稳定表达IRF2基因DF-1细胞株的建立及其对H9N2 AIV复制的影响

Establishment of a DF-1 cell line stably expressing the IRF2 gene and its effect on H9N2 AIV replication

摘要

为构建一种稳定表达干扰素调节因子2（Interferon regulatory factor 2，IRF2）的DF-1细胞株，本研究首先针对IRF2成功构建重组慢病毒，再用重组慢病毒感染DF-1细胞，通过嘌呤霉素及有限稀释法筛选获得IRF2过表达多克隆细胞株。对构建的细胞株进行活力检测、Real-time qPCR 以及Western blot等方法验证IRF2的体外表达效率，病毒增殖试验验证该细胞株对H9N2 AIV复制的影响，最后，通过双荧光素报告系统验证IRF2对干扰素刺激基因的调控作用。结果表明：1）细胞活性检测显示，稳定表达IRF2对细胞活性无显著影响（P>0.05）。2）Real-time qPCR以及Western blot证明IRF2的mRNA水平和蛋白水平在筛选的细胞株中表达相较于对照组细胞极显著增高（P<0.001）。3）Real-time qPCR（P<0.001）、Western blot（P<0.01）、TCID₅₀（P<0.01）的体外试验证明，过表达DF-1-IRF2细胞株具有促进H9N2 AIV增殖的作用。4）双荧光素报告系统结果表明，IRF2能够极显著抑制ISRE（P<0.01）和NF-κB（P<0.01）活性，显著抑制IRF7（P<0.05）的活性。综上，本研究成功构建能够稳定表达IRF2基因的DF-1-IRF2细胞株，其能够增强H9N2 AIV的复制水平，为进一步研究IRF2在H9N2 AIV复制机制中的作用提供基础。

Abstract

To establish a stable DF-1 cell line expressing Interferon regulatory factor 2 （IRF2）， this study first successfully constructed a recombinant lentivirus targeting IRF2. Subsequently， the recombinant lentivirus was used to infect DF-1 cells， and IRF2 overexpressing polyclonal cell lines were obtained through puromycin selection and limited dilution method. The constructed cell line was subjected to viability assays， Real-time quantitative PCR （qPCR）， and Western blot to verify the in vitro expression efficiency of IRF2. Viral proliferation assays were conducted to assess the impact of this cell line on H9N2 AIV replication， and finally， a dual luciferase reporter system was used to verify the regulatory effects of IRF2 on interferon-stimulated genes. The results indicated the following： 1） Cell viability assays showed that stable expression of IRF2 had no significant effect on cell activity （P>0.05）.2） Real-time qPCR and Western blot demonstrated that the mRNA and protein levels of IRF2 were significantly higher in the selected cell line compared to control cells （P<0.001）.3） Real-time qPCR （P<0.001）， Western blot （P<0.01）， and TCID₅₀ （P<0.01） in vitro assays confirmed that the overexpression of IRF2 in the DF-1-IRF2 cell line promoted the proliferation of H9N2 AIV.4） The dual luciferase reporter system results indicated that IRF2 could significantly inhibit the activities of ISRE （P<0.01）， NF-κB （P<0.01）， and IRF7 （P<0.05）. In summary， this study successfully constructed a DF-1-IRF2 cell line capable of stably expressing the IRF2 gene， which is able to enhance the replication level of H9N2 AIV， and provide a basis for the subsequent study of the role of IRF2 in the replication mechanism of H9N2 AIV.

Graphical abstract

关键词

H9N2 AIV / 慢病毒载体 / DF-1细胞 / IRF2

Key words

H9N2 AIV / lentivirus vector / DF-1 cell / IRF2

禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）属于单股负链分节段的RNA病毒。根据AIV表面血凝素（Haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）抗原特征，可以分为16个HA亚型和9个NA亚型^［1-2］。根据AIV的致病性，可以将禽流感分为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Low pathogenicity avian influenza，LPAI），H9N2亚型AIV虽为LPAIV，但在世界范围内传播甚广 ^［3］。自1994年首次报道以来，H9N2 AIV一直在我国流行。近几年来，H9N2 AIV在我国已成为主要禽流感病毒亚型之一^［4］。家禽感染H9N2 LPAIV后，增加了它们继发感染其他病原体的易感性，可造成较高的死亡率以及巨大的经济损失^［5］。此外，H9N2 AIV可跨物种传播感染哺乳动物，甚至可以感染人类，而且不需要中间宿主^［6-8］。H9N2亚型AIV 还可为感染人的H5N1、H5N6和H7N9等毒株提供内部基因 ^［9-11］，所以，H9N2 AIV的防控不但对养禽业至关重要，而且具有重要的公共卫生意义。

干扰素调节因子（Interferon regulatory factors，IRFs）是一类调控干扰素表达的转录因子家族^［12］。IRF家族是多个模式识别受体的下游转录因子，参与多种生物学过程，在免疫细胞发育、分化和凋亡中发挥着不同的作用^［13-15］，IRFs能够正向和负向调节病毒和细胞的基因表达，以应对多种细胞外信号 ^［16］。迄今，已经在哺乳动物中发现了9个IRF成员，它们分别起着不同的作用^［17-18］。研究发现，人源IRF2驱动干扰素介导的CD8 T细胞衰竭以限制抗肿瘤免疫^［19］；另有研究表明，鱼源IRF2在瞬时过表达时能够显著促进鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）的复制，并抑制抗病毒相关基因的表达^［20-21］。目前在家禽中尚未有关于IRF2的功能研究，对于鸡IRF2在H9N2 AIV复制中的调控作用也不清楚。

慢病毒表达系统能够将目的基因整合到宿主基因组中，从而实现在宿主细胞中的稳定表达，是一种准确高效的基因转移载体^［22-23］。本研究通过慢病毒构建稳定表达IRF2基因的DF-1细胞株，并初步揭示了IRF2促进H9N2 AIV复制的作用，为后续研究IRF2调控H9N2 AIV复制的机制提供了理论支撑和基础工具，同时也对基于DF-1细胞培养H9N2 AIV提供试验数据支持和借鉴。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　细胞、病毒与载体

H9N2 AIV、HEK-293T细胞、DF-1细胞、LMH细胞、荧光素酶报告质粒pGL3-ISRE、pGL3-NF-κB、pGL3-IRF7、内参质粒pRL-TK、真核表达质粒pCAGGS-HA-IRF2均由华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。慢病毒载体pLV-CMV-MCS-EF1-Puro、包装质粒psPAX2和pMD2.G为上海交通大学程玉强教授惠赠。DH5α感受态细胞为南京诺维赞公司产品。

1.1.2　主要试剂

质粒提取试剂盒、同源重组酶、荧光定量检测试剂盒、ECL发光试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自南京诺唯赞公司；DMEM细胞培养基购自美国Gibco公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；嘌呤霉素购自Biosharp公司；Nulen Plus Trans^TM转染试剂购自上海诺莱生物公司；慢病毒浓缩试剂盒、RIPA裂解液反转录试剂盒、HRP标记的羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物公司；AIV NP单抗购自Invitrogen公司；鼠源IRF2蛋白单抗购自Proteintech公司。

1.2　试验方法

1.2.1　引物的设计与合成

根据NCBI公布的基因数据设计引物。引物序列见表1。

1.2.2　 IRF2重组载体构建

使用BamH Ⅰ 限制性内切酶，在37 ℃条件下对载体pLV-CMV-MCS-EF1a-PuroR进行单酶切，通过电泳胶回收获得线性化载体。按照生产商说明书，将载体与目的基因按照相应比例混合后，于37 ℃共同孵育30 min，于-20 ℃保存。将重组产物转化至感受态细胞DH5α，随后涂布于氨苄抗性的固体LB平板并培养过夜，挑取单克隆菌落振荡培养，进行菌液测序，测序正确后扩繁并提取质粒pLV-CMV-IRF2-EF1a-PuroR，保存于-20 ℃冰箱用于后续试验。

1.2.3　重组慢病毒载体的构建与包装

将生长对数期的HEK293T细胞均匀接种在5 cm细胞培养皿，待细胞长至单层后，将重组质粒pLV-CMV-IRF2-EF1a-PuroR、psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞，同时设立转入空载体pLV-CMV-MCS-EF1a-PuroR为对照组细胞，孵育4~6 h后，更换新鲜培养基，转染后72 h收集慢病毒上清液，使用慢病毒浓缩试剂盒将其浓缩后放于-80 ℃以备后用。

1.2.4　慢病毒转导和细胞筛选

将生长良好的DF-1细胞接种至24孔细胞板，待生长密度达到90%时，将慢病毒与聚凝胺混合接种至DF-1细胞。培养24 h后换新鲜培养基继续培养至96 h。细胞稳定生长后更换含有5 µg/mL的嘌呤霉素生长液进行筛选，至对照组细胞全部死亡终止筛选。初步筛选得到阳性细胞后，用有限稀释法将筛选后的细胞悬液传代至96孔细胞培养板中，保证每孔只有0~1个细胞，用抗性筛选生长液再培养10~14 d，观察挑取生长状态良好的单细胞克隆接种至24孔板，待细胞孔长满后进行鉴定。

1.2.5　 IRF2基因稳定表达对DF-1细胞活性的影响

将对照组DF-1细胞与筛选细胞以每孔10⁴个细胞铺于96孔板中央，在细胞长至合适密度后，于0、6、12和24 h每孔加入10 µL CCK-8溶液，轻微振荡混匀，然后于培养箱中37 ℃孵育1~4 h，用酶标仪于450 nm处检测细胞孔OD值，记录数据。

1.2.6　 IRF2过表达细胞株的鉴定

1.2.6.1　qPCR检测IRF2的mRNA水平

收集对照组细胞和筛选得到的细胞，使用RNA提取试剂盒提取细胞RNA并反转录，将得到的cDNA作为模板进行qPCR检测，qPCR检测引物GADPH和IRF2的序列如表1所示。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s重复40个循环；最后60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s完成检测。

1.2.6.2　Western blot检测IRF2蛋白水平

将筛选细胞均匀传代至6孔板中，设置DF-1细胞作为对照组细胞，待细胞长满80%后，用添加了PMSF的RIPA裂解液冰上裂解细胞，加入5×上样缓冲液100 ℃处理后进行SDS-PAGE。将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，然后以IRF2鼠源单抗作一抗（1∶1 000稀释使用），HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗（1∶5 000稀释使用）于37 ℃各孵育1 h，最后使用ECL化学发光试剂显影成像。

1.2.6.3　IFA检测IRF2在细胞的表达情况

将筛选的细胞DF-1-IRF2均匀传代至24孔板，细胞长满后用预冷的多聚甲醛固定细胞30 min，用0.25% Triton破膜30 min，用5% BSA封闭细胞1 h，每次操作前用PBS洗涤细胞3次，用IRF2单抗作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗于37 ℃孵育细胞1 h，均匀覆盖DAPI显色液，避光染色5 min后，在Nikon荧光倒置显微镜下观察结果。

1.2.7　 IRF2稳定表达对H9N2 AIV增殖的影响

1.2.7.1　 IRF2稳定表达对H9N2亚型AIV NP mRNA表达的影响

将筛选得到的细胞株和转入空载体的对照组细胞分别接种至12孔板中，细胞密度达到80%后，接种MOI=0.1的H9N2亚型AIV，收集24和48 h的细胞，提取RNA并反转录为cDNA，通过qPCR检测H9N2 AIV的NP基因表达情况。H9N2 AIV的qPCR检测方法及反应条件同1.2.6.1，使用引物信息见表1。

1.2.7.2　 IRF2稳定表达对H9N2亚型AIV NP蛋白表达的影响

Western blot试验方法同1.2.6.2，以AIV NP蛋白为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，用ECL化学发光显色并观察结果。

1.2.7.3　 IRF2稳定表达对H9N2亚型AIV滴度的影响

将DF-1-IRF2细胞株和对照组细胞株接种至T25培养瓶中，将DMEM稀释的H9N2 AIV分别接入细胞，在CO₂培养箱中孵育1 h，更换2% FBS的DMEM培养液，逐日观察细胞病变（CPE）。待CPE达到90%时，于-80 ℃反复冻融3次，收集细胞液上清，将LMH细胞铺96孔细胞培养板，待细胞长至单层后，取病毒液稀释10^-1~10^-10 10个浓度梯度，分别接种到LMH细胞中，37 ℃培养3~5 d后观察并纪录CPE，通过Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，并比较两者的病毒滴度。

1.2.8　 IRF2过表达对宿主IFN反应的影响

1.2.8.1　 IRF2过表达对干扰素相关基因的影响

将DF-1细胞均匀铺于12孔板中，置于37 ℃培养箱中培养至细胞汇合度达到80%后，将pCAGGS-HA-IRF2重组质粒和pCAGGS-HA空载体分别转染到DF-1细胞中，pCAGGS-HA空载体作为对照，然后置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h后，以MOI=0.1的剂量接种H9N2 AIV病毒液，在接毒后24 h提取细胞RNA样品，反转录成cDNA后利用qPCR方法检测IFN-α、IFN-β、OASL、MDA5、MX1和IRF7基因相对表达量。

1.2.8.2　过表达IRF2对ISRE/NF-κB/IRF7启动子活性的影响

将DF-1细胞接种于12孔细胞培养板内，37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度长至70%~80%时，按照Nulen Plus Trans^TM转染试剂说明方法，将1 μg pCAGGS-IRF2重组质粒，0.1 μg相应的荧光素酶报告质粒以及0.02 μg内参质粒pRL-TK共转染细胞，并设置空载体对照。转染 24 h后，加入MOI=0.1的H9N2 AIV病毒液孵育24 h。参照诺唯赞公司双荧光素酶检测试剂盒说明书进行双荧光检测，结果取报告启动子-萤火虫荧光素酶信号值与内参启动子-海肾荧光素酶活性的比值。

1.2.9　数据分析

各试验平行重复3次，使用GraphPad Prism 8.0.2软件对各试验数据进行t-test统计学分析，双荧光素酶检测试验运用One-way ANOVA统计学分析。

2　结果与分析

2.1　重组慢病毒载体的构建

从DF-1细胞中扩增得到IRF2目的基因片段，其大小为1 047 bp，如图1（a）；测序结果表明克隆序列与已发表的鸡IRF2序列完全一致。将没有信号肽编码序列的扩增片段插入pLV-CMV-MCS-EF1a-PuroR载体中，质粒结构如图1（b）。

2.2　DF-1-IRF2细胞株的鉴定

2.2.1　qPCR鉴定IRF2基因在 mRNA水平上的稳定表达

收集对照组细胞和过表达IRF2细胞株，提取细胞总RNA反转录成cDNA，利用qPCR方法检测IRF2基因在DF-1对照、DF-1-IRF2细胞株中表达量的变化。如图2（a）所示，在DF-1-IRF2细胞中，IRF2基因的mRNA相对表达量极显著高于对照组细胞（P<0.001），表明慢病毒基因组整合至宿主细胞基因组上，可显著提高IRF2表达。

2.2.2　 IRF2基因稳定表达鉴定

收集对照组细胞和DF-1-IRF2细胞的蛋白样品，进行Western blot检测。如图2（b）的结果显示，与对照组细胞相比，DF-1-IRF2细胞中IRF2蛋白表达显著增加。

以IRF2单抗作为一抗，在倒置荧光显微镜下可以观察到DF-1-IRF2细胞的荧光信号与对照组细胞相比显著增多。图2（c）结果表明，在筛选得到的DF-1-IRF2细胞中，IRF2的表达量显著增多。

2.3　 IRF2稳定表达细胞株活性检测

使用CCK8试剂盒检测450 nm波长下的吸光度值。结果显示，DF-1-IRF2细胞与对照组细胞DF-1相比，450 nm波长下的吸光度值无显著差异，表明IRF2基因的稳定表达对DF-1细胞的增殖无显著影响（图3）。

2.4　 IRF2稳定表达对H9N2 AIV增殖的影响

2.4.1　 IRF2稳定表达对H9N2 NP基因mRNA表达的影响

用H9N2 AIV分别感染DF-1细胞和DF-1-IRF2多克隆细胞株。设置24和48 h 2组，由qPCR结果可知（图4（a）），与对照组相比，H9N2 AIV感染DF-1-IRF2细胞株病毒NP mRNA表达量显著升高（P<0.001），表明体外过表达IRF2可显著促进H9N2 AIV复制。

2.4.2　 IRF2稳定表达对H9N2 AIV NP蛋白表达的影响

通过western blot检测H9N2 AIV NP蛋白的表达量显著高于对照组（图4（b）），表明体外过表达IRF2能够显著促进H9N2 AIV NP蛋白的表达。

2.4.3　IFA检测H9N2 AIV NP蛋白的表达

通过IFA检测H9N2 AIV感染DF-1细胞和DF-1-IRF2细胞24 h后NP蛋白，在荧光显微镜下观察发现DF-1-IRF2细胞株与对照组相比荧光增加（图4（e）），表明体外过表达IRF2可促进H9N2 AIV复制。

2.4.4　 IRF2稳定表达对H9N2 AIV 滴度的影响

用H9N2 AIV分别感染DF-1细胞和DF-1-IRF2细胞株，从TCID₅₀结果可知（图4（d）），DF-1-IRF2细胞株H9N2病毒滴度显著高于对照组（P<0.01），这表明体外过表达IRF2可显著提高H9N2 AIV的滴度。

2.5　 IRF2过表达对宿主IFN反应的影响

2.5.1　 IRF2过表达对干扰素相关基因的影响

将IRF2转染DF-1细胞24 h后，感染H9N2 AIV 24 h后提取细胞总RNA反转录成cDNA，利用qPCR方法检测IFN-α、IFN-β、OASL、MDA5、MX1和IRF7基因相对表达量。结果表明，过表达IRF2显著抑制IFN-β、OASL、MDA5、MX1和IRF7基因表达（图5（a））。

2.5.2　过表达IRF2对ISRE/NF-κB/IRF7启动子活性的影响

将荧光素酶报告质粒pGL3-ISRE、pGL3-NF-κB、pGL3-IRF7、内参质粒pRL-TK分别与真核表达质粒pCAGGS-HA-IRF2和对照空载质粒共转染DF-1细胞。转染24 h后感染H9N2 AIV，24 h后收取细胞样品。结果表明，过表达IRF2可显著抑制ISRE（图5（b））、NF-κB（图5（c））和IRF7（图5（d））的启动子活性。

3　讨 论

H9N2 AIV感染鸡群会引起轻度呼吸道疾病，还会使鸡蛋产量急剧下降或继发混合感染而出现高死亡率，给我国养禽业带来了巨大的经济损失^［24］，由于H9N2 AIV在家禽中的流行和不断演变，有必要在生产实践中使用疫苗。然而，某些毒株的生长特性不足，因此需要额外的方法提高H9N2 AIV疫苗种毒的生产效率。各种细胞株已经被评估用于增殖流感病毒的能力，像MDCK和Vero这样的细胞株为多种AIV株的复制提供了便捷支持^［25］。然而，大多数细胞通常并不代表天然宿主细胞类型，并且需要添加外源性蛋白酶。在没有外源性蛋白酶的情况下，它们对H9N2 AIV易感性较低。为解决生产H9N2 AIV疫苗的过程中病毒滴度较低的情况，筛选一株适合H9N2 AIV增殖的细胞株将有利于节约疫苗的生产成本^［26］。

干扰素调节因子（IRFs）蛋白家族，能调节干扰素的转录和干扰素诱导的基因表达，它们是Toll样受体和IFN信号通路中的重要调节蛋白^{［17，27］}。迄今为止，脊椎动物鉴定出11个IRF家族成员，包括IRF1-11，其中IRF10为鱼类和鸟类中特有，而IRF11为硬骨鱼特有^［28］。研究表明，IRF2位于细胞核中，起到ISGF3介导的转录激活的转录衰减器的作用，IRF2的缺失会导致过量的I型IFN信号传导^{［18，29］}。有文献报道鱼类IRF2具有抑制IFN反应的作用。Huang等^［20］研究发现，IRF2负调控宿主IFN反应并促进SVCV复制；姜正正等^［21］研究发现，瞬时过表达OLIRF2能够显著促进SVCV的复制，并抑制抗病毒相关基因MX1、IFN和IRF3的表达。另外，IRF2的过表达能够增加西尼罗河病毒的产量^［30］。IRF2促进病毒的复制可能与其抑制干扰素反应相关。本研究着重探究稳定表达鸡源IRF2对H9N2 AIV病毒蛋白水平及滴度的影响。qPCR试验证实在DF-1-IRF2细胞株中，H9N2 AIV NP蛋白mRNA表达显著高于对照组，通过IFA和Western blot证实IRF2稳定表达可促进H9N2 AIV的NP蛋白表达，TCID₅₀试验表明DF-1-IRF2细胞株中子代病毒的滴度显著高于对照组，双荧光素报告系统表明IRF2能够显著抑制ISRE、NF-κB和IRF7的活性。以上结果说明，过表达IRF2抑制了干扰素反应，从而促进H9N2 AIV的复制。本研究构建的DF-1-IRF2细胞株相比于DF-1细胞有助于H9N2 AIV的复制，表明该细胞株可作为H9N2 AIV疫苗高效生产的潜在选择。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32473060)

广东省自然科学基金项目(2022A1515012480)

广东省自然科学基金项目(2024A1515013151)

高等学校学科创新引智计划项目(D20008)

特定高校学科建设专项(2023B10564003)