厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭肠道健康的影响

Effects of magnolol on intestinal health of Pekin ducks infected with Escherichia coli

摘要

为探究厚朴酚（MAG）对感染大肠杆菌（E.coli）北京鸭肠道健康的影响，本研究选取1 d雄性北京鸭240只，随机分为6组：空白组（NCG组），攻毒组（E.coli O78，PCG组），低（E.coli O78+100 mg/kg MAG，MLG组）、中（E.coli O78+200 mg/kg MAG，MMG组）、高（E.coli O78+300 mg/kg MAG，MHG组）剂量厚朴酚组，抗生素组（E.coli O78+30 mg/kg维吉尼亚霉素，AG组），每组5个重复，每个重复8只，试验周期28 d。试验利用酶联免疫吸附法（ELISA）、病理组织学切片技术（HE染色）、实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）完成肠道健康指标检测。结果表明：1）与PCG组相比，3剂量组与AG组北京鸭9、14和28 d因E.coli感染引起生长性能降低无显著改善（P>0.05）。2）与PCG组相比，3剂量组及AG组北京鸭9、14和28 d空肠绒毛结构相对完整、排列相对整齐，绒毛长度（VH）、绒毛长度/隐窝深度（V/C）显著增加（P<0.05），隐窝深度（CD）显著减小（P<0.05）。3）与PCG组相比，MMG组北京鸭9 d血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）浓度显著降低（P<0.05）。4）与PCG组相比，MLG组和MMG组北京鸭9 d空肠白介素-10（IL-10）的mRNA表达量显著增加（P<0.05），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达量显著减少（P<0.05）。5）与PCG组相比，MLG组北京鸭9、14和28 d空肠闭合小环蛋白-1（ZO-1）、闭锁蛋白（Occludin）、闭合蛋白-1（Claudin-1）的mRNA表达量显著增加（P<0.05）；MLG组和MMG组北京鸭14和28 d空肠黏蛋白2（MUC2）的mRNA表达量显著增加（P<0.05）。综上，饲粮添加MAG可在一定程度上改善感染大肠杆菌北京鸭肠道形态，稳固肠道屏障，保护肠道健康；MAG推荐添加剂量为100和200 mg/kg。

Abstract

This study was aimed to explore the effect of magnolol （MAG） on the intestinal health of Pekin ducks infected with Escherichia coli （E.coli）. A total of 240 one-year-old Pekin ducks were randomly allocated into 6 dietary treatments， 5 repetitions per treatment， 8 animals per repetition： blank group （group NCG）， challenge group （E.coli O78， group PCG）， low-dose MAG group （E.coli O78+100 mg/kg MAG， group MLG）， medium-dose MAG group （E.coli O78+200 mg/kg MAG， group MMG）， high-dose MAG group （E.coli O78+300 mg/kg MAG， group MHG）， antibiotic group （E.coli O78+30 mg/kg virginiamycin， group AG）. The test period was 28 days. Intestinal health indicators were detected by ELISA， pathological histological section technology （HE staining）， and Quantitative Real-time PCR （RT-qPCR）. The result showed that： 1）Compared with the group PCG， there was no significant improvement in growth performance caused by E. coli infection in the group MLG， the group MMG， the group MHG and the group AG at 9， 14， and 28 days of age （P>0.05）. 2）Compared with the group PCG， the villus length and villus length/recess depth in the jejunum of Pekin ducks in the group MLG， group MMG， group MHG and group AG were significantly increased （P<0.05）， the recess depth was decreased significantly at 9， 14 and 28 days of age （P<0.05）. 3）Compared with the group PCG， the content of serum DAO and D-LA of Pekin ducks in the group MMG was significantly decreased at 9 days of age （P<0.05）. 4） Compared with the group PCG， the expression levels of IL-10 in the jejunum of Pekin ducks in the group MLG and MMG were increased significantly at 9 days of age （P<0.05）. 5） Compared with the group PCG， the expression levels of zonula occluden-1， Occludin and Claudin-1 in the jejunum of Pekin ducks in the group MLG were significantly increased at 9， 14 and 28 days of age （P<0.05）. The expression levels of mucin2 in the group MLG and MMG was increased significantly at 14 and 28 days of age （P<0.05）. In conclusion， adding MAG can improve the intestinal morphology， stabilize the intestinal barrier and protect intestinal health of Pekin ducks infected with E.coli. The recommended dosage of MAG adding to the feed is 100 or 200 mg/kg.

Graphical abstract

关键词

厚朴酚 / 大肠杆菌 / 北京鸭 / 肠道健康

Key words

magnolol / Escherichia coli / Pekin duck / intestinal health

大肠杆菌（Escherichia coli）作为引起肉鸭常见细菌性疾病的病原，通过干扰机体能量代谢途径、下调与氧化磷酸化及核糖体相关的基因表达，破坏肠道屏障，引发炎症反应，降低肉鸭的生长性能、免疫功能及繁殖性能，给养殖业带来严重的经济损失^［1-4］。在防治方面，E.coli血清型众多且存在地域差异，广谱疫苗的研发难度高^［2-3］；其易对抗生素产生强耐药性，又因我国在饲料端已全面禁抗，防治该病的药物选择与使用严重受限^［1，5］。近期研究发现，E.coli能够以家禽产品为媒介诱发人食源性疾病，可通过饮水、环境等媒介平行传播耐药基因至人类，危害人类公共健康^［6-8］。因此，急需开发高效、绿色、安全的替抗饲料添加剂，解决鸭大肠杆菌病的防治难题。

厚朴酚（Magnolol，MAG）是一种分离自中药厚朴茎皮的联苯酚类化合物，其生产制备工益趋于成熟，已广泛用于日化、营养、食品、药理等多个领域^［9-12］。在健康家禽，厚朴酚具有促生长、改善肉蛋品质、抗炎、抗氧化应激、促进肠道健康的作用^［11-13］。Deng等^［14］研究发现，MAG可下调感染E.coli小鼠的肠道炎症因子干扰素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）的mRNA表达，增加肠道绒毛长度（Villus height，VH），抑制肠上皮细胞凋亡，有效保护肠黏膜。Chen等^［15］研究发现，MAG通过提高回肠闭锁蛋白-1（Claudin-1）的mRNA表达量，优化肠道微生物菌群，减轻鸡白痢引起的肉鸡生长性能下降。MAG能够维护肠道形态结构，提高肠道免疫功能及屏障功能，改善肠道微生物结构^［16］，具有绿色、安全、无残留、经济、实惠、易获取的优点^［5，13］，MAG作为家禽饲料添加剂以防治家禽疾病的应用潜力较高。

目前，北京鸭大肠杆菌病的防治难度高，且尚未有研究探索MAG在北京鸭大肠杆菌病中的作用。因此，本研究以感染大肠杆菌北京鸭为模型，探究饲粮添加不同剂量MAG对肠道健康的影响，为北京鸭养殖行业防治大肠杆菌病提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

厚朴酚（纯度≥98%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。维吉尼亚霉素（Virginiamycin，VIR）购于北京泛球科技有限公司。菌株大肠杆菌O78由中国农业大学动物科技学院王忠老师提供。试验用北京鸭购于任丘市顺和种鸭养殖孵化厂。

1.2　试验分组及设计

试验选择体重相近的240只1 d健康雄性北京鸭，随机分为6个处理组，每组5个重复，每个重复8只鸭。空白组（NCG组）、攻毒组（PCG组）饲喂基础日粮；厚朴酚处理组分别在日粮中添加100 mg/kg（MLG组）、200 mg/kg（MMG组）、300 mg/kg（MHG组）的MAG；抗生素处理组（AG组）在日粮中添加30 mg/kg的VIR。从5 d开始，除NCG组，其余5组每日灌胃2.00 mL E.coli O78菌液2次（2.00×10⁹ CFU/mL），2次攻毒间隔8 h，连续灌胃3日；NCG组以相同方式灌胃0.9 %无菌生理盐水。基础日粮参照NRC（1994）肉鸭营养需求标准配置，日粮配方及成分见表1。

试验于中国农业大学涿州试验基地开展。试验期为28 d。试验期间采用3层立体笼养，24 h持续光照，自由饮水和采食。

1.3　样品采集

分别于9 、14 和28 d，自每个处理随机选取5只北京鸭颈静脉放血致死。采集血样，使用离心机3 500 g、4 ℃，离心15 min，分离血清于-20 ℃保存。采集空肠组织及黏膜，分别置于无RNA酶管内，液氮速冻后于-80 ℃冷冻保存。血清及空肠样本均用于后续指标检测。

1.4　指标检测

1.4.1　生长性能指标测定

每日健康监测，观察北京鸭临床表现。在9、14和28 d，在禁食8 h后，称量各重复北京鸭的体重和饲料重量，记录北京鸭体重、消耗饲料重量、剩余饲料重量等生长性能指标数据，计算0~21 d、22~28 d北京鸭平均体重（Average body weight，ABW）、平均体增重（Average body weight gain，ABWG）、平均采食量（Average feed intake，AFI）和料重比（Feed/Gain ratio，F/G）。

1.4.2　血清指标测定

血清二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）、D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）使用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒进行检测。

1.4.3　肠道病理组织观察

将剖检时采集的1 cm空肠组织浸泡至4 %的甲醛溶液内，后续经脱水—透明—浸蜡—包埋—修块—切片—展片—常规苏木精-伊红染色处理后，制成石蜡切片。利用光学显微镜观察并测量每张切片10个完整、走向清晰肠绒毛的VH、隐窝深度（Crypt depth，CD），计算二者比值（V/C）。

1.4.4　实时荧光定量PCR

采用Trizol法提取空肠组织总RNA。利用NanoDrop 2000分光光度计测定总RNA的浓度，并根据样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值评估RNA的完整性。使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反转录RNA以获取cDNA，于-20 ℃保存。引物序列如表2所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以空肠组织cDNA为模板，按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书配制体系，进行实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）。以β-actin为管家基因，按照 2^-ΔΔCt方法计算目的基因的相对水平。试验所用试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.5　数据分析

使用Excel 2010对试验数据进行初步处理，利用SPSS 29.0对数据进行单因素方差分析，对组间差异显著（P<0.05）的指标使用Duncan氏法进行多重比较。P<0.01为差异极显著，0.01<P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2　结果与分析

2.1　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭生长性能的影响

由表3可知，与NCG组相比，PCG组北京鸭0~21 d和22~28 d ABW、ABWG、AFI显著降低（P<0.05）。PCG组、MLG组、MMG组、MLG组、AG组北京鸭6~8 d均出现不同程度的精神萎靡，排黄绿色稀便的现象，与雏鸭大肠杆菌感染后嗜睡、粪便变稀且颜色异常的临床表现相吻合^{［2，17-18］}，提示攻毒成功。与PCG组相比，MLG组、MMG组、MHG组、AG组北京鸭0~28 d ABW、AG、AFI和F/G均无显著差异（P>0.05）。结果表明，E.coli可影响北京鸭生长性能，MAG对感染E.coli北京鸭生长性能无显著影响（P>0.05）。

2.2　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭空肠肠道形态的影响

由图1可知，在9、14和28 d，NCG组北京鸭空肠绒毛结构完整，排列整齐；PCG组北京鸭空肠绒毛结构明显不完整，绒毛顶端上皮细胞脱落严重，部分空肠绒毛中断且排列紊乱；MLG组、MMG组、MHG组及AG组北京鸭空肠绒毛结构相对完整，绒毛排列相对整齐。由表4可知，与NCG组相比，PCG组北京鸭9 d空肠VH显著减小（P<0.05）；9、14和28 d CD显著增大（P<0.05），V/C显著减小（P<0.05）。与PCG组相比，MLG组、MMG组、MHG组和AG组北京鸭9、14和28 d空肠VH和V/C均显著增大（P<0.05），空肠CD显著减小（P<0.05）。结果表明，E.coli破坏北京鸭空肠形态结构，抑制北京鸭空肠肠道绒毛生长，而MAG和VIR可拮抗该不良反应，进而维持良好的肠道形态结构和肠道功能，且相比于VIR，低、中剂量MAG效果更为显著。

2.3　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭血清DAO、D-LA的影响

由表5可知，与NCG组相比，PCG组北京鸭9 d血清DAO及D-LA浓度显著增加（P<0.05）。与PCG组相比，MMG组北京鸭9 d血清DAO和D-LA浓度均显著降低（P<0.05），MHG组北京鸭血清D-LA浓度显著降低（P<0.05），AG组北京鸭血清DAO、D-LA浓度无显著差异（P>0.05）。结果表示，在感染E.coli早期，北京鸭肠道通透性增加，中剂量MAG可降低E.coli感染北京鸭肠道通透性。

2.4　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭空肠炎症因子的影响

由表6可知，与PCG组相比，MLG组、MMG组北京鸭9 d空肠IL-10的mRNA表达量显著增加（P<0.05），MLG组、MMG组、MHG组、AG组北京鸭9 d空肠TNF-α的mRNA表达量显著减少（P<0.05），MLG组、MHG组北京鸭28 d空肠TNF-α的mRNA表达量显著减少（P<0.05）。结果表明，MAG可上调抗炎因子，下调促炎因子的表达，减轻E.coli O78引起的空肠炎性反应；且相比于VIR，低剂量MAG效果更显著。

2.5　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭空肠紧密连接蛋白、MUC2的影响

由表7可知，与PCG组相比，MLG组北京鸭9、14和28 d空肠闭合小环蛋白-1（Zonula occluden-1，ZO-1）、闭锁蛋白（Occludin）的mRNA表达量显著增加（P<0.05），MMG组北京鸭28 d时Occludin的mRNA表达量显著增加（P<0.05），MHG组、AG组北京鸭14 d空肠ZO-1的mRNA表达量显著增加（P<0.05）。由表8可知，与PCG组相比，MLG组、MMG组北京鸭14和28 d空肠MUC2的mRNA表达量显著增加（P<0.05）。结果表明，应用MAG可上调肠道屏障相关基因的表达，增强肠道屏障功能，保护肠道健康；且相比于VIR，低、中剂量MAG效果更显著。

3　讨 论

3.1　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭生长性能的影响

本研究中，E.coli感染后，攻毒组北京鸭ABW、ABWG、AFI及F/G均显著降低，这与之前的研究结果一致^［19］，表明E.coli感染可降低北京鸭的生长性能；这可能与其逃避宿主免疫抑制，诱发机体炎症反应及氧化应激，攻击宿主免疫系统，降低免疫和肠道功能有关^［19］。本研究中，低、中、高剂量MAG及AG组北京鸭未见明显的生长性能改善；这与200和300 mg/kg MAG均可显著提高临武肉鸭和黄羽肉鸡ADG的研究结果不一致^［20-21］，但与MAG对已绝育公猪的生长性能无显著影响的研究结果一致^［22］，这可能与本研究动物模型建立、饲养环境、试验条件、试验周期等多种因素有关。MAG能否改善感染E.coli北京鸭等非健康家禽的生长性能有待进一步验证。

3.2　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭空肠形态结构与通透性的影响

肠道是机体消化吸收营养物质、产生免疫保护作用的重要器官，与家禽生长发育和机体健康息息相关^［16］。本研究中，感染E.coli北京鸭空肠肠绒毛结构不完整且排列紊乱，空肠肠道VH和V/C减小，CD增加，与之前的试验研究结果一致^{［19，23-24］} ，表明E.coli感染后北京鸭空肠上皮细胞生长发育减缓，肠绒毛形态结构受损，消化吸收功能减弱。不同剂量MAG处理后，北京鸭空肠VH及V/C显著增大、CD显著减小，在感染中、末期，低、中剂量MAG对于北京鸭空肠VH、CD、V/C的影响更显著，这与100或200 mg/kg MAG可提高蛋鸡或临武肉鸭肠道VH及V/C的研究结果一致^［25-26］，表明MAG可有效减轻E.coli引起的肠道形态结构损伤，有助于平衡北京鸭肠道健康稳态，且低、中剂量MAG效果显著强于高剂量MAG及VIR。

DAO和D-LA可反映肠道通透性的变化，是肠道屏障受损的预警指标^［16］。本研究中，E.coli感染初期，北京鸭血清DAO和D-LA浓度随之增加，表明其肠道屏障受损，与肠道形态结构的受损变化相吻合；D-LA通过受损的肠黏膜进入血液，为E.coli的入侵和有害物质侵害机体提供机会，进而引发全身炎症反应，威胁其健康^［19］。而中剂量MAG处理后二者浓度显著降低，这与前人的研究结果一致^{［3，14，24，27］}；表明MAG能够逆转感染初期北京鸭肠道通透性的变化，稳固肠道屏障，且中剂量MAG效果更为显著。

3.3　厚朴酚对感染大肠杆菌北京鸭肠道屏障功能的影响

MAG可通过不同信号通路多向调节肠道炎症因子，减轻肠道炎症反应，增强肠道免疫功能。在小鼠结肠炎中，MAG抑制Toll样受体/核因子-κB信号通路，下调肠道促炎因子TNF-α的mRNA表达水平^［28］。还有研究表明，MAG通过调节肠道细胞一氧化氮的浓度，降低大鼠回肠TNF-α水平，提高回肠IL-10的mRNA表达量，以此拮抗大鼠脓毒症引起的胃肠功能障碍^［29-30］。本研究中，在感染初期，低、中剂量MAG处理后北京鸭空肠IL-10的mRNA表达量显著增加，不同剂量MAG或VIR处理后北京鸭空肠TNF-α的mRNA表达量显著减少，与上述研究结果相符；表明不同剂量MAG均可减轻E.coli诱导的北京鸭空肠炎症反应，且低、中剂量MAG的效果显著强于高剂量MAG及VIR；这可能是MAG介导特定信号通路产生的结果。

紧密连接（Tight junction，TJ）是肠道机械屏障的核心，由多种膜蛋白和闭合小环蛋白构成，其中Occludin、Claudin-1和ZO-1广泛用于肠道机械屏障的评估^［31］。研究指出，MAG通过增加回肠和结肠Occludin、ZO-1的mRNA表达量修复小鼠肠道机械屏障的损伤^［32］。在感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡试验中，MAG可增加ZO-1和Occludin的mRNA表达量，提高微生物优势菌群的丰度，减少球虫引起的雏鸡生长性能下降^［33］。在炎症因子与TJ相关性的研究中，TNF-α可通过多种途径影响肠道TJ的分布与表达，以此破坏肠道机械屏障，危害肠道健康^［34-35］；IL-10可减缓TNF-α诱导的不良反应，降低肠道屏障受损程度，减轻肠道炎症反应^{［34，36］}。本研究中，不同剂量MAG均显著增加了感染E.coli O78北京鸭空肠ZO-1和Occludin的mRNA表达量，其中低剂量MAG效果更为显著，这与血清通透性指标及空肠炎症因子的mRNA表达情况相吻合。由此可知，MAG能够通过炎症因子或其他通路，调节肠道TJ相关基因的表达，进而增强感染E.coli北京鸭的肠道机械屏障功能，维持北京鸭肠道健康。

MUC2在肠腔内容物与肠上皮之间形成一道屏障，阻止病原微生物与机体接触，起到抵御病原微生物的作用^［6］。本研究中，在感染中、末期，低、中剂量MAG处理后，北京鸭空肠MUC2的mRNA表达量显著增加。虽然目前尚未有研究提到MAG对肠道MUC2的影响，但根据本研究结果推测，低、中剂量MAG或许能促进北京鸭肠道MUC2的分泌，减少E.coli在肠上皮细胞的粘附，从而增强机体的抵抗力。

本研究中，MAG展现了其在感染E.coli北京鸭肠道健康的促进作用，进一步印证其作为绿色安全饲料添加剂防治家禽细菌性疾病的潜力。未来的研究可深入探讨MAG在北京鸭大肠杆菌病中产生保护作用的机制及相关信号通路，精准定位，为MAG防治北京鸭大肠杆菌病提供更多的理论和实践支持。目前，MAG提取加工工艺日趋成熟，但未有厂家生产和提供添加MAG的家禽饲料，未来的研究可关注MAG家禽饲料的生产工艺研发与流水线生产。MAG作为饲料添加剂机制的深入探究，生产工艺的研发，将为MAG应用至家禽生产及疾病防治提供理论基础和技术支撑，为北京鸭乃至家禽养殖行业防治大肠杆菌病提供新的思路与方法。

4　结 论

本研究条件下，日粮添加100、200和300 mg/kg的厚朴酚均可在一定程度上提高感染大肠杆菌北京鸭免疫功能、改善肠道形态结构及屏障功能、保护肠道健康。其中，100和200 mg/kg厚朴酚处理组效果较好，能产生与维吉尼亚霉素同等甚至更优的效果，因此在北京鸭日粮中添加厚朴酚的推荐剂量为100和200 mg/kg。

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