不同海拔及不同猪种条件下猪肺脏组织低氧适应性的影响

Impact of hypoxic adaptation in pig lung tissue under different altitudes and pig breeds

摘要

为探究不同海拔环境下藏猪与约克夏猪肺脏组织中低氧适应的差异表达基因（Differentially expressed genes， DEGs），本研究选择饲养于海拔100和2 900 m的藏猪和约克夏猪，采集其肺脏组织为试验材料，提取其RNA，纯化后进行转录组测序分析。通过转录组学比较分析同一品种不同海拔以及同一海拔不同品种下猪肺脏组织的耐低氧分子机制，另外构建各组间交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选不同条件下的hub基因。结果表明：1）在不同海拔下的藏猪和约克夏猪的肺脏组织中共鉴定了20 266个基因。2）以|log₂Fold change|≥１，调整后的P<0.05为筛选条件，对差异表达基因进行进一步筛选，在藏猪肺脏组织中，筛选出306个DEGs；在约克夏猪肺脏组织中，共筛选出503个DEGs。3）在不同猪种下的DEGs主要富集在PI3K-Akt信号通路、在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢和代谢途径等与低氧反应密切相关的调控通路上；同时探究藏猪和约克夏猪的低氧适应相关基因表达的差异性。4）通过构建PPI网络图，确定了藏猪和约克夏猪的hub基因（SERPINA1、FGB、ALB、FGA、AMBP、SERPINC1和FGG）。综上，本研究通过转录组学筛选同一品种不同海拔以及同一海拔不同品种下猪肺脏组织的差异表达基因，并通过构建基因网络，最终找到SERPINA1和CCL27等14个上调基因可能参与藏猪和约克夏猪对于海拔适应的调控。本研究为藏猪低氧适应相关的候选基因和调控通路提供了宝贵见解。

Abstract

To explore differentially expressed genes （DEGs） related to hypoxia adaptation in lung tissues of Tibetan pigs and Yorkshire pigs under different altitudes， lung tissues were collected from Tibetan pigs and Yorkshire pigs raised at 100 and 2 900 m above sea level. RNA was extracted， purified， and subjected to transcriptome sequencing analysis. Through transcriptomic comparative analysis of the hypoxia tolerance molecular mechanisms in pig lung tissues at different altitudes within the same breed and at the same altitude between different breeds， a protein-protein interaction （PPI） network was constructed based on the intersection genes across the groups. Hub genes under different conditions were then screened. The results showed that：1） A total of 20 266 genes were identified in the lung tissues of Tibetan pigs and Yorkshire pigs at different altitudes. 2） Using |log₂Fold change|≥1 and an adjusted P<0.05 as screening criteria， differential expression genes （DEGs） were further filtered. 306 DEGs were identified in the lung tissue of Tibetan pigs， and 503 DEGs in the lung tissue of Yorkshire pigs. 3） The DEGs in different pig breeds were mainly enriched in regulatory pathways closely related to hypoxic response， such as the PI3K-Akt signaling pathway， the AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications， and the metabolism of glycine， serine， and threonine， as well as metabolic pathways. At the same time， the expression differences of hypoxia adaptation-related genes between Tibetan pigs and Yorkshire pigs were explored. 4） By constructing a PPI network， the hub genes in Tibetan pigs and Yorkshire pigs were identified as SERPINA1， FGB， ALB， FGA， AMBP， SERPINC1， and FGG. In summary， this study used transcriptomics to screen for differentially expressed genes in the lung tissues of pigs at different altitudes within the same breed and across different breeds at the same altitude， and by constructing a gene network， SERPINA1 and CCL27， along with 14 other upregulated genes， were identified as potentially involved in the regulation of altitude adaptation in Tibetan and Yorkshire pigs. These findings provide valuable insights into candidate genes and regulatory pathways related to low-oxygen adaptation in Tibetan pigs.

Graphical abstract

关键词

低氧适应 / 藏猪 / 约克夏猪 / 差异表达基因 / PPI网络

Key words

hypoxia adaptation / Tibetan pig / Yorkshire pig / differentially expressed genes / PPI network

缺氧会引起一系列应激反应，包括机体代谢紊乱、氧化应激及对组织和细胞膜的损伤等^［1-2］。藏猪是一种地方小型猪种，通常生活在海拔3 000 m以上的山区，在长期的进化过程中为了适应高海拔和恶劣天气条件，形成了独特的生理机制和功能特性^［3-4］，是研究高原低氧适应性的理想猪种。低氧适应是一个受多种因素影响的复杂生理过程。生活在高原的动物经过长期进化，会通过不同的机制适应缺氧环境^［5-6］。与杂交猪相比，藏猪具有更发达的心脏组织，同时其肺血管系统中有着较粗的动脉及更为发达的毛细血管网，这些特征使得气体交换速率更高，有助于它们在高原低氧环境下的适应能力^［7］。在细胞层面上，如杨麟天等^［8］通过低氧环境下培养藏猪和长白猪心肌细胞，最终发现藏猪心肌细胞适应低氧环境的能力明显高于长白猪心肌细胞，并且藏猪的心肌细胞所受损伤相较于长白猪心肌细胞明显较小。

转录组学是一门在整体水平上研究细胞内基因表达情况及其转录调控规律的学科。该学科能够提供更全面、有效信息，用于推测未知基因功能，并揭示畜禽在不同生物学过程中的调控机制，其在一定程度上可为生物的低氧适应性提供科学依据。如赵坤钰等^［9］通过转录组技术发现在不同海拔下的喜马拉雅旱獭可能通过调整细胞代谢、提高氧化还原能力以及增强免疫反应来维持自身的生理功能和生存能力。本研究团队通过对藏猪和约克夏猪的心脏组织及肝脏组织进行转录组和蛋白质组联合分析，筛选出与低氧适应相关的新候选基因^［10-11］，为猪的低氧适应机制提供了新的研究线索。张博等^［12］通过研究发现，eNOS这一典型低氧适应基因在藏猪中的表达量与低地大约克猪和移居高原的大约克猪存在差异，且在心肌、肝脏和肺脏组织表现不同，可能在低氧适应性过程中起不同的调节作用。综上所述，不同物种和组织在低氧环境下可能表现出不同的适应能力。

目前，关于不同猪种在不同海拔环境下肺脏组织对低氧适应的调控机制尚缺乏深入研究。因此，本研究以不同海拔的藏猪和约克夏猪的肺脏组织为研究对象，采用转录组测序方法分析藏猪和约克夏猪肺脏组织的差异基因（DEGs），探究不同海拔条件下高原低氧适应机制的相关基因及通路，参考本研究团队先前研究^［13］，旨在探讨不同海拔条件下藏猪和约克夏猪的耐低氧分子机制，为进一步探究猪高原低氧适应机制提供新的见解。

1　材料及方法

1.1　试验材料

选择饲养于中国农业大学动物科学技术学院（海拔约100 m）的藏猪（Tibetan pig，Low altitude；TL）和约克夏猪（Yorkshire pig，Low altitude；YL）、饲养于西藏农牧学院实习牧场（海拔约2 900 m）的藏猪（Tibetan pig，High altitude；TH）和饲养于西藏林芝市宇高农业养殖场（海拔约2 900 m）约克夏猪（Yorkshire pig，High altitude；YH）为研究对象。试验猪只保持相同饲养条件，每组随机选择9头180日龄的健康去势公猪进行屠宰，每个个体收集3份肺脏组织样本用于提取RNA，液氮速冻，储存在-80 ℃中。

1.2　总RNA提取及质量检测

为减少测序成本并确保数据的代表性，对样本进行了9混1处理，即每组将3头猪的肺脏组织样本混合成1个复合样本。经过此处理，每个处理组最终获得了3个复合RNA样本，供后续的RNA测序分析使用。本研究使用Trizol法提取复合样本的总RNA，利用Nano Drop 2000超微量分光光度计（Thermo，美国）和1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA浓度和纯度。通过了质量评估的总RNA，使用QIAQuick PC（QIAGEN，德国）对RNA进行纯化。

1.3　文库构建与测序

在保证样品质检合格的情况下，进行文库的构建。具体操作为：用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，随后加入Fragmentation buffer将mRNA打断为短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成单链cDNA，加入缓冲液、dNTPs、RNase H等合成双链cDNA，用试剂盒纯化双链cDNA后进行末端修复、加Ａ尾并连接测序接头，通过Gel imager（BioRad，美国）回收包含目的片段凝胶，然后通过PCR进行扩增，从而获得高纯度目标DNA片段。

构建文库后，为保证有效浓度超过10 nmol/L，使用基于荧光的定量PCR仪器对文库浓度进行定量。最后通过Illumina NovaSeq 6000测序仪进行150 bp的双端读取。

1.4　测序数据分析

合格的样品在测序平台上进行测序以获得原始数据（Raw reads）。随后进行数据的处理，包括去除质量差的序列和含有污染接头的无用序列。经过处理后，最终输出高质量的序列，即Clean reads，使用HISAT2 v2.1.0将Clean reads映射到参考基因组（Sus scrofa genome v11.1，从ENSEMBL Web服务器下载），基于这些Clean reads进行测序数据分析。通过HTSeq v0.6.0（https：//github.com/simonanders/htseq）对每个样品中每个基因的reads进行计数。然后计算每百万个映射读段中每千碱基的片段数（FPKM），以估计每个基因的表达水平。

1.5　差异基因筛选

本试验选择不同海拔同一品种下以及不同品种同一海拔下进行后续的分析。采用DESeq2 v1.6.3软件筛选差异表达基因（DEGs），选择符合|log₂Fold change|≥1和调整后的P<0.05的标准的基因用于进一步分析。本试验选择不同海拔同一品种下和不同品种同一海拔下分别进行后续的分析。各组中差异基因按照显著性进行排名，根据结果列出组间前10个显著差异的基因具体信息，包括基因名称，log₂Fold change值和P值等。

1.6　基因的GO富集分析和KEGG途径分析

不同海拔同一品种下和不同品种同一海拔下的DEGs分别通过BLAST软件结合Sus scrofa数据库（https：//ftp.ensembl.org/pub/release-109/gtf/sus_scrofa/）进行GO（Gene ontology）功能注释和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）路径富集分析。为控制计算的假阳性率，使用Benjamini-Hochberg方法进行校正P值，最终采用错误发现率（FDR）作为过滤GO和KEGG路径的关键指标。当FDR<0.01时，认为GO和KEGG功能存在极显著富集情况。分析结果反映在柱状图和气泡图中，并使用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制。

同时挑选各组中与低氧适应相关的通路，并引用FPKM值来比较基因在不同处理下的表达量。表达量用Excel进行数据整理，用SPSS 23.0对数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s法对数据进行两两比较，结果用“平均数±标准差”表示，以P值作为差异显著性的判断标准，P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著。

1.7　通过绘制PPI网络挑选hub基因

将不同海拔下的藏猪和约克夏猪肺脏组织中的差异基因进行Venn分析，将不同品种在高海拔和低海拔环境下肺脏组织中的差异基因进行Venn分析。将各组间得到的交集基因分别输入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），选择分析的物种为“Sus scrofa”，并将“minimum required interaction score”设置为置信水平0.400。使用Cytoscape v3.9.1对数据进行可视化处理，根据Degree值选择hub基因。

2　结果与分析

2.1　总RNA检测与转录组数据质量评估

本试验利用Trizol法提取猪肺脏组织总RNA，对所有提取的样品总RNA进行检测分析，发现所提RNA质量较好，符合进行下一步试验要求。之后进行测序及数据质控，各样本获得42 922 674~47 869 324条Clean reads，质控后的有效率比例接近95%，Q30评分接近92%，转录组数据可靠，可以用于后续分析，转录组测序数据显示（表1）。此外，对差异基因表达和样本进行了双向层次聚类热图分析，如图1（a）（b）和图2（a）（b）所示。结果显示，不同处理下各组间基因表达存在显著差异，这表明基因在不同条件下可能发挥其生物调节作用。此外，每个组内的3个生物重复样本之间存在相互关联，重复性较好。

2.2　不同海拔下藏猪和约克夏猪肺脏组织的差异表达基因筛选

转录组数据显示在高海拔和低海拔藏猪之间有19 583个DEGs表达，在高海拔和低海拔约克夏猪之间有19 452个DEGs表达。以|log₂Fold change|≥１，调整后的P<0.05为筛选条件进行筛选后，在TH和TL组中，发现了306个DEGs，其中157个基因上调，149个基因下调（图1（c））。同样，YH和YL组有503个DEGs，其中311个基因上调，192个基因下调（图1（d））。藏猪中前10个显著上调和下调基因见表2，约克夏猪中前10个显著上调和下调基因见表3。

2.3　不同猪种在高海拔和低海拔下肺脏组织的差异表达基因筛选

转录组数据显示在高海拔的藏猪和约克夏猪之间有19 680个DEGs表达，在低海拔的藏猪和约克夏猪之间有19 386个DEGs表达。在TH和YH组中，发现了462个DEGs，其中210个基因上调，252个基因下调（图2（c））。同样，TL和YL组有694个DEGs，其中423个基因上调，271个基因下调（图2（d））。低海拔下藏猪中前10个显著上调和下调基因见表4，高海拔下前10个显著上调和下调基因见表5。

2.4　不同海拔同一品种中肺脏组织差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG功能分析

对转录组测序鉴定的不同海拔下藏猪的DEGs进行GO和KEGG功能富集分析，发现DEGs富集于9个GO通路和6个KEGG通路。GO分析显著富集了胶原纤维组织、细胞外基质组织、细胞外空间、细胞外区域、细胞外基质、基底膜、胶原三聚体、细胞表面和细胞外基质结构成分等（FDR<0.01）（图3（a））；KEGG分析显著富集了蛋白质消化与吸收、细胞外基质-细胞外基质受体相互作用、变形虫病、点粘附、PI3K-Akt信号通路和在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等（FDR<0.01）（图3（b））。挑选出其中与低氧适应性相关的通路，再引用FPKM值来展示各组中低氧适应相关基因的表达情况，从藏猪的基因表达情况（表6）可以看到，在高海拔环境中TNC、COL1A2、COL4A5、COL1A1、COL4A4、COL6A6和COL4A2的表达量极显著低于低海拔（P<0.01），表现为明显下调。另外，LAMC3的表达量显著高于低海拔（P<0.05），表现为上调。

同时，对转录组测序鉴定的不同海拔下约克夏猪的DEGs进行GO和KEGG功能富集分析，发现DEGs富集于12个GO通路和5个KEGG通路。GO分析显著富集了血液凝固、纤溶、细胞外空间、胞膜外侧、细胞外区域、血小板α颗粒、纤维蛋白原复合物、上皮细胞膜顶部、胞膜的整合组分、乳糜微粒、丝氨酸型内切肽酶抑制剂活性和肝素结合等（FDR<0.01）（图4（a））。KEGG分析显著富集了补体和凝血级联反应、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、代谢通路、视黄醇代谢和氨基酸生物合成等（FDR<0.01）（图4（b））。挑选出其中与低氧适应性相关的通路，再引用FPKM值来展示各组中低氧适应相关基因的表达情况，从约克夏猪的基因表达情况（表7）可以看到，在高海拔环境中PAGAM2的表达量显著高于低海拔（P<0.05），显示出上调趋势。

2.5　同一海拔不同品种中差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG功能分析

对转录组测序鉴定的低海拔和高海拔的DEGs进行GO和KEGG功能富集分析。为进一步分析不同海拔藏猪的DEGs，进行了GO和KEGG通路富集分析。低海拔的DEGs富集于8个GO通路和 5个KEGG通路。GO分析显著富集了细胞外基质组织、细胞表面受体信号通路、胶原纤维组织、细胞外基质、细胞外空间、质膜外侧、细胞外区域和细胞外基质结构成分（FDR<0.01）（图5（a）），FDR<0.01；KEGG分析显著富集了蛋白质消化与吸收、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、ECM-受体相互作用、IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等（FDR<0.01）（图5（b））。筛选与低氧适应有关的通路，并引用FPKM值来展示各组中低氧适应相关基因的表达情况，如表8所示。在低海拔环境下藏猪中CD1E、SCGB1A1和CRISP3的表达量极显著高于约克夏中的表达量（P<0.01），CRISPLD2、DEFB1和CCL11的表达量显著低于约克夏猪中的表达量（P<0.05）。

高海拔的DEGs富集于10个GO通路和4个KEGG通路。GO分析显著富集了免疫反应、中性粒细胞趋化、细胞外空间、细胞外区域、质膜外侧、血小板α颗粒、纤维蛋白原复合物、细胞外基质、丝氨酸型内切肽酶抑制活性和肝素结合等（FDR<0.01）（图6（a））。KEGG分析显著富集了补体和凝血级联反应、吞噬体、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、视黄醇代谢等（FDR<0.01）（图6（b））。筛选与低氧适应有关的通路，并引用FPKM值来展示各组中低氧适应相关基因的表达情况，如表9所示。在高海拔环境下藏猪中CRISPLD2、SCGB1A1的表达量极显著高于约克夏中的表达量（P<0.01），DEFB1和CCL11的表达量显著低于约克夏猪中的表达量（P<0.05）。

2.6　PPI网络的构建和中心基因的选择

将不同海拔下的藏猪和约克夏猪肺脏组织中的差异基因做Venn图（图7（a）），得到47个共同差异表达基因。将不同品种在高海拔和低海拔环境下肺脏组织中的差异基因做Venn图（图7（b）），得到92个共同差异表达基因。之后将各组间共同差异表达基因输入到Sus scrofa 的STRING数据库中，设置置信阈值为0.400。然后，使用Cytoscape v3.9.1对结果数据进行可视化，以构建PPI网络，之后根据Degree 值大小来挑选hub基因。在不同猪种差异基因的PPI网络中选择了7个hub基因（图7（c）），包括SERPINA1、FGB、ALB、FGA、AMBP、SERPINC1和FGG。在不同海拔下的差异基因中选择了7个hub基因（图7（d）），包括CCL27、CCL11、NPY、BDNF、CCR6、CCL2和CXCR3。

3　讨 论

在高原环境中，本土动物经过长期的进化，已经发展出独特的生理机制，以确保在低氧条件下其组织和细胞能够维持正常的代谢活动^［14-17］。研究发现，藏猪的肺组织展现出一些有利于氧气运输的组织学特征。例如，它们具有更发达的心脏组织和肺血管系统，这些组织学特征还有效促进氧气的运输，并且有助于增加肺泡数量^{［4， 18-19］}。同为高原动物的藏鸡相较于低地鸡来说也具有更大的肺脏比重、更多的肺泡数量等^［20］，以更好地适应低氧环境。此外为进一步探讨藏猪适应低氧环境的机制，本研究采用RNA-seq分析比较了在不同海拔条件下饲养的藏猪和约克夏猪的肺脏组织转录组数据。在不同猪种和不同海拔条件下分别进行转录组数据处理、GO和KEGG功能分析等。此外，利用Sus scrofa的STRING数据库构建了PPI网络，以识别每组中的关键基因。

对不同海拔下同一猪种中肺脏组织中的差异表达基因进行鉴定。不同海拔藏猪肺脏组织中差异表达基因富集于9个GO通路和6个KEGG通路（FDR<0.05），涵盖了各种生物学过程、细胞组分和分子功能。这些GO通路包括胶原纤维束组织、细胞外基质组织、细胞外空间、细胞外区域、细胞外基质、基底膜、胶原三聚体、细胞表面和细胞外基质结构成分。KEGG通路包括蛋白质消化和吸收、ECM-受体相互作用、阿米巴病、焦点粘附、PI3K-Akt信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。相关研究表明，这些通路在藏猪适应高海拔低氧环境中可能发挥关键作用^［21-22］，参与了细胞生物学功能和疾病发展过程。研究表明，随着海拔的变化，牦牛的肺、心脏和脾脏中ECM-受体相互作用、焦点粘附和PI3K-AKT通路的激活^［23］。这些通路的激活被认为是对低氧环境的调节机制。PI3K-Akt通路是适应低氧条件的典型途径，大量文献证明它通过激活AKT（蛋白激酶B）促进细胞存活并保护细胞免受氧化损伤的影响^［24-27］。

关于不同海拔下约克夏猪肺脏组织的差异表达基因，鉴定了12个GO通路和5个KEGG通路（FDR<0.05），涉及到血液凝血、纤溶、细胞外空间、胞膜外侧、细胞外区域、血小板α颗粒、纤维蛋白原复合物、顶端质膜、血浆膜的整合组分、乳糜微粒、丝氨酸型内切肽酶抑制活性和肝素结合。KEGG通路主要包括补体和凝血级联反应、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、代谢通路、视黄醇代谢和氨基酸生物合成。这些变化很可能是对高海拔环境的适应结果。补体和凝血级联反应在免疫应答和血液凝结中起着关键作用。研究表明，通过构建低氧大鼠模型，肝脏与凝血相关的基因表达显著上调，这表明低氧条件可能通过激活动物体内的凝血系统，帮助动物应对氧气供应不足的挑战^［28］。此外，氨基酸在多种生物过程中发挥重要作用，包括激素合成、抗氧化反应、免疫系统功能、神经递质合成、氮平衡和能量代谢^［29］。在低氧条件下，特定的氨基酸参与抗氧化反应，增加抗氧化剂（如谷胱甘肽）的合成，以抵消产生的活性氧化物质^［30］。这些反应是生物体在应激条件下的一种适应性反应，旨在保护细胞免受氧化损伤的影响。

通过各组基因表达情况，可以看出藏猪肺脏组织中TNC、COL1A2、COL4A5、COL1A1、COL4A4、COL6A6和COL4A2在低海拔环境下表现为显著性上调。其中COL1A1和COL1A2主要编码Ⅰ型胶原蛋白的亚单位，广泛存在于结缔组织、皮肤、骨骼和肺部等。Ⅰ型胶原蛋白在肺中的主要作用是提供结构支持和维持组织的完整性。研究表明，小鼠心肌细胞在缺氧后进行复氧处理之后，I型胶原蛋白的表达显著增强^［31］。COL4A4、COL4A5、COL4A2和COL6A6均参与编码Ⅵ型胶原蛋白。Ⅵ型胶原蛋白主要作用是维持肺泡的结构和功能。同时为肺泡基膜提供支撑，有助于保持肺组织的稳定性和弹性。全基因测序结果也揭示了胶原蛋白基因与海拔高度变化之间存在较高相关性^［32］。其表达的变化有助于血管生成和血管重塑^［33］、肺泡表面张力的调节^［34］和ECM重塑^［35］，从而优化肺结构以适应低氧环境。低海拔的牦牛通过上调胶原蛋白基因表达，增加胶原蛋白合成，从而有助于维持肺泡稳定性和隔膜灵活性。相反，随着海拔增加，牦牛肺组织中胶原蛋白基因的表达下降^［36］，这与本研究所得出的结果相似。胶原蛋白的减少可能是为了限制在高海拔环境中更丰富的弹性纤维功能，使哺乳动物能够适应缺氧和高海拔的恶劣环境。藏猪在低海拔环境下通过调节胶原蛋白相关基因的表达，增强了其肺部的结构支持能力，从而应对从低氧到复氧的环境差异变化。在约克夏猪中PAGAM2于高海拔环境中表现出明显的上调趋势。磷酸氨基酸鸟苷酸环化酶激活剂2（PAGAM2）通常在调节氨基酸代谢和参与能量生成方面发挥作用，能够帮助细胞适应高海拔的代谢需求^［37-38］。在低氧环境中，氨基酸的可用性可能减少，导致细胞代谢不平衡，可能促使细胞通过调节氨基酸代谢来适应氧气缺乏，增强生存能力。藏猪和约克夏猪肺脏组织在不同环境下的低氧适应相关基因表现出显著差异，这一现象反映了不同海拔下各猪种的肺脏组织在应对环境压力时发挥着不同的生物学机制。

同时，在不同猪种同一海拔条件下肺脏组织中的差异表达基因进行鉴定。在低海拔中，鉴定了8个GO通路和5个KEGG通路，其中挑选出细胞外基质组织、细胞表面受体信号通路、胶原纤维组织、细胞外基质、细胞外空间、细胞外区域、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、ECM-受体相互作用、IL-17信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等与低氧适应相关的通路。相较于高海拔环境来说，低海拔环境中通常具有较高的氧气浓度，生物体通常通过免疫修复、胶原蛋白合成和细胞外基质重塑等机制来调节对环境变化的适应。在高海拔中，鉴定了10个GO通路和4个KEGG通路。其中挑选出免疫反应、中性粒细胞趋化、细胞外基质、丝氨酸型内切肽酶抑制活性、补体和凝血级联反应、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用和视黄醇代谢等与低氧适应相关的通路。在高海拔地区，氧气浓度显著降低，高原地区生物通常通过免疫反应、代谢调节及细胞保护等多个方面来应对低氧环境的挑战。在高海拔低氧环境下，小鼠肠道组织结构及肠道菌群组成发生了显著改变，这些变化与免疫因子水平显著相关，反映了小鼠在低氧应激下肠道功能的适应性调整^［39］。丁元等^［40］研究发现，在不同海拔条件下的牦牛肾脏组织中与线粒体功能相关的基因表达发生变化，随着海拔升高，肾脏通过抑制线粒体融合或促进糖酵解途径，调整肾脏的代谢功能，以应对极端环境并维持其稳定性。通过收集进入高海拔3 d的人群外周血中的单核细胞，证实了高海拔暴露可能引发初期的炎症反应，但随着适应过程的进行，细胞免疫反应逐渐趋于抑制，出现适应性免疫抑制现象^［41］。

为进一步探索这些差异基因之间的相互关系，利用STRING数据库构建了差异基因的蛋白质相互作用网络，从而揭示其潜在的生物学功能和相互关联。在不同海拔下的藏猪和约克夏猪肺脏组织中的差异基因做Veen图分析，挑选出47个差异基因。结合STRING数据库绘制PPI网络，选择了 7个hub基因，包括SERPINA1、FGB、ALB、FGA、AMBP、SERPINC1和FGG。其中SERPINC1和SERPINA1都属于Serpin家族，二者都是急性期反应蛋白，在体内炎症反应或损伤时表达水平可能升高，但二者的作用机制并不相同。SERPINC1主要通过抑制凝血因子的活性，确保凝血过程不会过度，防止异常的血栓形成。与FGB、FGA和FGG共同参与血液凝固、纤维蛋白的生成或调节，在凝血过程中起着关键作用。王珍等^［42］通过构建了低氧下大鼠模型，发现低氧条件可能激活大鼠凝血系统，从而增加血栓形成的风险。SERPINA1基因编码的Alpha-1 Antitrypsin（AAT）是一种重要的抑制蛋白酶的蛋白质。它主要作用于肺部，抑制弹性蛋白酶（Elastase）等蛋白酶的活性，防止这些蛋白酶破坏肺部组织中的弹性纤维，在保护肺部免受过度炎症和破坏方面起着关键作用。在人类医学中，就有着利用蛋白酶体抑制剂来治疗肺纤维化的例子^［43］。ALB在肺部具有抗氧化和抗炎性质，参与调节肺部炎症和纤维化，因此是潜在的生物标志物。AMBP是一个前体蛋白，经蛋白水解后产生双胺酸和α-1-微球蛋白（A1M）。A1M是一种具有还原性、血红蛋白结合和自由基结合活性的抗氧化剂和组织清理蛋白。在人类医学领域中，研究发现A1M可能通过清除自由基、保护细胞膜和抑制炎症反应等，从而减轻由氧化应激引起的组织损伤，这使得A1M在治疗氧化应激导致的相关疾病中表现出广泛的临床应用价值^［44-46］。整体而言，在不同猪种对于高海拔适应过程中，这些基因在调节机体免疫、炎症反应和组织保护中起到了协同作用。之后在不同品种在高海拔和低海拔环境下肺脏组织中的差异基因做Veen分析，挑选出92个差异基因。并结合STRING数据库绘制了PPI网络，从中选择了7个hub基因，包括CCL27、CCL11、NPY、BDNF、CCR6、CCL2和CXCR3。其中CCL27、CCL11和CCL2都是属于趋化因子（Chemokines）家族，该家族能够通过与特定受体结合，调节免疫细胞迁移的信号分子，从而帮助机体更好地适应低氧环境。NPY和BDNF均在中枢神经系统中发挥重要作用，同时有研究表明，NPY和BDNF可能通过相互作用共同调节神经系统的功能，影响神经保护、抗炎反应及大脑的可塑性。关于BDNF及其与NPY相互作用的已被证明，其中BDNF过表达可显著增加NPY mRNA和蛋白水平^［47］。NPY通过作用于BDNF间接影响营养微环境，神经营养因子起桥梁作用，从而提供支持正常神经元活动的营养作用^［48-49］。综上所述，这些hub基因可能在猪对高海拔适应过程中发挥关键作用，对这些基因的研究有助于更深入地了解藏猪和其他适应高海拔环境动物的生物特征。

4　结 论

本研究对不同海拔下藏猪和约克夏猪的肺脏组织进行转录组测序，将得到的数据分为不同海拔间处理以及不同猪种间处理，对筛选出的差异基因通过功能富集、绘制调控网络、挑选中枢基因等方法进行了全面分析，同时分析不同处理下基因表达的差异性。最终在不同海拔间筛选出SERPINA1、FGB、ALB、FGA、AMBP、SERPINC1和FGG，共 7个hub基因。在不同猪种间筛选出CCL27、CCL11、NPY、BDNF、CCR6、CCL2和CXCR3，共7个hub基因。这些基因在低氧适应过程中发挥了不同的作用，本研究可为今后探究不同猪种对于不同海拔的适应能力提供参考。

参考文献

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基金资助

国家自然科学基金项目(32160773)

国家重点研发计划项目(2022YFD1600903)

农业生物育种重大项目(2023ZD0404404)

西藏农牧学院研究生创新计划资助项目(YJS2023-17)