新疆不同动物粪源肺炎克雷伯菌的耐药性及毒力基因分析

Antimicrobial resistance and virulence gene analysis of Klebsiella pneumoniae from different animal faeces in Xinjiang

摘要

为了解新疆不同动物粪源肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）的耐药表型、耐药基因及毒力基因携带情况，根据耐药表型指导临床合理用药，本研究从新疆9个地区分别采集多种饲养模式下牛、羊、马、骆驼、驴、猪、鸡和鸽的粪便共1 140份，进行KP的分离与鉴定。采用琼脂稀释法进行8种抗菌药物的最小抑菌浓度测定，并通过PCR方法检测25种耐药基因以及11种毒力基因。结果表明：1）分离得到KP共88株，分离率为7.7%。不同动物粪源KP的分布情况不同，分离率从高到低依次为牛源（40.3%，27/67）、猪源（13.6%，17/125）、马源（13.5%，10/74）、鸽源（11.9%，5/42）、骆驼源（8.5%，19/223）、驴源（4.3%，4/92）、鸡源（3.9%，5/129）以及羊源（0.3%，1/388）。2）耐药表型分析显示，不同动物粪源KP对抗菌药物的耐药程度不同，耐药严重程度大致为牛源>猪源>鸡源>马源>骆驼源>鸽源>驴源>羊源；对四环素（86.4%）、氟苯尼考（63.6%）耐药率较高，3耐及以上菌株占62.5%。3）耐药基因检测结果显示，不同动物粪源KP中oqxB、qnrS和oqxA喹诺酮类耐药基因的检出率比较高，分别为77.3%、73.9%和72.7%，且3种基因共存情况达58.0%。bla_TEM和sul1的检出率均为34.1%；mcr‐8的检出率为17.0%；bla_OXA检出率较低，为2.3%。tet（X4）仅在一株菌中检出，检出率为1.1%。4）毒力基因检测结果显示，铁载体系统相关基因中iucA和iutA检出率最高，分别为82.9%和81.8%，其次脂多糖相关基因中wabG的检出率最高，为57.9%，其余毒力基因检出率从高到低依次为allS（22.7%）、iroNB（22.7%）、aer（2.3%）、rmpA2（2.3%）、wcaG（1.1%）；荚膜相关基因rmpA和溶菌素相关基因hly未检出。综上，新疆不同动物粪源KP存在耐药谱广、耐药率高且耐药基因和毒力基因携带率高的特征，建议应从同一个健康的视角出发，开展动物粪源KP耐药性及毒力基因的定期监测，针对其耐药表型和耐药基因的流行情况对不同动物进行合理的用药安排，从而降低耐药菌产生的风险。

Abstract

The study was to understand the drug resistance phenotype， drug resistance gene and virulence gene carried by Klebsiella pneumoniae （KP） of fecal source in different animals in Xinjiang， and to guide the clinic to rationalize the use of drug in different animals based on the results of resistance phenotype. In this study， 1 140 feces of cattle， sheep， horse， camel， donkey， pig， chicken and pigeon under various feeding patterns were collected from 9 regions of Xinjiang for the isolation and identification of Klebsiella pneumoniae. The minimum inhibitory concentration of 8 antibacterial drugs was determined by agar dilution method， and 25 drug resistance genes and 11 virulence genes were detected by PCR. The results showed as follows： 1） A total of 88 strains of KP were isolated， and the isolation rate was 7.7%. The distribution of KP in different animal fecal sources was different， and the isolation rate from high to low was cattle source （40.3%， 27/67）， pig source （13.6%， 17/125）， horse source （13.5%， 10/74）， pigeon source （11.9%， 5/42）， camel source （8.5%， 19/223） and donkey source （4.3%， 4/92）， chicken （3.9%， 5/129） and sheep （0.3%， 1/388）. 2） The analysis of drug resistance results showed that the degree of drug resistance of KP from different animal fecal sources was different， and the severity of drug resistance was roughly cattle source>pig source>chicken source>horse source>camel source>pigeon source>donkey source>sheep source. The resistance rate to tetracycline （86.4%） and flufenicol （63.6%） were high 62.5% of strains resistant to three or more drugs. 3） The results of drug resistance gene detection showed that the detection rates of quinolone resistance genes of oqxB， qnrS and oqxA in KP from different animal feces were relatively high， which were 77.3%， 73.9% and 72.7%， respectively， and the coexistence of the three genes was 58.0%. The detection rates of bla_TEM and Sul1 were 34.1%. The detection rate of mcr-8 was 17.0%. bla_OXA had a lower detection rate of 2.3%. tet（X4） was detected in only one strain， with a detection rate of 1.1%. 4） Virulence gene test results showed that the detection rates of iucA and iutA were the highest among ferriferous carrier system-related genes （82.9% and 81.8%， respectively）， followed by the detection rates of wabG among lipopolysaccharid-related genes （57.9%）. The detection rates of other virulent genes from high to low were allS （22.7%）， iroNB （22.7%）， aer （2.3%）， rmpA2 （2.3%） and wcaG （1.1%）. Capsulin-related gene rmpA and lysin-related gene hly were not detected. To sum up， different animal feces source KP in Xinjiang are characterized by wide drug resistance spectrum， high drug resistance rate， and high carrying rates of drug resistance genes and virulence genes. It is recommended to carry out regular monitoring of KP resistance and virulence genes from the same health perspective， and make reasonable medication arrangements for different animals based on their drug resistance phenotype and prevalence of drug resistance genes， thus reducing the risk of the emergence of drug-resistant bacteria.

Graphical abstract

关键词

肺炎克雷伯菌 / 不同动物粪源 / 耐药表型 / 耐药基因 / 毒力基因

Key words

Klebsiella pneumoniae / different animal faeces sources / drug-resistant phenotype / drug resistance gene / virulence gene

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是革兰氏阴性条件性致病菌，属于肠杆菌科克雷伯菌属^［1］，普遍存在于环境中^［2］，且至今仍是世界上最常见的致病菌之一^［3］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将直接接触或间接接触（包括通过食物、水以及环境）从动物传播给人类的疾病定义为人畜共患病^［4］。而KP不仅能引起人的膀胱炎、心内膜炎、坏死性肺炎、化脓性肝脓肿和败血症等疾病^［5］，还对畜禽业有严重的危害，可感染各种家畜、家禽、野生及水生动物^［6］。据报道，KP是引起奶牛乳房炎的重要病原微生物之一，在奶牛发生临床型或者亚临床型乳腺炎中均有检出^［7-8］。由于KP感染，造成某湖羊养殖场的湖羊死亡率达30.0%^［9］。该菌能引起牛呼吸系统疾病并导致其急性死亡，也能引起鸭鹅患病、仔兔腹泻、甚至死亡，造成狐、貉、貂等毛皮动物出血性肺炎，严重危害养殖业^［10-12］。

早在2014年WHO就已经宣称，不断出现的多重耐药病原菌是全球性公共卫生的巨大挑战。KP已经成为全球多重耐药的最主要病原菌之一，临床KP的耐药率在近年来仍在显著地上升中^［13-14］。据报道^［15］，我国KP对三代头孢类抗生素的耐药率已超过50.0%。而对于目前抗菌作用最强的碳青霉烯类药物，根据2014—2023年中国细菌耐药监测网（www.chinet.com）的数据显示，KP已成为中国最常见的耐碳青霉烯类的主要肠杆菌，耐药率从2014年的19.2%急剧上升至2023年的25.4%。

在我国关于动物源KP的耐药性和毒力基因的检测，大多只是聚焦于一种或两种动物，如新疆阿克苏地区猪源KP^［16］、新疆南疆地区马鹿源KP^［17］耐药性的相关研究。结果显示，新疆部分地区猪源、马鹿源KP耐药情况较为严重，而鲜见对多种动物源KP的研究报道，因此在新疆多种动物肠道中KP的分布情况、耐药基因和毒力基因的携带情况尚不明确。本研究以新疆9个地区8种动物（包括牛源、羊源、马源、骆驼源、驴源、猪源、鸡源和鸽源）粪源KP为研究对象，开展耐药调查以及相关耐药基因和毒力基因的检测，以期掌握新疆多种动物粪源KP的耐药现状、耐药基因和毒力基因的携带情况，为临床合理用药提供科学依据，同时获取携带耐药基因、毒力基因的菌株，可为后期进行KP的多重耐药机制的探索和基因组流行特征解析提供研究材料。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株

2023年在新疆麦盖提县以及乌鲁木齐县采集牛源肛拭子样品67份；在伊犁采集羊源肛拭子388份、马源肛拭子74份；在昌吉玛纳斯、吉木乃以及米东区采集骆驼源肛拭子223份；在哈密采集驴源肛拭子92份；在昌吉某猪场采集猪源肛拭子125份；在巴音郭楞蒙古自治州且末县以及尉犁县采集鸡源肛拭子129份、鸽源肛拭子42份。采集新疆9个地区8种动物粪源样品共计1 140份。质控大肠杆菌ATCC 25922购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2　主要试剂和培养基

MH（Mueller-Hinton）培养基、脑心浸液培养基（Brain heart infusion medium，BHI）、麦康凯琼脂以及麦康凯肌醇羧苄青霉素琼脂（MIAC）购自青岛海博生物技术有限公司；1×TE缓冲液、50×TAE购自上海生工生物有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1　细菌分离鉴定

将样品菌悬液震荡混匀，吸取10 μL至1 mL灭菌BHI中，在摇床37 ℃、200 r/min下，过夜培养，用灭菌接种环划线于MIAC琼脂培养基上培养18~ 24 h后，选择呈粉红色圆润光滑的疑似单菌落并进行纯化，对疑似KP进行持家基因khe的PCR扩增^［18］。将出现目的片段的产物进行回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。通过BLASTn比对测序结果，相似性>96.0%的判定为KP。

1.2.2　菌株保存

将分离鉴定出的菌株与60.0%灭菌甘油按2∶1混合后保存至-80 ℃备用。

1.2.3　药物敏感性试验

本试验采用2017年欧盟药敏试验标准（EUCAST）^［19］和2016年美国临床和实验室标准协会（CLSI）^［20］推荐的琼脂稀释法进行药物敏感性试验。根据养殖场所用药物以及备选药物筛选出6大类8种抗菌药物，分别为氨基糖苷类（AMK、GEN）、四环素类（TET、TIG）、氟喹诺酮类（CIP）、β-内酰胺类（FOX）、酰胺醇类（FFC）、多肽类（PB）。对分离的KP进行上述抗菌药物的药敏试验，大肠杆菌ATCC 25922作为标准质控菌株，结果判定以EUCAST和CLSI动物源细菌抗菌药物敏感性试验执行标准为准。

1.2.4　耐药基因以及毒力基因检测

对不同粪源的KP进行β-内酰胺酶类（bla_TEM、bla_CTX-M、bla_NDM和bla_OXA）、氨基糖苷类（ant（3″）-Ia、aac（6′）-Ib）、四环素类（tet（A）、tet（M）、tet（X3）、tet（X4））、氟喹诺酮类（oqxA、oqxB、qnrS）、酰胺醇类（floR）、多粘菌素类（mcr-1~9）和磺胺类（sul1、sul2）耐药基因进行检测；对与荚膜相关（rmpA、rmpA2、wcaG）、脂多糖相关（wabG）、菌毛相关（fimH）、铁载体相关（aer、iroNB、iutA、iucA）、尿囊素相关（allS）以及溶血素相关（hly）的毒力基因进行检测。所用耐药基因以及毒力基因的引物见文献^［21-39］，由生工生物工程（上海）有限公司合成上述引物。

1.2.5　数据分析

使用SPSS 27.0软件对不同动物粪源KP分离率、耐药基因和毒力基因检出率利用交叉表进行差异性分析，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2　结果与分析

2.1　不同动物源KP分离鉴定

由表1可知，共采集8种动物样品共计1 140份，经KP持家基因khe扩增分离鉴定得到88株KP，分离率为7.7%（88/1 140）。

不同动物粪源KP分离率由高到低依次为牛源（40.3%，27/67）、猪源（13.6%，17/125）、马源（13.5%，10/74）、鸽源（11.9%，5/42）、骆驼源（8.5%，19/223）、驴源（4.3%，4/92）、鸡源（3.9%，5/129）以及羊源（0.3%，1/388）。牛源KP的分离率显著高于其他动物源（P<0.05）；马源KP（13.5%）与猪源KP（13.6%）以及骆驼源KP（8.5%）与鸽源KP（11.9%）差异不显著（P>0.05）。

2.2　不同动物粪源KP的耐药及多药耐药分析

88株不同动物粪源KP对抗菌药物的耐药程度不同，耐药严重程度大致为牛源>猪源>鸡源>马源>骆驼源>鸽源>驴源>羊源（表2与图1）。

KP对TET（86.4%）、FFC（63.6%）表现出高水平耐药，对FOX（56.8%）、CIP（47.7%）、GEN（47.7%）及TIG（36.4%）表现中等水平耐药，对AMK（20.5%）和PB（20.1%）表现低水平耐药。

牛源、猪源、鸡源KP对CIP耐药率为40.0%~ 88.9%，明显高于骆驼源（21.1%）、羊源（0）、马源（0）、驴源（0）以及鸽源（0）KP（P<0.05）；除驴源（0）及鸽源（0）KP对庆大霉素敏感，骆驼源KP对庆大霉素耐药率（21.1%）较低，其他动物源KP对GEN的耐药率为40.0%~100%；牛源和鸡源KP对AMK的耐药率（55.6%、20.0%）差异不显著（P>0.05），而与马源（0）、骆驼源（0）、驴源（0）、鸽源（0）以及猪源KP（11.8%）差异显著（P<0.05）；牛源KP对FFC的耐药率为96.3%，显著高于其他源KP（P<0.05）；不同动物粪源KP对TET耐药率为40.0%~100%；牛源、驴源、猪源、鸡源、鸽源KP对TIG的耐药率均大于20.0%，高于羊源（0）、马源（0）、骆驼源（0）KP；牛源KP（74.1%）对FOX耐药显著高于骆驼源（42.1%）、鸡源（20.0%）、鸽源（0）KP，马源KP（80.0%）对FOX耐药率与骆驼源（42.1%）、猪源（70.6）、驴源（25%）KP相比差异不显著（P>0.05）；牛源KP（55.6%）对PB耐药情况显著高于猪源（5.9%）、马源（0）、骆驼源（0）以及鸽源（0）KP，其他动物源对PB的耐药率由高到低依次为驴源（25.0%）、鸡源（20.0%）和羊源（0）。

不同动物粪源分离出的KP共有26种耐药谱，且耐药表型在0~8耐均有分布（表3），主要集中在1~3耐（47.7%，42/88）和8耐（18.2%，16/88），其中以牛源和猪源KP多药耐药情况较为严重。牛源KP多药耐药以8耐为主，占55.6%（15/27）；羊源KP多药耐药以2耐为主，占100%（1/1））；马源KP多药耐药以2耐与3耐为主，各占50.0%（5/10）；骆驼源与驴源耐药谱集中在1~3耐，分别占84.2%（16/19）和100%（4/4）；猪源KP集中在3~6耐，占76.5%（13/17）；鸡源KP以0耐为主，占60.0%（4/5），4耐与8耐各1株，各占20.0%（1/5）；鸽源KP集中在0~3耐，占100%（5/5）。

猪源KP共有10种耐药谱型，以6耐谱型CTP-GEN-FFC-TET-FOX-TIG为主，占比为35.3%（6/17）。牛源、骆驼源KP耐药谱型都有9种，其中牛源以8耐谱型CIP-GEN-AMK-FFC-TET-FOX-TIG-PB为主，占55.6%（15/27）；骆驼源以2耐谱型FFC-TET为主21.1%（4/19）。马源与驴源KP耐药谱型均为4种，马源KP以2耐谱型FFC-TET为主，占40.0%（4/10）；驴源则在TIG、TET、TIG-PB、FFC-TET-FOX均有分布，且比例相同，为25.0%（1/4）。鸽源有3种耐药谱型且在0~3耐均有分布，耐药谱为TIG、TET-TIG、FFC-TET-TIG，且比例相同，为20.0%（1/5）。鸡源有2种耐药谱型，在4耐谱型CIP-GEN-FFC-TET以及8耐谱型CIP-GEN-AMK-FFC-TET-FOX-TIG-PB均有分布，且比例相同，各占20.0%（2/5）。羊源有1种耐药谱型，为GEN-TET，占100%（1/1）。

2.3　不同动物粪源KP耐药基因检出结果及多重毒力基因携带情况

88株不同动物粪源KP中mcr⁃1~7、mcr⁃9、tet（M）、tet（X3）以及sul2未检出，其余15种耐药基因均被检出（表4）。oqxB、qnrS和oqxA的检出率最高，分别为77.3%、73.9%和72.7%，且3种基因共存情况达58.0%。bla_TEM、sul1的检出率均为34.1%；mcr⁃8的检出率为17.0%；bla_OXA检出率较低，为2.3%；tet（X4）仅在一株KP中检出，检出率为1.1%。氨基糖苷类基因检出率均在25.0%以上；四环素类耐药基因和喹诺酮类耐药基因检出率均在50.0%以上，分别为tet（A）（50.0%）和floR（52.3%）。

牛源KP中β-内酰胺类耐药基因bla_TEM检出率显著高于其他动物源（P<0.05），但bla_CTX-M检出率与其他动物源差异不显著（P>0.05）；仅在骆驼源与鸽源中检出bla_NDM，检出率分别为5.3%（1/19）和40.0%（2/5）；bla_OXA仅在猪源KP中检出。牛源、猪源以及鸡源KP中氨基糖苷类耐药基因ant（3″）-Ia携带率均在60.0%以上，骆驼源为5.3%，其他动物源中未检出；aac（6′）-Ib携带率从高到低依次为牛源（66.7%）、马源（40.0%）、鸽源（40.0%）、猪源（11.8%）。四环素类耐药基因tet（X4）仅在骆驼源中检出占1.1%（1/88）；羊源与马源KP中未检出tet（A），在其他动物源中检出率依次为牛源（85.2%）、猪源（70.6%）、鸡源（60.0%）、鸽源（40.0%）、驴源（25.0%）、骆驼源（15.8%）。牛源和猪源KP中floR携带率分别为81.5%和82.3%，显著高于其他动物源KP（P<0.05），但与驴源（50.0%）、鸽源（60.0%）和鸡源（100%）差异不显著（P>0.05）。多粘菌素类耐药基因mcr⁃8仅在牛源中检出，检出率为55.6%。鸡源KP在所检出的磺胺类相关耐药基因sul1中占80.0%，高于牛源（70.4%）、猪源（35.2%）以及鸽源（20.0%）。

不同动物粪源分离出的KP共有39种多重耐药基因谱型，携带0~11种耐药基因（表5），主要携带3~6种（56.8%，50/88）和11种（15.9%，14/88）耐药基因，其中牛源与猪源携带多重耐药基因情况较为严重，牛源KP有10种耐药基因谱型，携带5~11种（85.2%和23/27）耐药基因，以tet（A）-mcr-8-bla_TEM-bla_CTX-M-ant（3'）-Ia-aac（6'）-Ib-floR-oqxA-oqxB-qnrS-sul1共存为主，占51.9%（14/27）；猪源KP共有12种多重耐药基因谱型，主要携带5~8种耐药基因（82.4%，14/17），以oqxA-oqxB-qnrS共存为主，占17.6%（3/17）；骆驼源KP共有8种多重耐药基因谱型，以oqxA-oqxB-qnrS共存为主，为57.9%（11/19）；马源KP共有5种多重耐药基因谱型，以bla_TEM-aac（6'）-Ib-qnrS共存为主，占40.0（4/10）。鸡源与鸽源KP均有5种多重耐药基因谱型，鸡源以bla_CTX-M-ant（3'）-Ia-floR-oqxB-sul1共存为主，鸽源以bla_NDM-bla_CTX-M-aac（6'）-Ib-floR-oqxB-qnrS共存为主，均为40.0%（2/5）。驴源KP有2种多重耐药基因谱型，以floR-oqxA-oqxB-qnrS共存为主，50.0%（2/4）。羊源KP仅有bla_CTX-M-oqxB这1种多重耐药基因谱型，为100%（1/1）。

2.4　不同动物粪源KP毒力基因检出结果及多重毒力基因携带情况

毒力基因检测结果显示（表6），铁载体系统相关基因aer、iroNB、iutA、iucA检出率依次为2.3%、22.7%、81.8%和82.9%；荚膜相关基因rmpA2、wcaG检出率分别为2.3%和1.1%；脂多糖相关基因wabG检出率为57.9%；尿囊素相关基因allS检出率为22.7%；荚膜相关基因rmpA以及溶菌素相关基因hly未检出。

荚膜相关基因rmpA2在牛源（3.7%）与骆驼源（5.3%）中检出，其余动物源中并未检出；而wcaG仅在羊源中检出，且检出率为100%。脂多糖相关基因wabG除了在牛源中未检出，在其他动物源检出率均高于20.0%。牛源KP中尿囊素相关基因allS检出率为3.7%，显著低于骆驼源（36.8%）、鸡源（60.0%）、鸽源（60.0%）以及羊源（100%），与马源（20.0%）和猪源（17.6%）差异不显著（P>0.05）。与铁载体相关基因iucA在所有动物源中均检出，且检出率均大于20.0%；羊源中未检出iutA基因，其余动物源KP中均检出，检出率均大于25.0%；马源KP的iroNB检出率为70.0%，与骆驼源（21.1%）、牛源（0%）和鸽源（0%）差异显著（P<0.05），与羊源（0%）、驴源（25.0%）、鸡源（20.0%）、猪源（41.2%）差异不显著（P>0.05）。

不同动物粪源中分离的KP多重毒力基因携带情况多集中在2~4种，占90.9%（80/88）；携带情况多以3种为主52.3%（46/88），其中wabG-iutA-iucA谱型最多（42.0%，37/88）；同时携带5种毒力基因菌株多集中在猪源KP中，占60.0%（3/5）（表7）。

3　讨 论

KP近年来在人医临床上的分离率已仅次于大肠埃希菌，并且随着抗菌药物不断的滥用、乱用，耐多药KP的分离率也不断上升^［40-41］。本研究以新疆9个地区不同养殖环境下的8种不同动物直肠中分离出的KP为研究对象，分析新疆不同动物粪源KP的分离情况、耐药特点以及耐药基因与毒力基因的携带情况，以期对临床用药有一定的指导意义。

本研究中，牛源样品采自新疆麦盖提县以及乌鲁木齐县，其中麦盖提县牛源KP分离率为31.9%（15/47），乌鲁木齐县牛源KP分离率为60.0%（12/20）。虽然两地均为集约化养殖，但其分离率相差较大，可能与两地区养殖密度以及养殖规范程度有关。骆驼源样品采自昌吉玛纳斯、吉木乃以及米东区，其中昌吉玛纳斯KP分离率为7.6%（9/119）；在米东区KP分离率为9.3%（5/54）；在吉木乃地区KP分离率为10%（5/50）。这3个地区骆驼养殖模式均为家庭散养，分离率相差不大，可能与养殖密度合理并且放牧式养殖模式有关。

本研究中，不同动物粪源的KP整体分离率为7.7%，与Martin等^［42］所报道的相符，不同动物粪源KP分离率以牛源最高，为40.3%，远远高于杜琳等^［43］在内蒙古、河北、黑龙江、上海和山东等地区中牛乳样中的分离率（9.26%）；本研究中猪源KP分离率为13.6%，与欧冠标等^［18］报道的猪源KP分离率基本相同；但羊源分离率（0.3%）与郭良帅^［44］对羊源KP分离率（16.0%）相差较大，可能由于其样品来源主要为死羊的脏器；马源、骆驼源与鸽源分离率差别不大，均在10.0%左右。不同动物粪源KP检出率以羊最低，这可能与所采羊的健康状况、饲养模式、养殖环境等有关。综上，KP作为肠道的条件性致病菌在不同动物中均有所分离，但由于是从不同动物粪源中分离，所以具有一定差异性。

本研究中不同动物粪源KP对TET表现出高度耐药（86.4%），与徐睿等^［45］所报道的耐药结果（96.6%）相近，对四环素高耐药原因可能是其作为广谱药物，所以在兽医临床中广泛使用，因而增加了菌群对这种药物的耐受性；新疆不同动物粪源KP对GEN（47.7%）、CIP（47.7%）和TIG（36.4%）中等耐药，对AMK（20.5%）和PB（20.1%）呈现较低水平耐药，提示可作为治疗不同动物KP感染的备选药物。虽然不同动物源中KP对AMK耐药率较低，但是在临床使用时也应该严格控制药物使用，通过联合用药或者轮换用药来减少AMK耐药株的产生，从而能有效避免AMK耐药株的爆发。

新疆不同动物粪源KP分离株大多为多药耐药，耐药谱分布在1~3耐（47.7%和42/88）以及8耐（18.2%和16/88）。不同动物粪源KP的耐药谱型存在差异，可能是菌株来源于不同地区、不同动物、不同养殖方式其用药习惯不同所导致的。牛源、猪源耐药率较高、耐药谱也较广，原因可能为两种动物的患病特点、用药多等原因导致分离株耐药情况严重；鸡（走地鸡）源、马源以及骆驼源耐药情况较为乐观，可能与这3种动物均为散养，且养殖密度小、食物新鲜等情况有关。在新疆不同动物粪源中出现大量多耐药菌株，会给由该菌引发疾病的防治带来一定困难，因此建议加强养殖场饲养管理，创造良好的养殖环境以减少耐药菌感染的发生，降低经济损失。

25种被检耐药基因中除mcr⁃1~7、mcr⁃9、tet（M）、tet（X3）以及sul2未检出，其余均检出。与药敏结果一致，牛源与猪源耐药基因携带率、携带种类均高于其他动物源，原因可能是牛、猪养殖密度大，在高密度下饲养动物会使圈舍环境负担增加而导致食物、水源被污染；并且养殖密度大会使动物该有的运动量不达标从而影响机体的健康状态，导致动物患病的几率增加。携带多种耐药基因的KP易通过粪便、污水等进行传播。mcr⁃8基因的检出率为17.0%，高于Mobasseri等^［46］对mcr系列基因检出率（3.7%），可能由于采样地区不同、采样部位不同及动物的健康状态等而存在差异。氟喹诺酮类耐药基因oqxB（77.3%）、qnrS（73.9%）和oqxA（72.7%）的检出率比较高，3种基因共存情况达58.0%，对环丙沙星耐药率为47.7%，中介率为8.0%，提示这些菌株作为潜在的耐药菌，可能会携带有相关耐药基因，与药敏结果相符，低于国内饶冠利等^［47］所报道对环丙沙星耐药率（61.96%）。本研究中检出四环素类药物耐药率为86.4%，其中50.0%的菌株检出tet（A）基因。有研究表明养殖环境是mcr⁃1、bla_NDM和tet（Ｘ）等耐药基因的重要储存库，可以介导这些耐药基因在病原菌中的传播^［48-50］。本研究中对bla_NDM以及tet（X4）分离率分别为3.4%和1.1%，提示携带上述基因的动物粪便有可能污染养殖场的环境，使其成为重要耐药基因储存库的风险增加。因此，应该对该地区不同动物粪源KP中携带的重要耐药基因进行定期监测，避免多重耐药KP菌株的扩散，从而危害人类健康。

此外，新疆不同动物粪源KP具有携带毒力基因种类多、检出率高的特点，本研究中wabG（57.9%）检出率较高。有研究报道表明，wabG基因在88.0%~100%的KP临床分离株均有检出^［51］；Jung等^［52］指出KP缺失wabG基因则不能产生溶血素或某些荚膜抗原，并且在腹腔内、肺炎和啮齿动物感染模型中毒力减弱。与尿囊素代谢相关的allS基因被细菌用来从环境中获取碳和氮^［53］，该基因在引起原发性肝脓肿的病原菌中检出^［54］。本研究中检出allS基因共20株（22.7%），在后续试验中可以通过动物试验来关注这些菌株的毒性大小。基因rmpA、rmpA2、aer和allS在高毒力KP菌株中比在经典KP中更常见^［55］。Shankar等^［56］在高毒力KP菌株中检测到了kfu、allS、entB和ybtS。本研究中分离的KP检出rmpA2、aer和allS毒力基因，显示携带上述毒力基因的KP可能为潜在的高毒力菌株，将在后续的试验中进一步验证。

本研究中所检出的耐药基因谱型种类以及数量远远大于毒力基因，耐药基因谱型多为tet（A）-mcr-8-bla_TEM-bla_CTX-M-ant（3'）-Ia-aac（6'）-Ib-floR-oqxA-oqxB-qnrS-sul1，占16.0%（14/88），而毒力基因谱型多以wabG-iutA-iucA谱型最多，为42.0%（37/88）。耐多药和非耐多药KP都可以携带单个至多重毒力基因。耐药特性与毒力因子可能存在着复杂的相互制约的关系，而且由于致病性与其所携带的毒力基因密切相关，在后续的研究中还需加强毒力因子方面的相关研究。

4　结 论

新疆9个地区8种不同动物粪源KP分离率以牛源最高，其次为猪源以及马源。8种动物粪源KP对四环素、氟苯尼考耐药率高，与其对应的基因检出率也较高。不同动物粪源KP耐药率以及耐药基因检出情况以牛源最高，使牛场耐药菌的治疗和防控变得更加困难。耐药特性也与毒力之间存在着复杂的关系。养殖尤其是集约化养殖时要注意避免乱用、滥用抗菌药物，做到可以交替使用不同类型的抗菌药物，从而做到最大程度的避免细菌耐药性产生，同时要对养殖场环境加强管理，合理使用空间，避免耐药基因通过食物、水、土壤以及粪便传播的风险。

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基金资助

国家自然科学基金-地区基金项目(32360910)