水混合机，浙江瑞安宝利达机械厂。

1.3　试验方法

1.3.1　不同CO₂浓度对草鱼的影响

QH-1 500型汽水混合机制备得到CO₂水溶液，将草鱼随机置于4 ℃的不同浓度CO₂水溶液的鱼缸中，每缸4尾，采用DZ/T 0064.47—2021《地下水质分析方法 游离二氧化碳的测定滴定法》测定各鱼缸水中CO₂浓度分别为：（350±50）、（650±50）、（950±50）和（1 250±50） mg/L，以草鱼停止鳃盖运动为CO₂麻醉致死的截点，观察记录CO₂麻醉草鱼过程中的行为状态。对照组在正常水中暂时饲养草鱼，随后击昏放血，用皮下注射器从尾静脉采集血液，鱼被去鳞、去内脏、清洗，然后切片，取鱼背部肌肉取样。

1.3.2　不同麻醉时间对草鱼的影响

根据前期探索性试验结果，将草鱼随机置于装有CO₂浓度为（650±50） mg/L，温度为4 ℃的水溶液中，每缸4尾，然后用CO₂水溶液分别麻醉处理草鱼55、70、85和100 min。对照组草鱼先在正常水中养殖，随后采用击晕放血方式致死，去除鳞片和内脏，用水清洗然后切片，取鱼背部肌肉取样。

1.3.3　不同温度对草鱼的影响

将草鱼随机置于装有CO₂浓度为（650±50） mg/L的水溶液中，每缸4尾，控制各鱼缸水温为：0、4、8、12和16 ℃左右，直至草鱼停止鳃盖运动，放血取样。对照组草鱼击晕头部后放血，然后去除鳞片和内脏，用水清洗切片，取鱼背部肌肉取样。

1.3.4　致死方式对草鱼的影响

草鱼随机分为4组，分别记录体重和身长。采取以下4种致死方式：1）击晕头部-剖肚放血：木棍击晕草鱼头部，直至昏迷无反应后剖肚放血；2）击晕头部-断尾放血：木棍击晕草鱼头部，直至昏迷无反应后断尾放血；3）CO₂麻醉致死-剖肚放血：CO₂麻醉至草鱼停止鳃盖运动后，剖肚放血；4）CO₂麻醉致死-断尾放血：CO₂麻醉至草鱼停止鳃盖运动后，断尾放血。CO₂麻醉的条件为：CO₂浓度为（650±50） mg/L，麻醉时间70 min，水温4 ℃。草鱼失去知觉后，用皮下注射器从尾静脉采集血液样本于抗凝离心管中，然后取出鱼头、鱼鳞和内脏。取每条草鱼背部肌肉切成2块鱼片，清洗干净，水分沥干后均匀地置于4 °C进行贮藏试验。

1.3.5　行为状态分析

草鱼被放在一个装有不同浓度CO₂液体的水箱中，它通常会对环境变化做出快速的行为反应。根据表1观察分析其行为状态。

1.3.6　僵直指数的测定

参考Gasco等^［12］的方法并稍作改动。草鱼在4 ℃冰箱中贮藏72 h，在不同时间点迅速取出草鱼放在水平桌面上，一半贴在桌面上，另一半悬挂在桌外。刻度尺记录桌面到尾鳍最下端的距离为L₀，并在不同的贮藏时间取出草鱼，量取桌面到尾鳍最下端距离为L_t （t为贮藏时间）。僵直指数（Rigor index，RI）按照以下公式计算：

\mathrm{僵直}\mathrm{指数}=\frac{L_{\mathrm{0}}-L_t}{L_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

式中：L_{\mathrm{0}}为初始时草鱼尾鳍最下端到桌面的距离，cm；L_t 为不同贮藏下草鱼尾鳍最下端到桌面的距离，cm。

1.3.7　血清生化指标的测定

采集血样在1.5 mL抗凝离心管（含有肝素钠）中，在4 ℃下以3 000 g离心15 min后收集血清，并在-80 ℃下储存直至血清指标评估^［13］。血液中葡萄糖含量按照测定试剂盒（货号：S0201，碧云天生物技术有限公司）提供的方法检测。血液中乳酸含量按照乳酸测定试剂盒（货号：A019，南京建成生物工程研究所）提供的方法检测。

1.3.8　白度和血红蛋白含量的测定

鱼片颜色使用ColorQuest XE色度计测定，测量之前仪器用标准白板校准。测量L^* （明度）、a^* （红度/绿度）和b^* （黄度/蓝度）并平行测量6次，鱼肉白度按照以下公式计算^［14］：

\mathrm{鱼肉}\mathrm{白度}=\mathrm{100}-[{\left(\mathrm{100}-L^{*}\right)}^{\mathrm{2}}+a^{*\mathrm{2}}+b^{*\mathrm{2}}{]}^{\raisebox{1ex}{$\mathrm{1}$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$\mathrm{2}$}\right.}（2）

式中：L^{*}为鱼肉测定的白度数值；a^{*}为鱼肉测定红绿方向的颜色数值；b^{*}为鱼肉测定黄蓝方向的颜色数值。

按照Sabow等^［15］的方法提取草鱼肌肉中的血红素蛋白，并将上清液等分储存在-80 ℃下，直到血红蛋白评估。参照Goyal等^［16］改良的动力学技术评估血红蛋白，其中血红素作为化学催化剂，将过氧化氢分解为水和新生氧气，新生的氧气氧化邻甲苯胺，使氧化产物呈现蓝绿色。

1.3.9　持水力的测定

蒸煮损失的测定参照Li等^［17］的方法并稍作改动。将鱼肉切成1 cm\times1 cm\times1 cm的鱼块，称重（M₁ ）装袋后在85 ℃的水浴中煮15 min。待鱼块恢复至室温后，擦去鱼肉表面水分后称重（M_t，其中t为贮藏时间）。蒸煮损失表示为鱼肉蒸煮后损失的质量（M₁-M_t ）占初始质量的百分比。

离心损失的测定参照Zhang等^［4］的方法，将鱼肉切成2 g左右的鱼块称重为W₁，用滤纸包裹， 1 600 g离心10 min，再次称重肌肉为W₂；离心损失表示为鱼肉离心后损失的质量（W₁-W₂）占初始质量的百分比。

1.3.10　ATP关联物及K值的测定

ATP关联物的提取参考Anders等^［18］的方法，并稍作修改。1 g鱼肉样品加入2 mL冰冷的10%高氯酸匀浆，以5 000 r/min离心3 min，获得的沉淀物用2 mL冰冷的5%高氯酸洗涤，并以5 000 r/min离心3 min。重复该过程2次，将所有上清液收集在50 mL离心管中。用1 和10 mol/L NaOH调节上清液的pH至6.4~6.5。然后，将混合物以5 000 r/min离心3 min，获取上清液后，使用中和的5%（v/v）高氯酸溶液（pH 6.4，浓氨水调节pH）将溶液定容至10 mL，0.22 μm膜过滤并储存在-20 ℃下供进一步分析。

HPLC条件：COSMOSIL 5C18PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾（体积比1∶1）溶液，用磷酸调至pH为6.8；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：254 nm。通过保留时间定性及外标法定量，根据相应的标准对ATP、IMP和Hx的含量进行测定和计算，K值计算如下：

K=\frac{HxR+Hx}{\mathrm{A}\mathrm{T}\mathrm{P}+\mathrm{A}\mathrm{D}\mathrm{P}+\mathrm{A}\mathrm{M}\mathrm{P}+\mathrm{I}\mathrm{M}\mathrm{P}+\mathrm{H}\mathrm{x}\mathrm{R}+\mathrm{H}\mathrm{x}}\times \mathrm{100}\%（3）

式中：ATP为样品中腺苷三磷酸的含量，μmol/g；ADP为样品中腺苷二磷酸的含量，μmol/g；AMP为样品中腺苷酸的含量，μmol/g；IMP为样品中肌苷酸的含量，μmol/g；HxR为样品中次黄嘌呤核苷的含量，μmol/g；Hx为样品中次黄嘌呤的含量，μmol/g。

1.4　统计分析

各试验组取3个平行组的平均数作为试验结果，采用SPSS 26.0进行ANOVA单因素方差分析及Duncan检验（P<0.05），以平均值±标准差表示。图表绘制采用Origin 2024软件。

2　结果与分析

2.1　不同CO₂浓度对草鱼行为状态的影响

不同CO₂浓度麻醉条件下鱼体的行为状态如图1所示。结果显示，对照组草鱼在正常水中能一直保持正常的游泳行为。在（350±50） mg/L处理组，草鱼在麻醉10 min后失去身体平衡，之后一直保持微弱的鳃盖运动和鱼鳍摆动，直至（90±10） min草鱼停止鳃盖运动；（650±50） mg/L处理组草鱼在40 s内出现快速游泳或逃逸等活动，（50±5）min时停止鳃盖运动；（950±50） mg/L处理组草鱼在最初2 min内表现出快速游泳等行为，20 min时出现呼吸振幅降低、运动丧失的症状，（30±5） min时无鳃盖运动；（1 250±50） mg/L处理组草鱼在45 s时就出现翻白肚行为，停止鳃盖运动时间约在（10±2） min。

2.2　不同CO₂浓度对草鱼品质的影响

由图2（a）可知，随着贮藏时间的延长，各组草鱼的僵直指数呈现先上升后下降的趋势，对照组草鱼在12 h达到最大僵直指数75.71%，显著高于其他4组（P<0.05）；其次（650±50） mg/L组草鱼在12 h达到最大僵直指数61.59%，（950±50） mg/L组草鱼在12 h时达到最大僵直指数55.63%，（350±50） mg/L草鱼也在12 h时达到最大僵直指数45.65%，（1 250±50） mg/L组草鱼在18 h时达到最大僵直指数56.93%。由图2（b）可知，不同CO₂浓度麻醉条件下草鱼的血浆葡萄糖含量差异显著，其中（950±50） mg/L组草鱼的血糖含量达到223.18 mg/dL，显著高于其他4组（P<0.05）。不同CO₂浓度麻醉条件下未观察到乳酸含量的显著差异，各组乳酸含量在21.91~25.47 mmol/L范围中波动。由图2（c）可知，（1 250±50） mg/L组处理鱼肉的白度为44.40，显著低于其他4组（P<0.05），当CO₂浓度控制在（950±50） mg/L时，鱼肉可以保持原有的白度，超过这个浓度范围，鱼肉的白度会显著下降。除去对照组，（650±50） mg/L组鱼肉的血红蛋白含量最低，为27.42 mg/100 g，其次是（350±50）mg/L组29.82 mg/100 g和（1 250±50） mg/L组28.93 mg/100 g。

2.3　不同麻醉时间对草鱼品质的影响

由图3（a）知，与其他组相比，对照组的血糖含量最高，达到245.01 mg/dL，麻醉处理55 和70 min组的草鱼血糖值最低，分别为211.71和213.46 mg/dL。与其他4组相比，麻醉处理55 min组草鱼的乳酸含量最高，达到22.19 mmol/L；麻醉处理85 min组草鱼的乳酸含量最低，达15.25 mmol/L，其次是麻醉处理70 min组，乳酸含量为17.81 mmol/L。由图3（b）可知，麻醉处理55 min的鱼肉白度达到46.39，显著高于其他4组（P<0.05）；麻醉处理100 min的鱼肉白度最低，为43.11。与其他组相比，对照组及麻醉处理55 min组鱼肉的血红蛋白含量最高，分别达到32.39和32.11 mg/100 g。由图3（c）可知，不同麻醉时间下的草鱼鱼肉持水性存在显著差异（P<0.05），与其他4组相比，对照组鱼肉的蒸煮损失和离心损失均最低，分别为22.99%和18.36%；麻醉处理55 min组鱼肉的蒸煮损失和离心损失均最高，分别达到27.16%和24.46%。

2.4　不同温度对草鱼品质的影响

由图4（a）可知，与其他组相比，16 ℃组的草鱼血糖含量最高，达到307.53 mg/dL；其次是0 ℃组的草鱼，血糖含量达到270.83 mg/dL。与此同时，0 ℃组的草鱼乳酸水平最高，达到9.22 mmol/L。0 ℃组的草鱼血糖和乳酸含量均较高，这可能是冰水混合物和CO₂麻醉的双重压力所导致。4 ℃组的草鱼均显示出较低的血糖值（209.69 mg/dL）和乳酸值（3.38 mmol/L）。由图4（b）可知，4 ℃组的鱼肉白度达到47.67，显著高于其他5组（P<0.05），并且所有CO₂麻醉处理组的鱼肉白度均显著高于对照组（P<0.05）。与其他组相比，4 和8 ℃处理组鱼肉的血红蛋白含量最低，分别为27.15和27.09 mg/100 g。由图4（c）可知，与其他组相比，对照组鱼肉的蒸煮损失最高，达到24.72%；其次是0 ℃组和12 ℃组，蒸煮损失率分别达到23.62%和22.94%；4 ℃组鱼肉蒸煮损失率最低，为17.19%。0 ℃组的离心损失达到23.46%，显著高于其他5组（P<0.05），其他5组鱼肉的离心损失间无显著性差异。

2.5　致死方式对草鱼贮藏品质的影响

由图5（a）可知，与击晕组相比，CO₂麻醉致死组显著延迟了草鱼僵硬的开始和消退。击晕组在死后20 h达到最大僵直程度（70.81%和77.93%），CO₂麻醉致死组在死后36 h才达到最大僵直程度（83.65%和80.54%）。由图5（b）可知，击晕-剖肚组的初始血糖含量最高，达到245.01 mg/dL；其次是击晕-断尾组和CO₂麻醉-剖肚组，分别为199.68和203.43 mg/dL；CO₂麻醉-断尾组初始血糖含量最低，为171.65 mg/dL。与此同时，击晕组的初始乳酸水平均显著高于CO₂麻醉致死组（P<0.05），其中击晕-断尾组的乳酸水平最高，达到15.13 mmol/L；其次是击晕-剖肚组，乳酸含量为12.43 mmol/L；CO₂麻醉致死组的乳酸水平分别为5.43和4.97 mmol/L。

由图5（c）可知，初始时4组草鱼的鱼肉白度分别为50.94、49.95、47.77和50.00，其中CO₂-剖肚组的鱼肉白度较低，这可能是放血方式导致的鱼肉白度差异。贮藏24 h后，击晕-剖肚组的鱼肉白度为50.01，显著高于其他3组（P<0.05）。贮藏72 h后，4组草鱼的鱼肉白度均有所下降，其中击晕-剖肚组为49.91，击晕-断尾组为47.39，CO₂麻醉-剖肚组为45.32，CO₂麻醉-断尾组为47.00。由图5（d）可知，4组鱼肉的初始蒸煮损失分别为17.38%、17.88%、16.04%和18.26%。在贮藏72 h后，4组鱼肉的蒸煮损失呈现上升的趋势，分别达到21.55%、22.71%、21.46%和20.90%，是蒸煮损失初值的1.24、1.27、1.34和1.14倍。由图5（e）可知，随着贮藏时间的延长，4组鱼肉的离心损失均呈现显著上升的趋势（P<0.05），在贮藏72h后，4组鱼肉的蒸煮损失分别达到16.75%、16.94%、17.53%及16.38%，是离心损失初值的1.16、1.32、1.48及1.51倍。

由图6（a）可知，随着贮藏时间的延长，4组鱼肉的ATP含量呈现下降的趋势。击晕组的初始ATP含量（2.78和2.58 μmol/g）显著低于CO₂麻醉致死组（4.16和4.03 μmol/g）（P<0.05），贮藏72 h后，4组鱼肉的ATP含量分别降至0.38、0.39、0.39和0.39 μmol/g。由图6（b）可知，贮藏24 h时，4组鱼肉的IMP含量达到最高值，其中CO₂麻醉致死组鱼肉的IMP含量分别达到3.18和2.91 μmol/g，显著高于击晕组（2.09和2.29 μmol/g）。贮藏72 h后，4组鱼肉的IMP含量分别降至0.45、0.47、0.86和0.87 μmol/g，CO₂麻醉组的IMP水平显著高于击晕组（P<0.05）。由图6（c）可知，4组鱼肉的初始Hx含量分别为0.30、0.32、0.24和0.24 μmol/g，随着贮藏时间的延长，4组鱼肉的Hx含量呈现上升的趋势。在贮藏72 h后，击晕-剖肚组鱼肉的Hx含量最高，达到0.96 μmol/g，其次是击晕-断尾组，达到0.92 μmol/g。由图6（d）可知，随着Hx含量的增加和ATP含量的降低，4组鱼肉的K值随贮藏时间的延长而显著升高。在贮藏72h后，击晕组的K值分别达到80.26%和78.01%，CO₂麻醉组的K值分别为61.43%和54.35%。

3　讨 论

不当的致死方式会引起鱼类的各种行为反应，而行为反应会导致鱼体平衡的改变，从而引起生理应激反应和鱼肉品质的改变^［19］。本研究中，（350±50） mg/L处理组草鱼麻醉致死时间为（90±10） min，（650±50） mg/L处理组草鱼麻醉致死时间为（50±5） min，（950±50） mg/L处理组草鱼麻醉致死时间为（30±5） min，（1 250±50） mg/L处理组草鱼麻醉致死时间为（10±2） min。此外，在（950±50） mg/L和（1 250±50） mg/L处理组的草鱼都出现鳞片掉落、粘液分泌和鳃出血现象，与Rahmanifarah等^［20］发现在CO₂饱和条件下鲤鱼鳃出血和鲑鱼的损伤和鳞片脱落的现象类似。研究发现CO₂浓度越高，草鱼麻醉致死时间越短，高浓度的CO₂麻醉缩短了草鱼的致死时间，但是会破坏鱼体外观，直接影响消费者的挑选与购买。

不同CO₂麻醉浓度对草鱼的应激水平和肌肉品质有着显著影响。鱼体致死时的应激水平与鱼类的宰后品质有着紧密联系，其中鱼体的僵直程度和血清生化指标广泛用于评价鱼体死前应激程度。本研究表明，CO₂浓度对草鱼的最大僵直程度和鱼体尸僵解僵的开始有着显著影响（P<0.05），其中（1 250±50） mg/L处理延缓了草鱼僵直和解僵的开始（死后18 h），可能原因是高浓度CO₂水溶液处理引起鱼体强烈的宰杀应激，增加了肌纤维结构损伤破坏或导致更多肌纤维-肌纤维膜的分离；以及死后肌肉暴露于低pH条件下导致蛋白质变性，可能有助于蛋白水解酶接触底物，从而增强蛋白水解并加速肌肉退化的过程，最终影响了鱼体尸僵的正常发生^［21］。同时由血清生化指标可知，在各CO₂浓度组别中，（950±50） mg/L处理组的草鱼血浆葡萄糖含量最高，其次是（350±50） mg/L组和（1 250±50 ）mg/L组，（650±50） mg/L组草鱼的血糖含量最低，这表明在（650±50） mg/L浓度条件下，草鱼麻醉致死时的宰杀应激较小。而鱼类的外部行为表现是各种生理现象的综合结果，当外界出现干扰时，鱼体会调动能量储备来应对并确保鱼体能够承受的压力，进而引起体内血糖水平的差异^［22］。（950±50） mg/L处理组的草鱼在麻醉致死过程中表现出持续的逃避反应和厌恶行为，草鱼经历CO₂麻醉窒息和空气窒息后引起生理紊乱，诱发鱼体的强烈应激，最终导致血糖水平较高。（1 250±50） mg/L处理组的草鱼可能被过度麻醉，导致直接死亡，高浓度CO₂处理通过缩短草鱼异常活动时间成功减缓了草鱼的痛苦，血浆葡萄糖含量降低^［23］。在各CO₂浓度试验中未观察到乳酸含量的显著差异，可能是鱼体的状态和环境的影响，还可能是CO₂水溶液使各组鱼不能正常呼吸，都产生乱游乱动并且激烈挣扎的行为，致使肌肉收缩产生大量的乳酸积累在肌肉血管中，从而对乳酸含量产生影响^［24］。

鱼肉的外观颜色是评价水产品感官品质的重要指标，也直接影响到消费者的挑选和购买。同时鱼肉的外观颜色与脂肪氧化和肌红蛋白水平有一定的关系，鱼肉中残留的血红蛋白是脂质氧化和微生物生长繁殖的重要促进剂^［25］，血红蛋白含量的增加会缩短鱼肉保质期，甚至导致鱼片的不良变色。本研究表明，CO₂浓度控制在（950±50） mg/L时，鱼肉可以保持原有的白度，而高浓度CO₂水溶液会导致鱼肉蛋白质变性和液体的损失，从而导致肉表面对光的反射发生变化^［26］，最终导致鱼肉的白度显著降低。其中（650±50） mg/L处理组鱼肉的血红蛋白含量最低，鱼肉的残留血红蛋白含量越低，表明草鱼放血更充分，更有利于鱼肉的保存。综上，从草鱼麻醉后的应激水平和鱼肉品质角度分析，结合实际麻醉致死时间，（650±50） mg/L浓度可以推荐为鱼类麻醉的合适浓度。

不同麻醉时间对草鱼的应激水平和肌肉品质影响程度不同，在不同麻醉时间的组别中，草鱼的血糖含量呈现先降低后升高的趋势，乳酸水平呈现升高的趋势。麻醉时间70 min组的血浆葡萄糖和乳酸含量较低，这表明该麻醉时间下草鱼的应激反应较小。麻醉时间85 min之后的时间组别中，乳酸含量呈现下降趋势，可能是草鱼逃跑行为引起的应激在麻醉处理期间已进入恢复期，导致乳酸值恢复到基本值。Guan等^［27］研究结果也表明，高氧CO₂暴露能够诱导罗非鱼的应激反应，导致皮质醇、血糖和乳酸含量的变化，但是这种应激变化是温和且暂时的。本研究表明，麻醉处理55 min的鱼肉白度较高，血红蛋白含量较高，麻醉处理70 min之后的时间组别，鱼肉的血红蛋白含量显著降低，放血更充分，有效避免了鱼血对鱼肉品质的影响，而充分的放血可以避免鱼血深入到肌肉组织中而影响到鱼肉的色泽和风味，从而减轻淡水鱼的土腥味^［28］。本研究表明，麻醉处理55 min的鱼肉蒸煮损失和离心损失较高，鱼肉的持水力较差，而肌肉的持水能力直接影响了肉类的口感、营养成分、色泽等品质^［29］。在不同麻醉时间的组别中，麻醉时间在70 min及之后的时间组别，草鱼鱼肉的蒸煮损失和离心损失更低，鱼肉的持水能力更好。综上，从草鱼麻醉后的应激水平和鱼肉品质角度分析，结合考虑实际生产加工时间，70 min的麻醉时间可以推荐为鱼类麻醉的合适处理时间。

不同温度处理对草鱼的应激水平和鱼肉品质也有着重要的影响，温度4 ℃条件下草鱼的血清生化指标较低，并且此温度条件下鱼肉的白度也显著高于其他组（P<0.05），鱼肉的血红蛋白含量显著更低（P<0.05），蒸煮损失率和离心损失率也较低，肌肉的持水能力更好。可能原因是在4 ℃冷水条件下，草鱼降低了自身的活动和对CO₂水溶液的敏感度。目前许多研究对传统的CO₂麻醉进行改进，也有研究证明在CO₂麻醉致死大西洋鲑鱼的过程中，降低水温能提高动物福利和麻醉效率^［30］。综上，从草鱼麻醉后的应激水平和鱼肉品质角度分析，4 ℃的处理温度可以推荐为鱼类麻醉的合适温度。

本研究表明，不同致死方式对草鱼的应激水平和贮藏品质的影响较大。与击晕组相比，CO₂麻醉致死显著延迟了草鱼僵直的开始和消退。这与Bagni等^［31］研究结果一致，鱼体的僵直与死后肌肉组织中乳酸产生引起的酸化过程有关，而鱼体的应激反应与死亡前的致死方法有关，击晕会导致肌肉能量储备耗尽，因此僵硬开始得更早。而Roth等^［32］研究表明与电击和击晕的致死方法相比，CO₂麻醉致死导致大西洋鲑鱼僵直的开始和消退更早，这可能是淡水鱼和海鱼的种类区别，以及麻醉条件不合适等所导致的结果差异。从血清生化指标角度分析，CO₂麻醉组显示出较低的血糖含量和乳酸水平，这表明CO₂麻醉致死引起的应激反应更小，这与Caggiano等^［33］研究表明使用CO₂麻醉致死海鱼和鲈鱼引起的应激反应较小保持一致。Acerete等^［34］研究结果也表明比较CO₂麻醉和冰窒息方法，CO₂麻醉法在应激指标方面的表现略好。从鱼肉白度和持水力角度分析，4组不同致死方式草鱼的白度均有所下降，而不同放血方式（剖肚放血和断尾放血）之间的结果差异显著。初始时CO₂麻醉-断尾组鱼肉的离心损失最低，宰杀应激更小，且在贮藏过程中鱼肉的蒸煮损失增加最慢，鱼肉持水力较好。

在鱼类的贮藏过程中，ATP的降解途径如下：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，其中IMP、HxR和Hx，通常被用作细菌腐败前鱼类新鲜度的指标^［35］。击晕组的初始ATP含量显著低于CO₂麻醉组，这表明击晕处理的致死方式使草鱼产生更强烈的应激反应，加速了糖原糖酵解和ATP消耗^［19］。随着贮藏时间的增加，ATP迅速降解为IMP，IMP是一种重要的呈鲜味组分，与鱼的新鲜度密切相关。本研究表明，在贮藏期间CO₂麻醉组的IMP含量始终高于击晕组，这表明CO₂麻醉处理能有效延缓鱼肉IMP的降解，保持鱼肉贮藏过程的鲜味。总体来看，4组草鱼鱼肉的IMP含量呈现先上升后下降的趋势，这与Huang等^［36］的结果一致。随着贮藏时间的延长，4组鱼肉的Hx含量呈现上升的趋势，且击晕组Hx含量明显高于CO₂麻醉组。Hx含量的增加会导致鱼不良风味的增加，且Hx的积累反映了鱼体自溶降解的初始阶段和细菌的腐败阶段^［37］。K值是评价鱼类新鲜度的常用指标，也是评价水产品新鲜度最可靠、最重要的指标之一^［38］。4组鱼肉的K值随贮藏时间的延长而显著升高。贮藏72 h后，击晕-剖肚组鱼肉的K值最高，鲜度最差；CO₂麻醉-断尾组鱼肉的K值最低，鲜度最好。从ATP关联物含量和K值角度分析，CO₂麻醉处理可以延缓鱼肉中ATP的降解，延缓Hx的产生，从而延缓鱼的不良风味的产生，更好地保证鱼肉的新鲜度。

4　结 论

本研究探讨了CO₂麻醉的3个因素（浓度、时间、温度）对草鱼应激水平和肌肉品质的影响。结果表明，CO₂麻醉浓度为（650±50） mg/L，麻醉时间为70 min，水温为4 ℃时，草鱼的应激水平较低，鱼肉品质更好，操作程序更实用，能满足市场对优质鱼肉的需求。在贮藏过程中，与传统击晕法相比，CO₂处理后的草鱼具有较低的应激水平，能延缓鱼肉不良风味的产生，更好地保证鱼肉新鲜度。综上，从维持鱼肉新鲜度及保护鱼类福利的角度来看，CO₂麻醉技术是一种有潜力的鱼类致死技术。

参考文献

[1] Browman H I， Cooke S J， Cowx I G， Derbyshire S W G， Kasumyan A， Key B， Rose J D， Schwab A， Skiftesvik A B， Stevens E Don， Watson C A， Arlinghaus R. Welfare of aquatic animals： Where things are， where they are going， and what it means for research， aquaculture， recreational angling， and commercial fishing ［J］. ICES Journal of Marine Science， 2019， 76（1）： 82-92

[2] de la Rosa I， Castro P L， Ginés R. Twenty years of research in seabass and seabream welfare during slaughter［J］. Animals： an Open Access Journal from MDPI， 2021， 11（8）： 2164

[3] Zhang L T， Li Q， Hong H， Luo Y K. Tracking structural modifications and oxidative status of myofibrillar proteins from silver carp （ Hypophthalmichthys molitrix ） fillets treated by different stunning methods and in vitro oxidizing conditions ［J］. Food Chemistry， 2021， 365： 130510

[4] Zhang L T， Zhang Y Q， Jia S L， Li Y， Li Q， Li K F， Hong H， Luo Y K. Stunning stress-induced textural softening in silver carp （ Hypophthalmichthys molitrix ） fillets and underlying mechanisms ［J］. Food Chemistry， 2019， 295： 520-529

[5] Vargas Baldi S C， Parisi G， Bonelli A， Balieiro J C C， Lapa Guimarães J， Macedo Viegas E M. Effects of different stunning/slaughter methods on frozen fillets quality of cobia （ Rachycentron canadum ）［J］. Aquaculture， 2018， 486： 107-113

[6] Zhang J， Iqbal A， Murtaza A， Zhou X， Xu X Y， Pan S Y， Hu W F. Effect of high pressure carbon dioxide on the browning inhibition of sugar-preserved orange peel［J］. Journal of CO ₂ Utilization ， 2021， 46： 101467

[7] 胡鑫， 丁晨雨， 叶勤， 吴荣华， 张倩， 李虹， 李云. 二氧化碳麻醉对鲢生理生化指标及神经调控相关基因表达的影响［J］. 淡水渔业， 2020， 50（1）： 9-14

[8] Hu X， Ding C Y， Ye Q， Wu R H， Zhang Q， Li H， Li Y. Effects of carbon dioxide anesthesia on physiological and biochemical indexes and genes expression related to nerve regulation in silver carp（ Hypophthalmichthys molitrixs ） ［J］. Freshwater Fisheries， 2020， 50（1）： 9-14 （in Chinese）

[9] Dong Y X， Zhang H Z， Guo M J， Mei J， Xie J. Effect of different slaughter/stunning methods on stress response， quality indicators and susceptibility to oxidation of large yellow croaker （ Larimichthys crocea ）［J］. Veterinary Research Communications， 2023，47（4）： 1879-1891

[10] Oliveira Filho P R C， Oliveira P J M G， Viegas E M M， Melo M P， Natori M M， Baldi S C V. Physiological stress and meat quality of pacu （ Piaractus mesopotamicus ） submitted to CO₂ narcosis， hypothermia and electrical stunning ［J］. Aquaculture Research， 2021， 52（10）： 5034-5043

[11] 陈名帅.宰前二氧化碳处理对罗非鱼和金鲳鱼肉品质及应激性的影响［D］. 南宁：广西大学， 2014

[12] Chen M S. Effect of pre-slaughter carbon dioxide anesthesia on Ttilapia and goldenpompano flesh quality and stress responses［D］. Nanning： Guangxi University， 2014 （in Chinese）

[13] 王发祥， 李强， 俞健， 李向红， 王建辉， 张付兰， 刘永乐. 草鱼冷藏过程中肌肉蛋白质结构特征的变化［J］. 食品与发酵工业， 2015， 41（6）： 196-199

[14] Wang F X， Li Q， Yu J， Li X H， Wang J H， Zhang F L， Liu Y L. Changes in structural properties of muscle protein in grass carp during cold storage［J］. Food and Fermentation Industries， 2015， 41（6）： 196-199 （in Chinese）

[15] Gasco L， Gai F， Rotolo L， Parisi G. Effects of different slaughtering methods on rigor mortis development and flesh quality of tench （ Tinca tinca ）［J］. Journal of Applied Ichthyology， 2014， 30： 58-63

[16] Refaey M M， Tian X， Tang R， Li D P. Changes in physiological responses， muscular composition and flesh quality of channel catfish Ictalurus punctatus suffering from transport stress［J］. Aquaculture， 2017， 478： 9-15

[17] Benjakul S， Visessanguan W， Tueksuban J. Changes in physico-chemical properties and gel-forming ability of lizardfish （ Saurida tumbil ） during post-mortem storage in ice ［J］. Food Chemistry， 2003， 80（4）： 535-544

[18] Sabow A B， Sazili A Q， Zulkifli I， Goh Y M， Ab Kadir M Z A， Abdulla N R， Nakyinsige K， Kaka U， Adeyemi K D. A comparison of bleeding efficiency， microbiological quality and lipid oxidation in goats subjected to conscious halal slaughter and slaughter following minimal anesthesia［J］. Meat Science， 2015， 104： 78-84

[19] Goyal M M， Basak A. Estimation of plasma haemoglobin by a modified kinetic method using o-tolidine［J］. Indian Journal of Clinical Biochemistry： IJCB， 2009， 24（1）： 36-41

[20] Li D P， Jia S L， Zhang L T， Wang Z Y， Pan J F， Zhu B W， Luo Y K. Effect of using a high voltage electrostatic field on microbial communities， degradation of adenosine triphosphate， and water loss when thawing lightly-salted， frozen common carp （ Cyprinus carpio ）［J］. Journal of Food Engineering， 2017， 212： 226-233

[21] Anders N， Breen M， Skåra T， Roth B， Sone I. Effects of capture-related stress and pre-freezing holding in refrigerated sea water （RSW） on the muscle quality and storage stability of Atlantic mackerel （ Scomber scombrus ） during subsequent frozen storage ［J］. Food Chemistry， 2023， 405（Pt B）： 134819

[22] Papaharisis L， Tsironi T， Dimitroglou A， Taoukis P， Pavlidis M. Stress assessment， quality indicators and shelf life of three aquaculture important marine fish， in relation to harvest practices， water temperature and slaughter method ［J］. Aquaculture Research， 2019， 50（9）： 2608-2620

[23] Rahmanifarah K， Shabanpour B， Sattari A. Effects of clove oil on behavior and flesh quality of common carp （ Cyprinus carpio L.） in comparison with pre-slaughter CO₂ stunning， chilling and asphyxia ［J］. Turkish Journal of Fisheries & Aquatic Sciences， 2011， 11（1）： 135-143

[24] Bahuaud D， Mørkøre T， Østbye T K， Veiseth-Kent E， Thomassen M S， Ofstad R. Muscle structure responses and lysosomal cathepsins B and L in farmed Atlantic salmon （ Salmo salar L.） pre- and post-rigor fillets exposed to short and long-term crowding stress ［J］. Food Chemistry， 2010， 118（3）： 602-615

[25] Seibel H， Baßmann B， Rebl A. Blood will tell： What hematological analyses can reveal about fish welfare［J］. Frontiers in Veterinary Science， 2021， 8： 616955

[26] Ron T B， Ofek T， Smirnov M. Fish Welfare： The use of CO₂ to avoid fish suffering during preparation to processing［J］. Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh， 2021， 73

[27] 张恒， 汪玉祥， 冒森莉， 王林. 淡水鱼碳酸休眠法无水保活运输技术［J］. 水产科技情报， 2008， 35（5）： 236-240

[28] Zhang H， Wang Y X， Mao S L， Wang L. Transportation techniques for keeping freshwater fish alive without water by using carbonic acid as dormancy［J］. Fisheries Science & Technology Information， 2008， 35（5）： 236-240 （in Chinese）

[29] Nakyinsige K， Fatimah A B， Aghwan Z A， Zulkifli I， Goh Y M， Sazili A Q. Bleeding efficiency and meat oxidative stability and microbiological quality of new zealand white rabbits subjected to halal slaughter without stunning and gas stun-killing［J］. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences， 2014， 27（3）： 406-413

[30] Daskalova A. Farmed fish welfare： Stress， post-mortem muscle metabolism， and stress-related meat quality changes ［J］. International Aquatic Research， 2019， 11（2）： 113-124

[31] Guan W L， Zhao M M， Liu T T， Fan X， Chen D W. Cooling combined with hyperoxic CO₂ anesthesia is effective in improving the air exposure duration of tilapia［J］. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 14016

[32] 陈剑岚， 邵琳雅， 施文正， 陈舜胜. 不同宰杀方式对草鱼肉呈味水溶性成分的影响［J］. 食品科学， 2016， 37（17）： 27-31

[33] Chen J L， Shao L Y， Shi W Z， Chen S S. Effect of different slaughter methods on water-soluble flavor components in grass carp meat［J］. Food Science， 2016， 37（17）： 27-31 （in Chinese）

[34] Pearce K L， Rosenvold K， Andersen H J， Hopkins D L. Water distribution and mobility in meat during the conversion of muscle to meat and ageing and the impacts on fresh meat quality attributes： A review［J］. Meat Science， 2011， 89（2）： 111-124

[35] Erikson U， Hultmann L， Erik Steen J. Live chilling of Atlantic salmon （ Salmo salar ） combined with mild carbon dioxide anaesthesia ［J］. Aquaculture， 2006， 252（2/4）： 183-198

[36] Bagni M， Civitareale C， Priori A， Ballerini A， Finoia M， Brambilla G， Marino G. Pre-slaughter crowding stress and killing procedures affecting quality and welfare in sea bass （ Dicentrarchus labrax ） and sea bream （ Sparus aurata ）［J］. Aquaculture， 2007， 263（1/4）： 52-60

[37] Roth B， Moeller D， Veland J O， Imsland A， Slinde E. The effect of stunning methods on rigor mortis and texture properties of Atlantic salmon （ Salmo salar ）［J］. Journal of Food Science， 2002， 67（4）： 1462-1466

[38] Caggiano M. Quality in harvesting and post-harvesting procedures – influence on quality. Fish freshness and quality assessment for sea bass and sea bream ［J］. 2000， 51： 55-61

[39] Acerete L， Reig L， Alvarez D， Flos R， Tort L. Comparison of two stunning/slaughtering methods on stress response and quality indicators of European sea bass （ Dicentrarchus labrax ）［J］. Aquaculture， 2009， 287（1/2）： 139-144

[40] Li Q， Zhang L T， Lu H， Song S J， Luo Y K. Comparison of postmortem changes in ATP-related compounds， protein degradation and endogenous enzyme activity of white muscle and dark muscle from common carp （ Cyprinus carpio ） stored at 4 ℃ ［J］. LWT， 2017， 78： 317-324

[41] Huang Z， Liu X C， Jia S L， Luo Y K. Antimicrobial effects of cinnamon bark oil on microbial composition and quality of grass carp （ Ctenopharyngodon idellus ） fillets during chilled storage ［J］. Food Control， 2017， 82： 316-324

[42] Liu S Fan W， Zhong S Y， Ma C W， Li P L， Zhou K. Quality evaluation of tray-packed tilapia fillets stored at 0℃ based on sensory， microbiological， biochemical and physical attributes ［J］. African Journal of Biotechnology， 2010， 9（5）： 692-701

[43] Fan H B， Luo Y K， Yin X F， Bao Y L， Feng L G. Biogenic amine and quality changes in lightly salt- and sugar-salted black carp （ Mylopharyngodon piceus ） fillets stored at 4 ℃ ［J］. Food Chemistry， 2014， 159： 20-28

基金资助

浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划项目(2022C02025)

国家自然科学基金青年项目(32302177)

浙江省自然科学基金资助项目(ZCLQ24C2003)

中国博士后基金面上项目(2023M740161)