Pseudomonas koreensis发酵工艺优化及其对玉米促进生长和提高质量的效果研究

Fermentation process optimization of Pseudomonas koreensis and its effect on the growth promotion and quality improvement of corn

摘要

为探究韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis GS， 以下简称GS）的液体发酵滤液是否具有促进植物生长、提高植物抗逆性的作用，以GS菌株发酵液中活菌数和菌悬液OD₆₀₀值为试验的检测指标，采用单因素试验对GS菌株的接种量、培养温度、时间、转速和pH等5个方面进行筛选优化以确定最优发酵条件；对不同种类的碳源、氮源和无机盐进行单因素试验以确定最适培养基组分，并进行正交试验优化培养基配比和浓度，以筛选确定最优发酵培养基；通过测定玉米的生物学和品质指标以验证GS发酵滤液的田间应用效果。结果表明：1）优化后最适培养基配方的碳源为m（牛肉膏）∶m（糖蜜）=1∶1，5 g/L；氮源为酵母浸膏，5 g/L；无机盐为m（氯化钠）∶ m（硫酸镁）=1∶2，5 g/L。2）最适发酵条件为发酵时长为24 h，温度为30 ℃，pH为7，接种量为0.5%，转速为200 r/min。3）按该方案发酵生产的活菌数达到1.38×10¹¹ cfu/mL，OD₆₀₀值达到1.89，为优化前的8.36倍，且生产成本可大约节省30%~40%。4）经GS处理的玉米株高、茎叶鲜重、茎叶干重、根系鲜重、根系干重分别增加17.28%、35.13%、53.56%、40.65%、25.38%，分叶数量、根系活力和玉米棒长分别增加6.35%、37.82%和11.45%。5）籽粒中全磷、钙和淀粉含量分别增加30.19%、60.82%和31.67%，全氮、黄酮和粗蛋白含量分别增加9.93%、51.85%和10.01%。总之，优化后的培养基配方和发酵条件相对NB培养基和初始发酵条件，不仅可有效提高单位体积发酵液中GS菌株的菌体量，也可降低培养基成本，且GS发酵滤液具有促进植物生长、提高品质的良好田间应用效果。本研究可为GS的高效发酵和田间应用提供科学依据。

Abstract

This study aimed to clarify whether the liquid fermentation broth of Pseudomonas koreensis GS （Hereinafter referred to as GS）has the effects of promoting plant growth and improving plant resistance. The viable bacteria number in the fermentation broth of GS strain and the OD₆₀₀ value of the bacterial suspension were used as the test indexes， and a one-way test was used to screen and optimize the inoculum amount， incubation temperature， time， shaking speed and pH of GS strains in order to determine the optimal fermentation conditions. The one-way test was carried out on the different carbon rescources， nitrogen rescources and inorganic salts to determine the optimal medium components. An orthogonal test was carried out to optimize the ratio of the medium and its concentration to screen and determine the optimal fermentation medium. The biological and quality indicators of corn were determined to verify the field application of GS fermentation filtrate. The optimal ratio and concentration of the fermentation medium were confirmed by orthogonal tests. The biological and quality indexes of maize were measured to verify the field application of the GS fermentation filtrate. The results showed that： 1） The optimal carbon source for the optimized culture medium formula was carbon source m （beef paste）∶m （molasses）=1∶1， 5 g/L； yeast extract， nitrogen source 5 g/L； inorganic salt m （sodium chloride）∶m （magnesium sulfate） =1∶2， 5 g/L inorganic salt. 2） The optimal fermentation conditions were fermentation duration of 24 h， temperature 30 ℃， pH 7， inoculum quantity 0.5%， and shaking rate 200 r/min. 3） The viable bacterial count reached 1.38×10¹¹ cfu/mL and the OD₆₀₀ value reached 1.89， which was 8.36 times higher than that before optimization， and the cost of the production was saved by 30% to 40%. 4） The plant height， stem and leaf fresh weight， stem and leaf dry weight， root fresh weight and root dry weight were increased by 17.28%， 35.13%， 53.56%， 40.65% and 25.38%， respectively， and the leaves number， root activity and the corn length were increased by 6.35%， 37.82% and 11.45%， respectively. 5） The contents of total phosphorus， calcium and starch were increased by 30.19%， 60.82% and 31.67%， respectively， while the contents of total nitrogen， flavonoids and crude protein were increased by 9.93%， 51.85% and 10.01%， respectively. In summary， the optimized medium formulation and fermentation conditions relative to the NB medium and initial fermentation conditions can not only effectively increase the bacterial volume of GS strains per unit volume of fermentation broth， but also reduce the cost of the medium. Moreover， the GS fermentation filtrate has a good field application effect of promoting plant growth and improving the quality. This study can provide a scientific basis for the efficient fermentation and field application of GS.

Graphical abstract

关键词

Pseudomonas koreensis / 发酵工艺优化 / 玉米 / 提质促生 / 田间应用

Key words

Pseudomonas koreensis / fermentation process optimization / corn / improve quality and promote growth / field applications

微生物菌剂的使用可以提高农产品产量、改善农产品品质、提高化肥利用效率、改善根际环境和保护生态环境，在农业生产中具有重要的实践意义^［1-2］。韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis GS，以下简称GS）是一类极具应用前景的根际微生物，因其可高效定殖于植物根际，具有活化土壤中可利用性养分、改善土壤理化性质、保护植物免受病原菌侵害等特性，被视为极具促生和生防潜力的优势种群^［3-4］。前期研究发现，GS发酵滤液具有显著促进植物生长和提高植物逆境耐受性的功能^［5-7］。GS无菌发酵滤液通过提高番茄促生相关基因如 LeEXP2表达，来促进番茄生长^［8］，并通过生长素和多酚相关途径提高番茄胁迫耐受性^［9］。此外，GS发酵滤液通过对卟啉和叶绿素结合的抗氧化系统的调节，减轻干旱对光合作用的影响，从而提高果糖和甘露糖的积累，缓解番茄干旱胁迫^［6］。鉴于GS具有良好促进植物生长、提高植物亚低温耐受性的功能特征，亟需对其发酵条件进行优化。然而，截至目前，大多数研究仍局限在单独的发酵培养条件优化或单独的配方优化，且优化后发酵所得菌量偏低，效果不够理想。经培养条件优化发现优化后沼泽红假单胞菌菌量仅有5.6×10⁸ cfu/mL^［10］，经配方优化发现所得活菌数也仅有12.5×10⁸ cfu/mL^［11］。且传统的牛肉膏蛋白胨培养基中，成分价格较高且资源有限，而农副产品如糖蜜和工业级原料酵母浸膏则相对廉价且易于获取，可以作为微生物发酵的碳源和氮源^［12］。

菌株的生长需要适宜的培养条件和营养条件，培养条件包括发酵时长、温度、pH、转速和接种量等，营养条件包括碳源、氮源、无机盐和金属离子等^［13-14］，且营养物质的种类和比例，都会影响菌株的生长和发酵产物的产量^［15］。因此通过优化培养基组成和发酵条件，寻找菌体生长、基质消耗和产物生成三者的最佳发酵参数，以实现产品质量最好、产量最高、能耗最低、利润最高，将发酵控制在更高水平获得更佳的经济效益^［16］。常用的优化方法有单因素实验法、正交实验法、爬坡实验法和响应面法等^［17］。有效活菌数和菌悬液OD₆₀₀值是决定微生物菌剂品质和产量的关键指标^［18］，因此准确测量发酵液中活菌数和菌悬液OD₆₀₀值对于衡量发酵效率具有重要意义。

目前，已有大量关于微生物发酵工艺优化的研究报道。如：吴海霞等^［19］采用单因素和正交实验法对海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1-1进行发酵条件优化使芽孢产量显著提升；张红艳等^［20］对地衣芽孢杆菌MYS68进行培养基配方优化，显著提高了发酵液中活菌数和芽孢率；陈燕萍等^［21］对青枯雷尔氏菌FJAT-1458进行培养基优化，提高发酵效率的同时降低了生产成本；何明川等^［22］对烟草黑胫病病原菌烟草寄生疫霉 D5-8 进行发酵优化，使其对烟草黑胫病的保护防效和治疗防效显著提升。然而，目前对于韩国假单胞菌的发酵培养条件或配方优化研究尚少，且对优化后的发酵产物的田间应用效果研究还未见报道。因此，本研究拟以GS发酵滤液为研究对象，以发酵液中活菌数和菌悬液OD₆₀₀值为评价指标，采用单因素和正交实验方法对韩国假单胞菌的发酵条件和培养基进行筛选优化，使用农副产品糖蜜、工业级原料酵母浸膏和硫酸镁按比例替换牛肉膏蛋白胨液体培养基的碳源、氮源和无机盐组分，旨在降低发酵成本、提高发酵效率。玉米是我国重要的粮食作物，在农业生产中的地位日益重要。基于此，本研究选择玉米为材料，进一步将优化后的GS发酵滤液应用于田间试验，验证发酵产品的实际应用效果，以期为后续GS的产业化高效发酵和应用提供参考。

1　材料与方法

1.1　供试材料

供试菌株为韩国假单胞菌P. koreensis GS，NCBI登记号为PRJNA517377，在黑龙江省桃山天德人参有限公司人参基地分离纯化获得，由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室保藏。

牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB）用于细菌的液体发酵培养，该培养基成分如下：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水（DW） 1 000 mL，pH 7.2~7.5。牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）用于细菌GS的稀释涂布计数，成分如下：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g， DW 1 000 mL，琼脂20 g，pH 7.2~7.5。

供试玉米品种为‘中垦玉55号’，购于甘肃农垦良种有限责任公司。

1.2　试验设计

1.2.1　发酵工艺优化试验

1）发酵条件单因素优化。选用NB作为基础培养基，通过单因素试验对时长（12、18、24、30、36 h）、温度（26、28、30、32、34 ℃）、pH （5、6、7、8、9）、接种量（0.02%、0.10%、0.50%、2.5%、12.5%）、转速（140、160、180、200、220 r/min）共5个条件进行筛选优化。具体操作方法：试验选用容量为250 mL的玻璃材质三角瓶，每瓶装液100 mL。初始发酵条件为：时长24 h，温度28 ℃，pH 7.0，接种量0.1%，转速180 r/min密封培养，培养结束使用分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀值。每次试验中单因素条件之外的其他培养条件均与初始条件保持一致。

2）培养基组分单因素优化。采用优化后的发酵条件，通过单因素试验对碳源（柠檬酸，甘油，葡萄糖，糖蜜，牛肉膏）、氮源（尿素，氯化铵，硝酸钾，酵母浸膏，蛋白胨）、无机盐（氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，硫酸镁）3个培养基组分进行筛选优化。初始培养基配方为：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L。培养结束使用分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀值。每次试验中单因素组分之外的其他培养基组分均与初始配方保持一致。

3）培养基组分正交优化。通过L₉（3³）正交设计试验进一步对培养基组分进行优化，即选用廉价农副产品糖蜜按照一定比例替换牛肉膏来充当碳源，选用廉价工业级酵母浸膏按照一定比例替换蛋白胨来充当氮源，选用高效的硫酸镁按照一定比例替换氯化钠来充当无机盐，因素水平设置见表1。培养结束使用分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀值。

4）培养基浓度正交优化。通过L₉（3³）正交设计试验对优化后培养基中碳源、氮源和无机盐进行浓度优化，因素水平设置见表2。培养结束使用分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀值。

1.2.2　田间效果验证试验

试验于陕西省杨凌示范区陵东村（33°15′51′′ N，108°4′3′′ E）所设大棚内进行，土壤类型为塿土。试验采取随机区组设计，每个小区3 m×3 m，小区之间间隔30 cm，每个小区种植60株玉米，株距30 cm，行距50 cm。

试验设置2个处理，对照组Con为浇灌稀释100倍的液体培养基，处理组GS为浇灌稀释100倍的GS发酵滤液。播种时间为2023年7月26日，浇灌3次相应处理液，时间分别为2023年7月26日、8月11日和8月26日，每株浇液量500 mL，收获时间为2023年10月26日，整个生长周期90 d。

1.3　指标测定方法

1.3.1 发酵菌量测定

待优化试验全部结束后，再次采用优化后条件组合，统一测定初始培养基、组分优化培养基和浓度优化培养基发酵培养的菌悬液OD₆₀₀值及其对应的单菌落数。分光光度法：设置灭菌操作后的液体培养基为对照组，将处理组的发酵菌悬液放于可见分光光度计中，测定波长在600 nm的OD₆₀₀值。稀释涂布计数法：菌液依次10倍稀释，涂布于固体培养基，显微镜下计算单菌落数。

1.3.2 玉米生物学指标测定

抽雄期随机选择9株长势一致的玉米，采集植株样品，用于株高、茎粗、分叶数、地上部鲜重/干重、地下部鲜重/干重、根长和根系活力指标的测定。成熟期收获时随机选择9株长势一致的玉米果穗，立即测定玉米棒长、棒径和千颗籽粒重量。

1.3.3 玉米品质指标测定

籽粒中全氮含量采用H₂SO₄-H₂O₂消煮，AA3连续流动分析仪法测定，粗蛋白含量为全氮含量乘以系数6.25^［23］；全磷含量采用H₂SO₄-H₂O₂消煮，钼锑抗比色法测定^［24］；全钾含量采用H₂SO₄-H₂O₂消煮，火焰光度法测定^［25］；全钙、铁、锌含量均采用HNO₃-HClO₄消煮，原子吸收分光光度法测定^［26］；黄酮、总酚含量采用紫外分光光度法测定^［27］；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝紫外分光光度法测定^［28］；可溶性糖、淀粉含量采用蒽酮法测定^［29］。

1.4　数据分析方法

采用SPSS 26进行方差分析和多重比较，使用最小显著性差异法（LSD）和独立样本T检验进行差异显著性分析，认定P<0.05时为差异显著。使用Origin 2021作图。

2　结果与分析

2.1　 P. koreensis GS发酵条件及培养基成分优化

2.1.1　发酵条件的单因素优化

将发酵条件中的时长、温度和培养基pH分别进行单因素试验，各处理中菌悬液的OD₆₀₀值检测结果见图1。可见：在发酵时长24 h和温度30 ℃时OD₆₀₀值达到最大值，且均显著高于其他处理。在pH为7时OD₆₀₀值达到最大值，且发现在pH为5的酸性条件下菌株无法生长。同时，将发酵条件中的接种量和转速分别进行单因素试验，各处理中菌悬液的OD₆₀₀值检测结果见图2。可见：在接种量0.5%和转速200 r/min时OD₆₀₀值达到最大值。

2.1.2　培养基组分的单因素优化

将培养基组分中的碳源、氮源和无机盐分别进行单因素试验，然后，培养结束后使用分光光度计，测定菌悬液的OD₆₀₀值检测结果见图3。可见：以牛肉膏为碳源、酵母浸膏为氮源和硫酸镁充当无机盐时OD₆₀₀值分别为1.52，1.83和1.56，均达到最大值，且均显著高于其他处理；而糖蜜为碳源、蛋白胨为氮源和氯化钠为无机盐时，效果次之。因此，本研究选用糖蜜、酵母浸膏和硫酸镁，并将按照一定比例替换传统配方中的碳源、氮源和无机盐，探究最适培养液配方。

初始条件和最优发酵条件下分别采用稀释涂布法测得GS菌发酵液的活菌数结果见图4。可见：初始条件下测得GS菌发酵液的活菌数为1.65×10¹⁰ CFU/mL，而在最优发酵条件组合下测得其产生的活菌数可达2.99×10¹⁰ CFU/mL，为初始条件下的1.81倍。

2.1.3　培养基组分和浓度的正交优化

将培养基组分采用正交设计试验进行优化，培养结束后使用分光光度计，测定菌悬液的OD₆₀₀值检测结果见下表。由表3可见：碳源配比、氮源配比和无机盐配比3个因素对GS菌株生长的影响顺序为C>A>B，最佳培养基组分组合为A₁B₃C₂，即m（牛肉膏）∶m（糖蜜）=1∶1、m（蛋白胨）∶ m（酵母浸糖）=0∶1、m（氯化钠）∶m（硫酸镁）=1∶2。使用该最优配比组合发酵OD₆₀₀值达1.76，采用稀释涂布法测量其产生的活菌数可达7.52×10¹⁰ CFU/mL，为初始培养基发酵产生活菌数的2.52倍。由表4可见：碳源浓度、氮源浓度和无机盐浓度3个因素对GS菌株生长的影响顺序为A>B>C，最佳培养基浓度组合为A₃B₁C₂，即碳源5 g/L、氮源5 g/L、无机盐5 g/L。使用该最优浓度组合发酵OD₆₀₀值达1.89，采用稀释涂布法测量其产生的活菌数达1.38×10¹¹ CFU/mL，为浓度优化前发酵产生活菌数的1.84倍，为初始条件初始培养基发酵产生活菌数的8.36倍。

2.2　优化后的P. koreensis GS发酵滤液提质促生效果的大田验证

2.2.1　对玉米生物学指标的作用效果

由图5可见：与Con组相比，GS处理组玉米的根长、株高和茎粗分别增加31.75%、17.28%和32.64%。由图6可见：与Con组相比，GS处理组玉米的茎叶干重、茎叶鲜重、根系干重和根系鲜重分别增加32.64%、35.13%、40.65%和25.38%。由图7可见，玉米的分叶数量、根系活力和玉米棒长分别增加6.35%、37.82%和11.45%。因此，GS处理可以有效促进玉米的生长和生物量的积累。

2.2.2　对玉米品质指标的作用效果

由表5可见：与Con组相比，GS处理组玉米千颗籽粒中全磷、钙和淀粉含量分别增加30.19%、60.82%和31.67%，全氮、黄酮和粗蛋白含量分别增加9.93%、51.85%和10.01%，全钾、铁、锌、总酚、可溶性糖和可溶性蛋白含量分别增加17.05%、7.56%、11.66%、3.33%、13.17%和6.56%。由此可得，GS处理可以有效促进玉米籽粒中营养物质的积累。

3　讨 论

微生物菌剂发酵过程中，微生物的生长情况与发酵条件和培养基配方密切相关。当培养基组分恰当、比例及浓度合适、发酵条件适宜时，更有利于菌株生长繁殖^［30］。因此，进行发酵条件和培养基配方优化对提高微生物菌剂的发酵效率、提高菌株活性有重要意义。本研究以节约成本、提高效率为出发点，使用农副产品糖蜜、工业级酵母浸膏和硫酸镁按照一定比例替换传统培养基中的碳源、氮源和无机盐，通过多次单因素和正交设计试验对GS的发酵条件和培养基配方进行优化，最后确定了经济高效的发酵方案，为产业化生产提供了理论和技术支撑。

本研究发现，与初始发酵条件相比，在适当高的温度、接种量和转速条件下GS的生长效果更好，发酵效率更高。GS的最适发酵温度为30 ℃，最适转速为200 r/min，分析原因可能为GS是一类好氧细菌，转速适当加快可以增加摇瓶中的氧气含量，加之温度的适当升高，更利于GS的呼吸代谢^［31］，加快菌株的生理代谢过程，从而更利于其生长繁殖。最适接种量为0.5%，分析原因可能为适当高的接种量会使发酵前培养液中的菌株基数更大，更利于发酵过程中菌株扩繁速度。而最适发酵时长相较于优化前没有变动，仍然是24 h，分析原因为过短的时间菌株仍然处在生长繁殖阶段，在第24 h菌量达到峰值。超过24 h菌量又随时间的延长逐渐减少，推测其原因，可能是由于GS生长到一定阶段后会进行自溶，导致其逐渐衰退，菌量逐渐减少^［32］。

经验证，与初始培养基配方相比，加入一定比例糖蜜、酵母浸膏和硫酸镁分别充当碳源、氮源和无机盐，GS的生长繁殖效果更好。推测其原因，可能是由于牛肉膏和蛋白胨纯度较高，包含养分种类较为单一，而农副产品糖蜜和工业级酵母浸膏未经高度提纯处理，其中含有的养分种类更加丰富，从而更利于GS获取营养^［33］。酵母浸膏除蛋白质含量较高外，还可能含有较多的氨基酸、多肽及某些生长因子，能促进GS菌株的生长和代谢^［34］。硫酸镁中镁离子可作为微生物生长的重要养分，参与碳水化合物的新陈代谢及核酸的合成等^［35］。且在加入镁离子的培养基中，菌体的生长量和发酵液的絮凝活性会处于较高水平^［36］，因此发酵效率更高。因此，使用农副产品糖蜜、工业级酵母浸膏和硫酸镁按比例充当培养基组分在降低成本的同时，提高了菌剂的发酵效率。

已有研究表明，采用单因素试验和正交试验对发酵条件和培养基配方进行优化，可以有效提高铜绿假单胞菌ZM-1^［37］、沼泽红假单胞菌^［38］、施氏假单胞菌NRCB010^［39］、贝莱斯芽孢杆菌SH-1471^［40］、枯草芽孢杆菌HMQ20YJ04^［41］和短小芽胞杆菌Y26^［42］等菌剂的液体发酵效率。本研究中，使用最佳GS液体发酵方案可显著提高发酵所获菌量，为优化前的8.36倍，这与已有研究结果一致。但是，本研究仍存在些许不足，如研究仅局限于实验室进行了细菌GS的发酵工艺优化，后续还需要采用优化后的发酵方案进行小试、中试放大试验及工艺优化，进一步提高发酵效率，实现产业化生产。

在GS液体发酵工艺优化基础之上，通过田间玉米试验验证优化后GS发酵滤液的实际应用效果，对后续GS发酵产品的田间应用、促进种植业发展具有重要意义。本研究发现，优化后的GS发酵滤液具有显著促进玉米生长且提高品质的效果。分析原因可能是发酵滤液中含有丰富的GS次级代谢产物，如氨基酸、有机酸、杂环化合物、辅酶和维生素、吲哚及其衍生物等化合物和生长素、细胞分裂素、乙烯类、赤霉素等植物激素^［6］，这些物质均能促进玉米的生长。其中根系的良好发育会加速植株获取养分和水分，进而提高玉米的地上、地下部分生物量和果实中的营养物质含量，如全氮、全磷、钙、黄酮、粗蛋白、淀粉和可溶性物质等，这些物质与果实营养价值和口感风味有直接关系^［43］，因此GS发酵滤液可以显著提升籽粒品质。籽粒品质是衡量肥效的重要指标^［44］，因此可得GS发酵滤液具有很大的应用前景，具有可代替部分化肥的潜力，从而提高作物的生产效率和品质。

4　结 论

本研究以GS发酵滤液为研究对象，探究了P. koreensis GS液体发酵工艺优化后的最佳发酵方案，主要结论如下：1）最佳培养基配方为：碳源使用m（牛肉膏）∶m（糖蜜）=1∶1，5 g/L；氮源使用酵母浸膏，5 g/L；无机盐使用m（氯化钠）∶m（硫酸镁）=1∶2，5 g/L。2）最佳发酵条件为时长24 h，温度30 ℃，pH 7，接种量0.5%，转速200 r/min。3）使用该发酵方案所获的活菌数为优化前的8.36倍，生产成本可节省约30%~40%。且使用优化后的P. koreensis GS发酵滤液可以显著促进田间玉米茎叶生长、根系发育和植株生物量积累，增加籽粒中全氮、全磷、钙、黄酮、粗蛋白和淀粉等营养物质的积累，提升产量和品质。

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基金资助

鄂尔多斯市科技重大专项(2022EEDSKJZDZX019)

咸阳市“科学家+工程师”队伍建设项目(L2024-CXNL-KJRCTD-DWJS-0005)

陕西省重点研发计划(S2024-YF-ZDCXL-ZDLNY-0162)

陕西省重点研发计划(S2024-YF-ZDXM-NY-0223)