江汉鸡羽毛花纹新性状“心形镶边羽”的遗传规律解析

Inheritance pattern of the new plumage pattern trait “heart-shaped lacing feather” in Jianghan chickens

摘要

为解析江汉鸡“心形镶边羽”（即羽毛末端边缘真黑色素心形沉着）的遗传规律，本研究主要利用大群检测以及构建资源家系2种方法，对江汉鸡“心形镶边羽”表型与其候选基因（GJA5、SOX10和MC1R）的相关突变进行关联分析。结果表明：1）SOX10基因上游缺失与江汉鸡“心形镶边羽”性状关联不显著（P>0.05）。2）MC1R基因中4个错义突变（Met71Thr、Glu92Lys、Ala143Thr和His215Pro）及其组成的单倍型均与羽毛中是否有真黑色素沉着显著相关（P<0.05）。3）在经MC1R调控而使羽毛具备真黑色素的沉着能力的前提下，真黑色素沉着的位置主要受GJA5基因上游缺失插入突变的影响，因此GJA5突变对“心形镶边羽”起主要决定作用（P<0.01），并表现部分显性遗传以及从性遗传现象。4）联合分析显示：MC1R突变对GJA5突变存在上位互作效应。5）经过筛选得出MC1R 的92号氨基酸位点为突变或者杂合型且143号位点野生型，同时GJA5上游为突变型时，心形镶边羽的比例最大（85.19%），并以此制定了先挑选表型再检测MC1R的2个错义突变最后检测GJA5突变的心形镶边羽分子选育方案。本研究通过对心形镶边羽遗传规律的解析，奠定了培育具有“心形镶边羽”的特色地方鸡品种的基础，充分发挥羽色标签性状的作用，增加江汉鸡淘汰蛋鸡的市场竞争力。

Abstract

The purpose of this study was to explore the inheritance pattern and mechanism underlying a newly reported phenotype， namely “heart-shaped lacing feather”， in Jiang Han chickens. This phenotype consists of a heart-shaped eumelanin pattern at the end edge of a feather. In this study， the associations between the phenotypes of heart-shaped lacing feather and its candidate mutations （related mutations of GJA5， SOX10， and MC1R genes） were analyzed mainly through two methods： testing in a large population and in a constructed resource family， followed by the establishment of a molecular breeding protocol for “heart-shaped lacing feather” chickens. The results showed that： 1） There was no significant association between the upstream deletion of SOX10 gene and the trait of “heart-shaped bordered feather” in Jianghan chicken （P>0.05）. 2） Four missense mutations in MC1R gene （Met71Thr， Glu92Lys， Ala143Thr， and His215Pro） and the haplotypes formed by them were all significantly correlated with eumelanism in feathers （P<0.05）. 3） In the feathers with the ability to deposit eumelanin， mediated by MC1R， the specific position of eumelanin in feathers were mainly affected by the indel mutation in the upstream of GJA5 gene. Thus， the GJA5 mutation played a major role in determining the “heart-shaped feather” （P<0.01）， and showed partial dominant inheritance and sex-influenced inheritance； 4） Joint analysis showed that MC1R mutations had epistatic effects on GJA5 mutation； 5） After screening， it was found that individuals with mutated or heterozygous MC1R 92 amino acid site， wild-type 143 site， and mutant of GJA5 upstream， have the largest proportion of heart-shaped feathers （85.19%）. Therefore， the molecular breeding protocol for heart shaped lacing feather chickens， consists with selection by phenotype， then the 2 MC1R missense mutations， then GJA5 mutation， were established. This study identified the inheritance pattern of heart-shaped lacing feathers， which laid a foundation for breeding of domestic chickens with this phenotype， giving full play to the role of feather as a labelling trait， and increasing the competitiveness for the spent hens of Jianghan chicken.

Graphical abstract

关键词

江汉鸡 / 心形镶边羽 / 分子育种 / GJA5 / MC1R

Key words

Jiang Han chicken / heart-shaped lacing feather / molecular breeding / GJA5 / MC1R

鸡的羽色性状可以分为整体羽色与羽毛内花纹。常见的整体羽色包括白羽^［1-4］、黑羽和黄羽，而羽毛内花纹的本质为真黑色素（黑或灰色）与褐黑色素（黄或褐色）在羽毛内部的分布情况^［5］。目前关于鸡羽毛内花纹的研究大部分集中在国外鸡种，例如斑点、常染色体横斑、鹧鸪纹、单镶边、双镶边、闪点等^［6-7］，且已报道了与其对应的部分因果突变^［8-11］。根据Smyth^［6］的总结，影响家鸡羽毛内花纹的突变主要有E、Pg、Ml、Db和Co。而已知E的因果突变是黑素皮质素受体1（Melanocortin 1 receptor，MC1R）基因的相关突变^［10］，Pg也是MC1R基因^［11］，Ml是缝隙连接蛋白α5（Gap junction protein alpha 5， GJA5）^［8］，Db是SOX10（SRY-box transcription factor 10，性别决定区盒基因）^［9］，而Co尚未被定位。

而国内关于羽毛内花纹的研究甚少。我国本地鸡种的羽毛花纹具有重大经济价值，例如清远麻鸡因历史悠久、肉质鲜美作为广东省三大名鸡之一受到较多关注，其羽毛花纹是消费者心目中的商品标签之一^［12］。江汉鸡是湖北省的优质蛋鸡，以产蛋著称，但将淘汰的蛋鸡在活禽市场上作为肉用出售，也是符合人们食用老母鸡汤的饮食习惯。新的羽毛花纹性状具有标签性状的作用，期望未来培育出具有较高淘汰鸡价格的优质蛋鸡品系，提升市场竞争力。本课题组之前在湖北省本地鸡种的江汉鸡群体中发现了一种新的羽毛表型，命名为“心形镶边羽” ^［13］。因此，本研究拟通过已有报道的与家鸡羽毛内花纹相关的3个基因，即MC1R、GJA5和SOX10基因的相关突变作为“心形镶边羽”的候选突变，进行基因型与表型的关联分析，以探究心形镶边羽这一独特的地方鸡羽毛花纹的遗传机制。为培育出区分度更高、群体变异更小的具有独特表型的江汉鸡品种提供理论基础，构建出可以稳定遗传“心形镶边羽”的地方鸡品系后便可充分发挥羽色标签性状的作用，提升淘汰蛋鸡的市场竞争力，以进一步提高江汉鸡的经济价值。

1　材料与方法

1.1　试验材料

本研究从湖北欣华生态畜禽开发有限公司的江汉鸡保种群中随机选择了298羽母鸡个体与4羽公鸡个体，并对所有母鸡血液样品进行采集与拍照记录。其中的公鸡与4羽母鸡用于建立资源家系，剩下的294羽母鸡用于大群检测。根据胸部羽毛是否有真黑色素沉积，以及有真黑色素沉积的羽毛中真黑色素是否分布于羽毛边缘，将个体分为“无真黑色素沉着”（图1（a））、“边缘真黑色素沉着（即心形镶边羽）”（图1（b））、“非边缘真黑色素沉着”3类（图1（c））。

1.2　试验方法

1.2.1　采样与DNA提取

将每个样本的200 μL的血液样品置于含有15 μL 4%柠檬酸钠抗凝剂的EP管中，-20 ℃保存。使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒（QIAGEN）提取所需样本的DNA。

1.2.2　PCR和琼脂糖凝胶电泳

以提取的DNA为模板，将配制好的10 μL反应体系放入PCR仪中进行反应，预变性94 ℃、5 min，第一轮循环14次（变性94 ℃、15 s，退火68 ℃、15 s，且每次循环温度降低1 ℃，延伸72 ℃、30 s），第二轮循环25次（变性94 ℃、15 s，退火55 ℃、15 s，延伸72 ℃、30 s），终延伸72 ℃、5 min。体系所用引物见表1，其中GJA5-F1引物与GJA5-R的扩增片段为108 bp，GJA5-F2引物与GJA5-R的扩增片段为133 bp；SOX10-F引物与SOX10-R1的扩增片段为611 bp，SOX10-F引物与SOX10-R2的扩增片段为1 257 bp。每批次的检测均附加已知基因型的阳性对照以及阴性对照（空白对照）。反应完成后GJA5基因和SOX10基因分别使用3%和1.5%琼脂糖凝胶电泳观察成像。

1.2.3　一代测序

一代测序主要用于试验前期对GJA5基因型判定结果进行复核，以及利用混池对MC1R基因的多个SNP突变位点进行初步筛选。测序引物见表2。扩增后样品由北京擎科生物科技有限公司进行一代测序。

1.2.4　KASP基因分型

根据LGC Genomics公司开发的KASP基因分型技术^［14］，将配制好的5 μL体系后置于CFX384实时定量PCR仪中进行反应，预变性94 ℃、15 min，第一轮循环9次（变性94 ℃、20 s，退火延伸61 ℃、60 s，且每次循环退火温度降低1 ℃），第二轮循环33次（变性94 ℃、20 s，退火延伸55 ℃、60 s），终延伸37 ℃、60 s，然后仪器记录荧光量，每个样本设置2个重复。根据预试验的结果筛选出来的KASP引物见表3。

1.2.5　构建GJA5基因型分离资源家系

对298羽江汉鸡母鸡进行了检测，发现GJA5与“心形镶边羽”表型高度关联，且国内也未有过对江汉鸡GJA5基因的相关研究，故从中挑选个体建立了资源家系，即4羽GJA5的突变杂合母鸡与同一群体的4羽随机公鸡进行交配后，将获得的2羽杂合的F1公鸡和2羽杂合母鸡进行配种，共获得21羽F2后代（6羽GJA5野生型、10羽杂合、5羽突变型）。对资源家系的所有个体进行血样采集与提取、表型记录、MC1R与SOX10基因分型。

1.2.6　统计检验

采用卡方适合度检验判定基因型与表型的关系，P<0.05表示显著关联，P<0.01表示极显著关联，P>0.05表示关联不显著。

2　结果与分析

2.1　 SOX10与“心形镶边羽”表型的关联分析

在323羽大群（包含了GJA5资源家系29羽）中检测SOX10的上游缺失突变（图2），基因型结果显示285羽为野生型，38羽为杂合型，且各基因型均覆盖3种表型，没有检测出突变型个体（表4）。结果显示，SOX10基因与表型“心形镶边羽”的关联差异不显著（P>0.05）。

2.2　 MC1R与“心形镶边羽”的关联分析

在323羽个体中，对改变MC1R基因71号、92号、143号、215号氨基酸位点的错义突变进行KASP基因分型检测（图3），71号氨基酸位点检出率为99.07%，92号氨基酸位点检出率为99.70%，143号和215号氨基酸位点检出率均为100%。基于设置的重复样本，可见KASP对SNP的检测结果高效可靠，且其操作过程适合高通量的检测。结果显示在71号、92号和215号氨基酸位点为突变型或杂合型，以及143号氨基酸位点为野生型的个体中，无真黑色素沉着的个体较少（表5）。通过统计学检验，4个突变位点均显示与羽毛真黑色素沉着极显著关联（P<0.01），且主要与是否有真黑色素沉着有关，而非真黑色素沉着的位置（边缘或非边缘）。

由于MC1R的4个位点之间存在连锁，因此进一步进行了单倍型分析，其中250羽个体组成了4种主要的单倍型组合，以及所有位点均为野生型的H0（表6），另外的73羽各自的单倍型频率较低，故不参与分析。结果显示，单倍型H2（即143号位点突变）抑制真黑色素的沉着，且对H1单倍型表现为显性，而其他单倍型（除野生型的H0外），均与真黑色素的沉着显著关联（P<0.01）。

2.3　 GJA5与“心形镶边羽”的关联分析

对整个资源家系的基因型与表型进行关联，发现所有具有边缘真黑色素沉着，即“心形镶边羽”表型的个体（n=18）均为GJA5基因的突变型或杂合型，且其他表型中（n=11）未发现GJA5基因的突变纯合，得出GJA5基因为影响羽毛边缘真黑色素沉着的关键基因这一结论，且存在显性效应。根据294羽大群体和29羽资源家系的检测结果（图4），GJA5突变与“心形镶边羽”表型存在显著关联（P<0.01，表7）。对资源家系中的杂合子个体进一步分析发现，杂合子公鸡全部表现为边缘黑色素沉着，杂合子母鸡则表现出不同的表型，出现从性遗传现象（表8）。

2.4　 MC1R对GJA5存在上位互作效应

在确定GJA5和MC1R与“心形镶边羽”有关联后，对各自有基因型效应的GJA5突变和MC1R突变进行了联合分析，以探究两者之间的互作关系。根据羽毛是否有真黑色素沉积，以及有真黑色素沉积的羽毛中真黑色素是否分布于羽毛边缘两种表型分类进行比较，结果通过三维柱状图进行展示：X轴为GJA5基因型，Y轴代表MC1R基因型，Z轴数值代表某一表型个体占该基因型总个体数的百分比。各图中沿X轴方向比较结果显示，GJA5突变对真黑色素是否沉着无明显影响（图5），沿Y轴比较发现MC1R基因71号（图5（a））和92号（图5（b））氨基酸位点突变型、143号氨基酸位点野生型（图5（c））、215号氨基酸位点的野生型和突变型（图5（d））真黑色素沉着比例大，特别是143号位点野生型的作用较明显。

进一步对真黑色素在羽毛中沉着的不同位置表型进行分析（图6），沿X轴方向比较发现，随着GJA5突变等位基因的增多，边缘真黑色素沉着的比列呈现上升趋势，但该趋势仅在上述真黑色素沉着比例较大的特定MC1R突变（71、92、215号氨基酸位点突变型、143号氨基酸位点野生型）个体中才比较明显（143号位点的突变型的也显示为GJA5效应明显，但实际上143号突变型的个体有羽毛真黑色素沉着的仅有2个（表5），因此不具有统计学意义）。沿Y轴比较发现，MC1R基因对边缘真黑色素沉着没有明显作用。综上，MC1R基因上位于GJA5基因，推测MC1R基因作为调控真黑色素沉着的开关，而GJA5基因调控真黑色素是否沉着于羽毛边缘。

3　讨 论

本研究在我国地方鸡种的羽毛花纹观察中发现了“心形镶边羽”这一独特表型，根据已有报道筛选出可能相关的候选突变，并通过大群验证和构建资源家系的方法确认了GJA5基因的突变和MC1R基因4个氨基酸位点的相关突变与“心形镶边羽”相关联。同时本研究结果显示，SOX10基因杂合子与野生纯合子与此表型无关联，未在试验群体中检测到其突变型。由于SOX10突变（其上游的一个8.3 kb缺失与真黑色素被抑制、褐黑色素合成加强有关）所导致的Db等位基因是不完全显性^［9］，因此如果该突变对江汉鸡的心形镶边羽表型有影响，则理论上会观察到杂合子与野生纯合子之间的差异。

通过构建资源家系，本研究发现，杂合子公鸡全部表现为“心形镶边羽”，杂合子母鸡则仅有部分表现出该表型，即存在从性遗传。该现象与国外鸡种中双镶边表型（同样是GJA5上游突变所致）的限性遗传相反，国外品种中公鸡几乎不表达镶边表型^［8］。且具体的边缘真黑色素分布范围也存在差异，国外鸡种中的黑色镶边包含整个廓羽的边缘，而在国内鸡种中所观察到的表型仅在羽毛末端存在边缘真黑色素沉着。虽然受相同基因的调控，但却因为遗传背景的不同，表现出了不同的表型。

Li等^［8］发现黑变基因（Melanotic，Ml）的因果突变并成功解析了国外观赏鸡双镶边花纹的遗传机制，该突变为GJA5基因的上游结构变异，可导致GJA5表达量的变化。根据本研究大群体的检测结果，发现GJA5突变与“心形镶边羽”表型存在显著关联。但与资源家系的完全关联不同的是，大群中发现了少量GJA5野生型但表现“心形镶边羽”以及少量GJA5突变但表现出羽毛末端边缘无真黑色素沉着的个体，这说明该群体中尚有未知的突变产生了与GJA5突变相同或相反的作用。结合Andersson等^［7］的总结，因为同样影响羽毛内花纹的Co基因尚未被定位，所以未能作为本研究的候选突变之一。而Co基因变异的存在可能就是在江汉鸡没有观察到100%的关联的原因之一。本研究将继续关注这些少数不关联的个体，将利用其挖掘可能包括Co基因在内的新的羽毛花纹性状关联突变，实现更全面的遗传解析。

经过上世纪的大量杂交研究，已知家鸡的E位点有至少8个等位基因，分别作为黑羽、麻羽、黄羽等有色羽的决定因子^［7］。其中黑羽等位基因E*E被连锁定位为MC1R基因，且存在至少一个与黑羽相关的MC1R错义突变^［10］。同时Ellett^［15］与Ling等^［16］也报道了与黄羽等位基因E*WH或E*Y相关的MC1R错义突变。故MC1R被认为是真黑色素与褐黑色素之间切换的开关，且主要在黑色素细胞中表达。根据上述报道，MC1R基因71、92号氨基酸突变能增强羽毛中真黑色素的合成，而143号氨基酸位点则相反^{［10，15-16］}。本研究的大群检测结果与前人的报道一致，即MC1R的这些突变与羽毛花纹表型均存在显著关联。并且还进一步发现了MC1R突变主要与是否有真黑色素沉着有关，而非真黑色素沉着的位置。随后对各自有基因型效应的GJA5突变和MC1R突变进行了联合分析，从统计的角度得出MC1R基因对GJA5基因存在上位互作效应这一结论。这一结论也符合从生物学角度的推论，Inaba等^［18］发现GJA5在禽类胚胎背部的真黑素和褐黑素条纹区都有表达，通过鹌鹑胚胎皮肤移植和和缝隙连接蛋白（GJA5编码蛋白所属家族）抑制剂注射等研究，表明黑色素细胞之间可能依赖于GJA5进行信号交流，并调控真黑素和褐黑素条纹的产生。Li等^［8］提出，GJA5介导的信号交流可能直接与MC1R相关信号通路有关，如cAMP（环磷酸腺苷，MC1R被激活后的下游信使之一）可能经由缝隙连接蛋白在黑色素细胞之间传递进而影响真黑色素的合成。按照这一理论，MC1R也位于GJA5基因功能的上游。

培育“心形镶边羽”资源群体虽然可以仅使用表型选择，但需要进行分子选育^［14］的理由包括：一是根据本研究大群检测的结果，该表型的表达不稳定，表型相似的个体其基因型不一定相同，通过表型选择所得到的的后代可能会出现性状分离；二是因为GJA5突变为部分显性，特别是公鸡中几乎是完全显性，如果利用分子选育淘汰其中的杂合子将能够比表型选育更迅速地提高群体整齐度；此外，分子选育可以实现早期选择，这对于仅在成年个体中表达的黄麻羽表型的选育尤为重要，能通过早检测早淘汰大幅降低育种成本。

本研究对所有结果进行汇总后发现，当MC1R基因92号氨基酸位点为突变型或者杂合型，143号氨基酸位点为野生型，且GJA5基因型为突变型时，“心形镶边羽”个体的比例较高，为85.19%（23/27）。之所以仅关注92号和143号氨基酸位点，是因为MC1R的单倍型分析结果显示，71、92和215这3个氨基酸突变位点紧密连锁，而与143号氨基酸位点不连锁。因此为了节省分子成本，我们从MC1R基因71、92、215这3个连锁突变位点中，选择检测效果最好的92号氨基酸位点为代表作为分子育种方案的1个标记位点，第2个标记位点为与其他3个突变不连锁的143号氨基酸位点。第3个标记位点为GJA5基因的基因型。

具体分子育种方法为：如果在成年鸡中挑选种鸡，则先通过表型淘汰不表达“心形镶边羽”的个体，剩下个体进行分子检测后选中目标个体（MC1R 的92号位点突变或者杂合、且143号位点野生、同时GJA5为突变型）进行配种，公母均可使用这一方案；如果雏鸡中挑选时目标个体时，无法通过表型进行筛选，可直接通过分子鉴定进行筛选，即可完成“心形镶边羽”资源群体的构建。本研究的分子选育方法为培育“心形镶边羽”育种群，利用羽毛性状的标签作用，提高其经济价值，促进地方优质黄麻羽鸡产业发展将发挥重要的作用。

4　结 论

本研究主要结论如下：

1） 江汉鸡“心形镶边羽”这一羽毛表型受GJA5和MC1R 2个基因相关突变的调控。

2） 江汉鸡“心形镶边羽”这一羽毛表型具有部分显性与从性遗传的特征。

3） 在江汉鸡“心形镶边羽”的表达过程中，MC1R基因突变对GJA5基因突变存在上位互作效应，据此可以进行针对“心形镶边羽”的分子选育：选择MC1R基因92号氨基酸位点为突变型或者杂合型，143号氨基酸位点为野生型，GJA5基因型为突变型的个体留种。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32202663)

湖北省重点研发计划项目(2021BBA234)