circFAM53B在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的作用

Role of circFAM53B in the inflammatory response of bovine mammary epithelial cells

摘要

为探究circFAM53B在奶牛乳房炎中的功能，以牛乳腺上皮细胞（bMECs）为研究对象，采用生物信息学对circFAM53B的功能进行预测，然后在LPS诱导的bMECs炎症中干扰或过表达circFAM53B检测其对细胞炎症、增殖和凋亡的影响。结果表明：1）奶牛circFAM53B为真实存在的环状RNA，主要定位于bMECs细胞质中。2）在LPS诱导bMECs炎症反应中，circFAM53B的表达水平极显著上调（P<0.01）。3）在bMECs炎症反应中，奶牛circFAM53B可促进炎症因子的表达和分泌，抑制细胞活力和增殖，促进细胞凋亡，加剧炎症的发展。综上，circFAM53B可能参与奶牛乳房炎的调控，促进炎症进程。本研究为奶牛乳房炎抗病分子育种奠定基础。

Abstract

To investigate the function of circFAM53B in dairy cow mastitis， this study took bovine mammary epithelial cells （bMECs） as the research object， and bioinformatics was used to predict the function of circFAM53B. The effects of circFAM53B on cell inflammation， proliferation and apoptosis were examined by interfering or overexpressing circFAM53B in LPS-induced bMECs inflammation. The results showed that： 1） Dairy cow circFAM53B was a real-existing circular RNA， mainly located in the cytoplasm of bMECs. 2） The expression level of dairy cow circFAM53B was highly significantly up-regulated in LPS-induced inflammatory response of bMECs （P<0.01）. 3） In the inflammatory response of bMECs， circFAM53B in cows can promote the expression and secretion of inflammatory factors， inhibits cell viability and proliferation， and promote apoptosis in bMECs inflammation， and exacerbate the development of inflammation. In conclusion， circFAM53B may be involved in the regulation of cow mastitis and promote the inflammatory process. This study lays a foundation for molecular breeding for resistance to cow mastitis.

Graphical abstract

关键词

环状circRNA / 奶牛 / 乳房炎 / 乳腺上皮细胞 / 大肠杆菌

Key words

circular RNA / dairy cow / mastitis / mammary epithelial cells / E.coli

乳房炎发病率高、治疗成本昂贵且会导致牛奶污染，给牧场造成巨大的经济损失^［1］，同时给奶业的健康、可持续发展带来重要挑战^［2］。引起奶牛乳房炎的原因复杂，奶牛乳房受到物理、化学和微生物刺激均可能引起炎症，但是奶牛个体的遗传因素对乳房炎的易感性和抗病性也至关重要^［3］。乳房炎的发生和发展过程受多个基因的调节，但其具体的分子调控机制不完全清晰^［4］。奶牛乳腺上皮细胞（Bovine mammary gland epithelial cells， bMECs）是奶牛乳腺免疫功能的基础细胞，可以帮助乳房抵抗病原微生物侵染。大肠杆菌（Escherichia coli）作为引起乳房炎的主要病原菌之一，其表面的毒力因子脂多糖（Lipopolysaccharides， LPS）通过激活bMECs内的Toll样受体^［5］、核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）^［6］和丝裂原活化蛋白激酶^［7］等炎症相关信号通路促进促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达^［8］，加剧乳房炎的严重程度。因此，常用LPS诱导bMECs构建细胞炎症模型，探究E.coli型奶牛乳房炎的分子调控机制。

circRNA是一种由mRNA前体经过反向剪接产生的非编码RNA。高通量测序技术的迅速发展导致circRNA相关研究爆炸式增长^［9］，越来越多的研究表明circRNA在基因表达调控^［10］、细胞功能调节^［11］、疾病发生^［12］等方面发挥着重要作用，就奶牛乳房炎而言，学者们筛选了多个差异表达的circRNA，Bai等^［13］选取健康荷斯坦奶牛和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）自然感染的患乳房炎荷斯坦奶牛的乳腺上皮组织，筛选得到19个差异表达的circRNA，其中显著差异表达的circRNA2860、circRNA5323和circRNA4027可能直接或间接地在奶牛乳房炎中起作用，这为circRNA参与奶牛乳房炎调控的潜在分子机制提供了新的见解。另外，Wang等^［14］构建了奶牛乳房炎体外模型，在LPS处理的bMECs中发现了71个不同炎症阶段的差异表达circRNA，功能分析显示这些差异表达circRNA可能通过调节众多相关信号通路参与细胞增殖、凋亡和炎症反应。但是在这些差异表达circRNA中，仅有少数的circRNA进行了功能研究，例如circ05280^［15］、circ08409^［16］和circIL27RA^［17］等。

circFAM53B是新发现的在奶牛乳房炎中差异表达的circRNA，但在奶牛乳房炎中的功能尚不清楚。本研究初次鉴定了circFAM53B的环状特性，并进行了circFAM53B在LPS诱导bMECs产生炎症反应中的作用研究，以期补充奶牛乳房炎分子调控网络，并为奶牛抗乳房炎分子育种奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　细胞

本试验采用的bMECs是经本研究团队鉴定^［18］的乳腺上皮细胞系（MAC-T）。

1.1.2　主要试剂与仪器

DMEM-高糖培养基购于Hyclone；胎牛血清（FBS）购于BI；荧光定量试剂盒；反转录试剂盒和TRIzol购于TAKARA；Ribonuclease R购于Epicentre；Lipofectamine^TM 3000购于Invitrogen；CCK-8检测试剂盒、细胞增殖检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；IL-6、IL-8和IL-1β对应的ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；PARIS核质分离试剂盒购于Life Technologies；pCD25-ciR（GFP）载体购于广州吉赛生物科技有限公司；circFAM53B干扰片段购于生工生物工程（上海）股份有限公司。多功能酶标仪、普通PCR仪、电泳凝胶成像仪和CFX96 Touch荧光定量PCR仪均为Bio-Rad公司产品；荧光倒置显微镜购于OLYMPUS。

1.2　试验方法

1.2.1　circFAM53B生物信息学分析

根据碱基序列互补原则，采用MobaXterm服务器分析预测circFAM53B可能靶向的miRNA；采用TargetScan和miRWalk在线工具预测潜在靶向miRNA的靶基因；通过欧易集团云平台中的在线工具进行靶基因的KEGG信号通路富集分析。

1.2.2　bMECs体外培养及LPS诱导bMECs炎症

将bMECs解冻后，使用含10%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，在37 ℃、5% CO₂浓度和100%饱和湿度的条件下，培养于细胞培养板中。将生长状态良好的bMECs接种于6孔板中进行培养。细胞融合度达到70%~80%后，每孔加终浓度为50 ng/μL的LPS诱导bMECs，收集未经处理和LPS处理6 h的bMECs，提取细胞总RNA，用于逆转录cDNA。

1.2.3　核质分离与RNA提取

参照PARIS细胞核质分离试剂盒说明书中的操作步骤，分离bMECs的细胞核和细胞质RNA；Trizol法提取bMECs的总RNA。使用多功能酶标仪检测RNA的浓度与纯度。

1.2.4　circFAM53B的克隆、成环鉴定及亚细胞定位

为证实circFAM53B及其成环接口的真实存在，首先以上一步骤提取的总RNA逆转录成cDNA为模板，使用扩增circFAM53B全长的引物和跨circFAM53B剪接位点的发散引物通过PCR扩增目的片段，完成扩增后进行PCR产物纯化回收，将回收产物连接到pMD™ 19-T载体上送至杨凌奥科生物技术有限公司进行Sanger测序。

为证明circFAM53B的环状特性，使用Ribonuclease R试剂盒进行RNA线性消化试验。将准备的总RNA分成等量的2组，一组做RNase R线性消化，另外一组加等量无酶水做阴性对照，RNase R线性消化反应条件为：消化37 ℃ 15 min，灭活85 ℃ 10 min。将2组处理后的RNA分别取1 000 ng逆转录成cDNA，以β-actin作为内参，使用circFAM53B的发散引物进行普通PCR扩增。另外，分别以bMECs的gDNA和总RNA反转录的cDNA为模板，使用发散引物和收敛引物通过PCR扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。上述扩增引物信息见表1，扩增的反应体系为2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板1.5 μL，无酶水6.9 μL；反应条件为：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 15 s，退火15 s和延伸（时间按照扩增产物1 000 bp/min计算），重复39个循环，最终延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

将1.2.3中得到的bMECs核、质RNA分别取1 000 ng进行逆转录，以GAPDH和U6为内参，使用circFAM53B的发散引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，随后通过ImageJ软件分析目的条带的灰度值粗略估计circFAM53B在bMECs细胞核和细胞质中的表达情况，引物信息见表1，反应条件与体系同上述。

1.2.5　circFAM53B的过表达和干扰

本试验根据pCD25-ciR（GFP）载体说明书合成带有酶切位点EcoR I和BamH I以及环化介导序列的circFAM53B片段，经双酶切和纯化回收后，与pCD25-ciR载体连接，通过重组载体筛选等步骤获得pCD25-circFAM53B过表达重组载体。根据circFAM53B的序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司针对跨剪接位点设计并合成了3条特异性circFAM53B-siRNA序列和1条非特异性siRNA-NC。

待细胞融合度达到70%左右时根据Lipofectamine^TM 3000试剂说明书进行转染，每个转染组设置3个重复，circFAM53B-siRNA以及阴性对照组siRNA-NC的工作浓度为50 nmol/L，pCD25-circFAM53B过表达载体以及pCD25-ciR空载的工作浓度为1.5 ng/μL。加样后摇匀放入恒温培养箱，42 h后加入50 ng/μL LPS诱导细胞产生炎症，在LPS诱导6 h后收集细胞，提取总RNA用于后续试验。

1.2.6　引物设计和qRT-PCR分析

根据circFAM53B序列以及GeneBank公布的相关基因的mRNA序列，采用Primer5.0软件设计了circFAM53B、细胞炎症相关基因（IL-6、IL-8和IL-1β）、增殖相关基因（CDK2、CDK4和PCNA）、凋亡相关基因（CASP3、CASP9和BCL2）及内参基因（GAPDH和RPS18），引物如表2所示。引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成，超纯水溶解、备用。qRT-PCR的反应体系：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ （Tli RNaseH Plus） 10 μL，上、下游引物各0.8 μL（表2），cDNA模板100 ng，加无菌无酶的ddH₂O至20 μL。qRT-PCR的反应条件：95 °C预变性30 s，然后95 °C 5 s，60 °C 30 s，40个循环。采用2^-ΔΔCt方法，以GAPDH和RPS18为双内参基因计算目的基因的相对表达量。

1.2.7　ELISA检测细胞促炎因子分泌

采用1.2.5的方法转染pCD25-circFAM53B、pCD25-ciR、si-circFAM53B或siRNA-NC至bMECs中并使用LPS进行诱导，收集细胞培养基，用离心机在1 000 r/min和4 °C条件下离心5 min后，去除细胞碎片并收集上清液，根据制造商的说明，使用相应的ELISA试剂盒在450 nm检测样品的OD值，计算bMECs培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌水平。

1.2.8　细胞活力和增殖检测

本试验为探究circFAM53B对LPS诱导的bMECs的增殖情况的影响，采用EdU法检测细胞增殖能力。待接种于24孔细胞培养板的bMECs融合至60%~70%时，分别转染pCD25-circFAM53B、pCD25-ciR、si-circFAM53B或siRNA-NC，并在42 h后加终浓度为50 ng/μL的LPS进行诱导炎症，6 h后按照EdU检测试剂盒说明书上的操作步骤对增殖细胞和所有细胞核进行染色，使用荧光倒置显微镜进行荧光拍照。

为探究circFAM53B对LPS诱导的bMECs的活力影响，采用CCK-8法检测细胞活力。将bMECs接种培养于96孔板中，待细胞融合至60%~70%时，分别转染pCD25-circFAM53B、pCD25-ciR、si-circFAM53B或siRNA-NC，并在42 h后加终浓度为50 ng/μL的LPS进行诱导炎症，5 h后加10 μL CCK-8增强型溶液，1 h后检测450 nm吸收光，计算细胞存活率。

1.2.9　Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡

将bMECs接种培养于24孔细胞培养板中，待细胞融合至60%~70%时，分别转染pCD25-circFAM53B、pCD25-ciR、si-circFAM53B或siRNA-NC，并在42 h后加终浓度为50 ng/μL的LPS进行诱导炎症，6 h后进行Annexin V-FITC和PI染色，荧光倒置显微镜下进行荧光检测。

1.3　统计分析

所有进行统计检验的试验均重复3次，数据以平均数均值±标准误表示，使用GraphPad Prism 8.3.0软件中的t-test进行差异显著性分析。以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2　结果与分析

2.1　奶牛circFAM53B的鉴定及其亚细胞定位

经PCR产物测序得到全长为779 bp的奶牛circFAM53B（图1（a）），证明该circRNA真实存在。为鉴定circFAM53B是环状RNA，对扩增所得跨剪接位点序列的Sanger测序结果进行分析，结果显示，circFAM53B具有反向剪接产生的环化位点（图1（b））。RNase R线性消化试验表明circFAM53B具有较强的消化抗性（图1（c）），进一步说明circFAM53B为环状RNA。以cDNA为模板可以扩增得到circFAM53B及其对应的线性RNA，但gDNA为模板只能扩增得到对应的线性DNA（图1（d）），说明circFAM53B为环状RNA，而非来自基因组的环状DNA。亚细胞定位试验显示，circFAM53B在细胞核和细胞质中均有分布，但主要分布在细胞质中（图2），推测其具有通过海绵吸附miRNA发挥调控作用的功能。

2.2　奶牛circFAM53B的生物信息学分析

为探究circFAM53B的生物学功能，本研究采用生物信息学方法预测其潜在靶向miRNA及靶基因，结果显示，circFAM53B的潜在靶向miRNA包括bta-miR-145、bta-miR-193a-5p、bta-miR-139和bta-miR-375。bta-miR-139的潜在靶基因有LMO4、NR5A2和CCDC50等43个；bta-miR-193a-5p有SGSM1、MYO1D和LAMP5等29个潜在的靶基因；bta-miR-145的潜在靶基因有HTR2A、PAX3和PAPD5等101个；bta-miR-375有PLXDC2、EGR3和PTGFR等175个潜在靶基因。这些靶基因的功能富集分析结果表明circFAM53B可能与miRNA结合，从而调控其靶基因并参与到炎症相关的信号通路（图3），最终在炎症性免疫疾病中发挥调控功能。

2.3　circFAM53B在bMECs炎症反应中的表达

体外培养bMECs，用LPS处理细胞6 h后采用qRT-PCR和ELISA检测促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平。结果表明，相比于对照组，在LPS诱导组中IL-1β和IL-6的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01），IL-8的mRNA表达水平显著上调（P<0.05）（图4（a））。同时，LPS诱导组中IL-8和IL-1β的蛋白分泌量显著增加（P<0.05），IL-6的蛋白分泌量呈上调趋势（图4（b））。结果表明，本研究利用LPS成功诱导了bMECs炎症模型，可用于后续试验。

采用qRT-PCR检测circFAM53B在上述bMECs炎症模型中的表达水平。结果表明，相较于对照组，在LPS诱导的bMECs中circFAM53B极显著上调（P<0.01）（图4（c）），提示circFAM53B可能在LPS导致的bMECs炎症中发挥作用。

2.4　circFAM53B干扰片段筛选和过表达效率检测

为筛选干扰效率最佳的干扰片段，将体外合成的3条特异性siRNA或siRNA-NC转染至bMECs中，48 h后通过qRT-PCR检测circFAM53B的表达。结果表明，与siRNA-NC组相比，3条siRNA均显著下调（P<0.05），其中siRNA-3的抑制效率最高（图5（a））。因此，将siRNA-3命名为si-circFAM53B并进行后续的抑制试验。

构建pCD25-circFAM53B过表达载体后，对重组载体进行EcoR I和BamH I双酶切鉴定，结果显示，酶切后产生2条带（图5（b）），目标条带的大小与circFAM53B大小一致，说明载体pCD25-ciR与circFAM53B成功连接。将空载体pCD25-ciR和过表达载体pCD25-circFAM53B分别转染到bMECs中，检测circFMA53B的表达量，结果表明，与pCD25-ciR组相比，pCD25-circFAM53B组中circFAM53B的表达水平显著上调了6.546倍（P<0.05）（图5（c）），其过表达的细胞可用于后续试验开展。

2.5　circFAM53B对LPS诱导的bMECs炎症反应的影响

为了探究circFAM53B对LPS诱导的bMECs中促炎因子表达的影响，向bMECs中转染si-circFAM53B和pCD25-circFAM53B以及其对应的阴性对照，并进行LPS炎症诱导。随后，采用qRT-PCR和ELISA检测促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在mRNA和分泌蛋白水平的表达量。结果显示，对circFAM53B的过表达上调了IL-6、IL-8和IL-1β的mRNA表达（图6（a）），并促进了IL-6、IL-8和IL-1β的分泌水平（图6（b））。然而，干扰circFAM53B得到了相反的结果（图6（c）和（d））。上述结果表明circFAM53B能够促进LPS诱导的bMECs炎症反应。

2.6　circFAM53B对LPS诱导的bMECs增殖能力的影响

为了检测circFAM53B对LPS诱导的bMECs增殖能力和活力的影响，本试验采用LPS诱导bMECs，同时过表达和抑制circFAM53B，利用qRT-PCR检测增殖相关基因CDK2、CDK4和PCNA的表达水平；采用CCK-8和EdU检测细胞活力和细胞增殖情况。结果显示，与pCD25-ciR组相比，pCD25-circFAM53B组中增殖相关基因CDK2和CDK4表达水平极显著下调（P<0.01），PCNA表达水平显著下调（P<0.05）（图7（a））；CCK-8检测结果显示，过表达circFAM53B可以极显著抑制细胞活力（P<0.01），但干扰circFAM53B后具有与过表达circFAM53B相反的结果（图7（b））；EdU检测结果显示，相比于空载组（pCD25-ciR），转染pCD25-circFAM53B组极显著抑制细胞增殖能力（P<0.01）（图7（c））。上述结果说明circFAM53B对LPS诱导的bMECs增殖能力和活力均有明显的抑制作用。

2.7　circFAM53B对LPS诱导的bMECs凋亡的影响

为探究circFMA53B对LPS诱导的bMECs凋亡情况的影响，本研究在bMECs中过表达和干扰circFAM53B并进行LPS诱导，采用qRT-PCR检测凋亡相关基因表达量。结果显示，与对照组相比，pCD25-circFAM53B处理组中促凋亡基因CASP3极显著上调（P<0.01），CASP9显著上调（P<0.05），抑凋亡基因BCL2极显著下调（P<0.01），转染si-circFAM53B后具有相反的效果（图8（a））。此外，采用Annexin V-FITC/PI染色法检测干扰或过表达circFAM53B并LPS处理后bMECs的凋亡情况。结果表明，与转染pCD25-ciR相比，转染pCD25-circFAM5B后凋亡坏死的bMECs明显增多，而与转染siRNA-NC相比，转染si-circFAM53B后凋亡坏死的bMECs明显减少（图8（b））。上述结果表明circFAM53B会进一步促进LPS诱导bMECs的凋亡。

3　讨 论

越来越多的circRNA被发现通过靶向miRNA在多种生物学过程中发挥重要作用^［10-12］，在炎症性疾病中，circRNA001372通过大鼠脑和神经细胞中的PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制丙泊酚诱导的神经炎症，而miRNA-148b-3p拮抗circRNA001372的这种作用^［19］。circNup188可能通过海绵化miR-760-3p上调MAP3K8的表达，进而激活NF-κB通路，从而参与脑缺血炎症的发展^［20］。Zhang等^［21］研究表明，circRSF1通过动脉粥样硬化中miR-135b-5p/HDAC1通路调控ox-LDL诱导的血管内皮细胞增殖、凋亡和炎症。另外在模式动物小鼠中，Zhou等^［22］发现circRNA3386在内侧半月板失稳术诱导的小鼠骨关节炎中通过结合miR-127-5p来促进MMP-13的表达，参与调控IL-β诱导的软骨细胞增殖与凋亡。circRNA同样通过上述机制参与奶牛乳房炎的调控，如在重金属铅和镉引起的bMECs炎症中，circ05280和circ08409分别通过miR-146a/IRAK1与miR-133a/PTX3路径调控炎症进展^［15-16］。但在奶牛乳房炎中并未发现circFAM53B可以作为miRNA的内源性竞争RNA发挥调控作用。本研究对circFAM53B进行潜在互作miRNA及其靶基因的预测并进行KEGG富集分析，结果显示circFAM53B可能通过miR-193a-5p、miR-139、miR-145和miR-375参与炎症相关信号通路调节，进而影响奶牛乳房炎的进程。miR-193a-5p可被circOSBPL2和BRD4竞争性结合调控慢性阻塞性肺疾病中的炎症反应^［23］。值得注意的是，miR-145和miR-375均有在奶牛乳房炎中发挥作用的相关报道。miR-145通过靶向PXN或FSCN1抑制S.aureus型bMECs炎症^［24］。胡启超^［25］研究发现，miR-375负调控YBX1的表达，显著升高促凋亡因子BAD及炎症因子IL-6和IL-8的表达量，促进LPS诱导的bMECs炎症。由此推测circFAM53B可能通过靶向miR-193a-5p、miR-139、miR-145或miR-375影响下游靶基因的表达，从而调节靶基因富集的炎症相关信号通路，在奶牛乳腺上皮细胞炎症中发挥调控作用。

在奶牛乳房炎中除了circRNA的转录组分析以外，也有少数差异表达circRNA进行了奶牛乳房炎的分子机制探究。周福振^［17］研究发现，在100 ng/mL LPS处理6 h构建的bMECs炎症模型中，circIL27RA不仅能够正向调控其来源基因IL27RA，而且过表达circIL27RA与IL27RA均能激活NF-κB信号通路，促进炎症因子IL-6和IL-8的表达。本研究同样使用LPS处理bMECs 6 h诱导炎症，虽然使用LPS终浓度为50 ng/mL，但显著上调的促炎细胞因子表达量表明细胞炎症成功产生。Chen等^［16］发现在金属镉的诱导下，circ08409高表达且通过靶向miR-133a促进了炎症因子PTX3和先天免疫相关因子PGRP的表达水平。与此同时，研究发现无论在小鼠乳腺组织还是bMECs中，铅暴露均能通过circ05280/miR-146a/IRAK1通路促进乳房炎症^［15］。虽然迄今为止尚未见circFAM53B在奶牛乳房炎上的报道，但其作为肿瘤调节因子，可以通过内源性竞争RNA网络加速神经胶质瘤^［26］和卵巢癌^［27］的进展。另外，Huang等^［28］通过整合来自乳腺癌样本的质谱和核糖体测序数据，鉴定到circFAM53B可以编码免疫原性隐秘肽，并证明了其具有抗肿瘤免疫原性。由此可知在动物体内circFAM53B可调控病理过程，其中包括乳腺病变。

为了探究在奶牛乳房炎中circFAM53B发挥的作用，本研究在LPS诱导炎症的bMECs中抑制和过表达circFAM53B后检测其对细胞炎症、凋亡和增殖情况的影响，结果发现，circFAM53B会导致炎症因子释放，可能加剧奶牛乳房的炎症趋势。BCL2是一种抗凋亡蛋白，可以通过控制线粒体细胞色素c的释放来抑制细胞凋亡^［29］。研究表明，circ-JA760602通过抑制BCL2促进缺氧诱导的细胞凋亡^［30］，同时circFADS2被证明在脓毒症中表达不足，通过下调CASP3和CASP9的表达保护肺细胞免受LPS诱导的细胞凋亡^［31］。本研究中发现在LPS诱导的bMECs中circFAM53B明显促进细胞凋亡，因此推测circFAM53B在奶牛乳房炎中加速细胞凋亡从而加剧炎症损伤。

4　结 论

奶牛circFAM53B在LPS诱导炎症的bMECs中表达上调，可能通过抑制细胞增殖、促进细胞炎症和凋亡加剧奶牛乳房炎的发展。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060749)

宁夏自然科学基金项目(2023AAC03049)

国家现代农业产业技术体系项目(CARS-36)