鸡肌肉发育相关miR-133c-3p靶基因筛选与鉴定

Screening and identification of miR-133c-3p target genes related to chicken muscle development

摘要

旨在研究鸡不同组织及骨骼肌卫星细胞中miR-133c-3p的表达情况，并利用生物信息学分析筛选其在胸肌中影响肌肉生长发育的关键靶基因。本研究利用在线网站预测鸡miR-133c-3p靶基因，进行GO和KEGG富集分析并构建蛋白-蛋白互作网络；利用在线公共数据库，分析胸肌相对于其他组织的miR-133c-3p表达量及筛选潜在靶基因，并通过双荧光素酶报告基因试验进行靶标验证。结果表明：1）预测获得103个靶基因；功能富集分析显示靶基因参与多种高分子化合物的合成与转运过程；并显著富集到肌动蛋白细胞骨架调控、mTOR等多条肌肉生长发育相关信号通路。2）PPI网络共筛选到5个Hub基因。3）miR-133c-3p仅在胸肌和心脏中表达，在胸肌中的表达量极显著高于心脏（P<0.01），且在卫星细胞增殖分化期间其表达水平呈先下降后上升的规律。4）共筛选到SGK1、MYH9、KLF7和NFAT5 4个靶基因。5）双荧光素酶报告基因检测发现miR-133c-3p与NFAT5存在靶标关系。综上，鸡miR-133c-3p在胸肌中可通过靶向NFAT5 间接调控肌肉生长发育。本研究为解析鸡miR-133c-3p的功能及其分子机制提供了参考和依据。

Abstract

The aim is to investigate the expression of miR-133c-3p in different tissues and satellite cells of chickens， and to screen key target genes affecting muscle growth and development in pectoralis through bioinformatics analysis. In this study， an online website to predict chicken miR-133c-3p target genes was used， GO and KEGG enrichment analysis were performed and protein-protein interactions networks was constructed. Using an online public database， the expression of miR-133c-3p in pectoral muscle relative to other tissues was constructed and potential target genes were screened， and target validation by a dual luciferase reporter gene assay was performed. The results showed that： 1） 103 target genes were predicted； Functional enrichment analysis shows that target genes are involved in the synthesis and transport of various polymer compounds； And significantly enriched in multiple signaling pathways related to muscle growth and development， such as actin cytoskeleton regulation， mTOR， etc. 2） Five Hub genes were identified through PPI network screening. 3） MiR-133c-3p is only expressed in pectoralis and heart， and its expression decreases during satellite cell proliferation and increases during differentiation（P<0.01）. 4） Four target genes， SGK1， MYH9， KLF7 and NFAT5， were identified through screening. 5） Dual luciferase reporter gene detection revealed a target relationship between miR-133c-3p and NFAT5. In summary， chicken miR-133c-3p can indirectly regulate muscle growth and development by targeting NFAT5 in the pectoral muscle. This study provides a reference and basis for analyzing the function and molecular mechanism of miR-133c-3p in chickens.

Graphical abstract

关键词

鸡 / miR-133c-3p / 生物信息学 / 基因表达量 / 肌肉生长发育 / 靶标验证

Key words

chicken / miR-133c-3p / bioinformatics / gene expression level / muscle growth and development / target validation

骨骼肌是鸡肉的主要组成部分，在肉鸡养殖生产中，骨骼肌占肉鸡体重的40%以上，其生长发育与鸡的产肉量密切相关^［1］。肌肉的生长速率和肌肉率是非常重要的生长性状兼经济性状，也是育种科研旨在提高的指标之一。miRNAs在调控基因表达中扮演着关键角色，尤其是在肌肉生长发育过程中，miR-133家族成员在多种物种中被证实与肌肉发育密切相关^［2］。miR-133家族是众多肌源性miRNA家族中的一员，包括miR-133a、 miR-133b以及新发现的miR-133c 3个成员，它们在骨骼肌和心肌中特异性表达或高度富集，在成肌细胞增殖、凋亡、分化，肌肉损伤修复和肌肉再生等生物学过程中发挥重要作用，但其具体功能和调控机制各有不同^［1-2］。miR-133a可靶向包括Dnm2、Pfn2和Calm1在内的多个肌肉发育相关基因参与骨骼肌生长代谢过程，敲除miR-133a的小鼠表现出中央核肌病、线粒体功能障碍和肌纤维形态受损^［3］。研究证实，C2C12细胞中过表达miR-133a能显著增强肌管的形成^［4］。miR-133b可靶向RUNX2、TRPS1抑制成骨细胞和软骨细胞的分化来介导间充质谱系分化，还可靶向Myosin基因家族成员，调控肌肉生长发育^［1］；肌肉损伤前注射miR-133b，可以增强成肌分化标志蛋白Myog、 Myod1和Pax7的表达，促进肌肉再生^［5］。miR-133c是近年来新发现的miR-133家族成员，包括miR-133c-5p和miR-133c-3p。目前的研究主要集中在人和猪和梅花鹿上。在人上，miR-133c/MAPK1轴可通过调控成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）的增殖和迁移影响类风湿关节炎^［6］；在猪上，猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染的细胞模型中，miR-133c-3p通过靶向BCL2L2基因参与调控细胞凋亡^［7］。在近期关于梅花鹿的一项研究中发现，在青春期后梅花鹿腿肌中的miR-133c-3p表达量显著上调，并伴随着其潜在靶基因的表达水平的下降，这说明miR-133c-3p和miR-133家族其他成员一样，均在肌肉发育方面发挥重要作用^［8］。miR-133c-3p作为miR-133家族的一员，在前期对鸡的研究中，通过RNA-seq发现miR-133c-3p在快大型肉鸡的骨骼肌中的表达量远高于慢速型肉鸡^［9］，进一步说明它参与调控鸡的肌肉生长发育，但是在家禽（鸡）各组织中的表达规律、具体功能和分子调控机制尚不清楚。因此，本研究利用生物信息学分析，预测鸡miR-133c-3p的靶基因进行GO、KEGG和PPI分析，并结合公共数据库中的RNA-seq数据对miR-133c-3p的组织表达谱进行表征，筛选出它在胸肌中的关键靶基因并利用双荧光素酶报告基因试验进行靶标验证，以期对miR-133c-3p在鸡上的功能及分子调控机制进行解析。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　细胞培养

参照Bai等^［10］的方法利用差速贴壁法从3日龄的AA肉鸡胸肌中分离鸡卫星细胞（SMSCs），先使用生长培养基（DMEM+10%胎牛血清+0.2%青霉素/链霉素）培养细胞，当细胞生长密度达到70%~80%时，改用分化培养基（DMEM+2%马血清）诱导分化。分别于增殖24、 48和72 h、分化24、和48 h这 5个时间点收集细胞样品，进行后续qPCR检测。

1.1.2　主要试剂

PrimeScript™ RT reagent Kit、miRNA First Strand cDNA Synthesis Tailing Reaction Kit购自Takara公司；QuantiNovaTM SYBR^® Green PCR试剂盒、DNase/RNase-free去离子水和LipoPlus™ Reagent购自Sigma-Aldrich公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、TRIzol™ Plus RNA 纯化试剂盒、胎牛血清FBS、马血清、DMEM高糖细胞培养基和0.2%青霉素/链霉素购自赛默飞世尔科技公司。

qPCR引物、miR-133c-3p mimic、mimic NC、NFAT5-3'UTR野生型双荧光素酶报告基因载体（pGL-NFAT5-Wt）和突变型载体（pGL-NFAT5-Mut）均由生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.1.3　数据材料

利用miBase（https：//mirbase.org/）下载鸡（Gallus gallus）、斑马鱼（Danio rerio）、锦龟（Chrysemys picta）、原鸽（Columba livia）、猕猴（Macaca mulatta）、缅甸蟒（Python bivittatus）、似野结鱼（Tor tambroides）、非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）、家犬（Canis familiaris）、鸭嘴兽（Ornithorhynchus anatinus）、小鼠（Mus musculus）、猩猩（Pongo pygmaeus）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和牛（Bos taurus）等14个物种的miR-133c-3p成熟体序列。其GenBank号和序列信息见表1。

在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载数据包GSE124418^［11］和GSE93855^［12］，分别获取清远麻鸡在胸肌、心脏、肾脏、肝脏、肺脏和脾脏6个组织中gga-miR-133c-3p测序读数（Counts）以及转录组Counts。

1.2　方法

1.2.1　miR-133c-3p的物种保守性分析

利用MEGA 7.0 软件的Alignment程序对已获取14个物种的miR-133c-3p进行不同物种间的序列对比。

1.2.2　gga-miR-133c-3p靶基因预测及功能分析

利用miRDB（https：//mirdb.org/index.html）和Targetscan（https：//www.targetscan.org/vert_80/）预测gga-miR-133c-3p的靶基因，对结果取交集并绘制Venn图。利用omicstudio平台（https：//www.omicstudio.cn/home）的clusterProfiler（3.8.1）软件包对靶基因进行GO和KEGG富集分析设定P<0.05为显著富集，P<0.01为极显著富集；利用在线数据库STRING（http：//string-db.org/），分析gga-miR-133c-3p靶基因编码蛋白的相互作用关系，将STRING评分>0.75的互作蛋白对导入cytoscape_v3.9.0软件，并利用Cytoscape中的CytoHubba应用程序，通过4种分析算法（MCC、DMNC、MNC、Degree）计算网络中的hub基因，绘制其PPI互作网络图。

1.2.3　gga-miR-133c-3p的组织表达分析

从GSE124418数据集中导出清远麻鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌中的miRNA高通量测序数据。挑选并整理gga-miR-133c-3p在这6个组织中的测序读数（count），并将其进行TPM（Transcripts per million）归一化处理，所用公式如下：

TPM=T/N×10⁶ （1）

式中：T为miRNA count读数；N为样本总miRNA count读数。

最后将TPM表达数据进行单因素方差分析，导入Graphpad prim 9.0软件进行表达量柱状图的绘制。

1.2.4　gga-miR-133c-3p关键靶基因的筛选及表达

从GSE93855数据集（GSE93855-upload-chicken.txt）中导出清远麻鸡各组织中的转录组测序读数，采用FPKM值对基因表达水平进行定量。利用R包（Limma）进行转录组差异表达分析，|log₂（Fold change）|≥1且P<0.05为标准，筛选胸肌相对于心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏表达下调的基因，并取交集，得到胸肌相对各组织均下调表达的基因集。将该基因集与gga-miR-133c-3p的靶基因集再次取交集，初步筛选得到gga-miR-133c-3p在胸肌中的关键靶基因，结果以韦恩图（Venn）的形式呈现。利用微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）的聚类热图模块对靶基因的表达值进行热图的绘制；同时将其在各组织中的表达值数据导入Graphpad Prim 9.0，进行gga-miR-133c-3p关键靶基因的组织表达谱绘制。

1.2.5　实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

采用TRIzol™ Plus RNA 纯化试剂盒提取卫星细胞的总RNA，按照反转录试剂盒操作步骤合成cDNA，通过实时荧光定量PCR方法检测基因相对表达量。分别以U6和β-actin为内参，每个样品设 3个重复，采用2^-ΔΔCt法计算gga-miR-133c-3p及其靶基因的相对表达量，引物信息见表2。扩增体系（总体积为10 μL）：上下游引物各0.5 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL；扩增程序：95 ℃预变性3 min； 95 ℃变性20 s， 退火温度退火20 s， 72 ℃延伸20 s， 共39个循环。

1.2.6　双荧光素酶报告基因检测

由生工生物工程（上海）股份有限公司构建野生型（pGL-NFAT5-Wt）和突变型载体（pGL-NFAT5-Mut）。将293T细胞系接种在48孔板，用DMEM+10%胎牛血清培养，当细胞密度达到约70%~80%时，用miR-133c-3p mimics（5'-UUGGUCCCCUUCAACCAGCUGU-3'）或NC（5'-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3'）和pGL-NFAT5-Wt或pGL-NFAT5-Mut质粒共转染，每次处理3个重复。转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书测定荧光素酶活性。

1.3　数据分析

gga-miR-133c-3p和靶基因的表达量数据及双荧光素酶活性值均导入Excel进行整理，结果以平均值±标准差表示。使用Graphpad Prim 9.0进行独立样本t检验或单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著，并绘制柱状图或折线图。

2　结果与分析

2.1　miR-133c-3p在鸡基因组上的定位与结构

gga-miR-133c-3p位于鸡23号染色体上，位于IFI27L2基因内；前体序列gga-mir-133c（4704445—4704523）全长79 bp，其5'UTR和3'UTR分别加工生产2个成熟的miRNA，分别为gga-miR-133c-5p（4704457—4704478）和gga-miR-133c-3p（4704493—4704514），并构成发夹结构（图1）。

2.2　miR-133c-3p保守性分析

对14个物种的miR-133c-3p序列进行多序列比对分析（图2）。除牛（bta-miR-133c-3p）以外的其他13个物种的miR-133c-3p序列保守性较高，仅有个别碱基发生突变，且种子区序列（UGGUCCC）完全相同。而牛的序列与其他物种保守性较差，且种子区序列（UGGUUCC）发生C<U突变。

2.3　gga-miR-133c-3p靶基因预测

由图3可知，利用miRDB和TargetScan分别预测出351和184个gga-miR-133c-3p的靶基因；作出韦恩图取这2个数据库预测结果的交集降低其假阳性，共得到103个靶基因。

2.4　gga-miR-133c-3p靶基因功能富集及PPI网络构建

GO富集结果如图4所示。在BP中，靶基因主要富集于mRNA剪切、水解酶活性负调控、细胞成分形态发生、胚胎发育、分子功能负调控、骨骼系统发育等条目；在CC中，靶基因主要与内质网系统、高尔基体、囊泡等细胞器膜的形成有关；对于MF，靶基因主要具有与肌球蛋白结合、DNA结合转录因子活性和磷酸转移酶等多种酶活性激活等分子功能。

对gga-miR-133c-3p的靶基因进行KEGG通路富集分析，结果如图5所示。靶基因主要参与自噬、磷酸酰肌醇信号系统、赖氨酸退化、肌动蛋白细胞骨架调控、细胞吞吐、粘附连接、mTOR信号通路、FoxO、上皮细胞连接、p53等信号通路。

靶基因PPI网络见图6，该网络图包括5个Hub基因，分别为PAPSS1、CTBP2、GDI1，RBMXL1和SYT1，并且MYH9和SGK1也在这一网络中。

2.5　gga-miR-133c-3p在鸡各组织中的表达

在GEO数据库中下载GSE124418数据包，并从中整理清远麻鸡miR-133c-3p在各组织中的Row count值，并进行TPM归一化处理，进而分析得到miR-133c-3p的组织表达谱，结果如图7所示，miR-133c-3p在肝脏、肺脏、脾脏、肾脏中未检测到表达，仅在胸肌和心脏中表达，且在胸肌中的表达量极显著高于心脏（P<0.01）。

2.6　胸肌相对各组织的差异下调基因及关键靶基因的筛选

如图8（a）所示，胸肌相对于肺脏、肝脏、肾脏、脾脏和心脏的下调基因数目分别为4 725、1 727、 3 624、5 055和1 528，胸肌相对各组织下调的公共基因为146个。将此所得公共基因集再次与gga-miR-133c-3p的靶基因取交集，得到4个关键靶基因，分别为MYH9、NFAT5、KLF7和SGK1（图8（b））。

2.7　关键靶基因的聚类热图以及组织表达谱

如图9（a）所示，gga-miR-133c-3p的4个关键靶基因在各组织中不同样本间重复性好，胸肌与各组织差异显著（P<0.05）；聚类显示，SGK1和KLF7首先聚成一束，其次分别与NFAT5、MYH9依次聚类成束。关键靶基因在各组织中的表达谱如图9（b）所示，5个基因在脾脏、肌肉、肺脏、肝脏、心脏、肾脏都有表达，且均在肾脏中表达量最高，胸肌中表达量最低。

2.8　靶基因鉴定

qPCR结果显示，miR-133c-3p在鸡卫星细胞增殖期（GM1-GM3）表达量下降，在分化期（DM1-DM2）表达水平上升；候选靶基因KLF7、SGK1表达与miR-133c-3p表达不相关；MYH9与miR-133c-3p的表达规律相同；而NFAT5在细胞增殖分化过程中表达量先逐渐上升后逐渐下降，与miR-133c-3p的表达呈负相关规律（图10）。因此，确定NFAT5作为miR-133c-3p的靶基因并进行靶标验证。

2.9　miR-133c-3p与NFAT5靶标关系验证

miR-133c-3p与NFAT5 3'-UTR结合的靶序列为CCCUGGU，构建NFAT5 3'-UTR的野生型双荧光素酶报告基因载体（NFAT5-3'UTR-Wt）和突变型载体（NFAT5-3'UTR-Mut）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-133c-3p与NFAT5 3'-UTR的野生型双荧光素酶报告基因载体的共转染极显著降低了酶活性（P<0.01），证实NFAT5与miR-133c-3p存在靶标关系（图11）。

3　讨 论

骨骼肌的生长发育受众多基因表达的调控，本研究从miRNA角度进行探索。miR-133家族是众多肌源性miRNA的一员，通过影响肌肉细胞增殖分化、肌肉损伤修复、肌肉再生、线粒体稳态等生物学过程调控肌肉生长和发育^［1-3］。在人^［13］上，miR-133a/b促进人肌管形成；在山羊^［14］和鸡^［15］上的研究也发现miR-133a-3p分别靶向FGFR1或PRRX1抑制骨骼肌卫星细胞增殖并促进其分化。而miR-133c-3p是miR-133家族的新成员，本研究发现它在肌肉组织中特异性表达，并且在鸡骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中呈现出表达水平先降低后升高的规律，意味着miR-133c-3p可能抑制卫星细胞增殖而促进其分化。这与miR-133a 和miR-133b的功能相同。

种子区序列（UGGUCCC）是miR-133c-3p与靶基因特异性识别并结合的关键。本研究通过多序列比对分析发现13个物种miR-133c-3p序列高度保守且种子区序列完全一致，但牛的种子区序列为UGGUUCC，发生C<U突变，这意味着牛miR-133c-3p参与调控不同的靶基因表达，可能发挥不同于其它物种miR-133c-3p的独特功能，这也需要进一步探索。

本研究预测到103个miR-133c-3p的靶基因，功能富集分析发现它们多显著富集于骨骼系统发育、肌球蛋白结合等生物学过程以及肌动蛋白细胞骨架调控、磷酸酰基醇、p53、mTOR等肌肉发育相关信号通路，这也证实miR-133c-3p与肌肉发育直接相关。磷酸酰基醇信号通路可通过调节细胞增殖、存活、蛋白质合成、细胞骨架变化和肌动蛋白重构等过程，影响肌肉的生长、肥大和萎缩^［16］。在骨骼肌中，p53的表达变化与肌肉萎缩和肥大有关，且在肌肉损伤后的修复过程中发挥作用^［17］。mTOR信号通路可通过调控MEF2C和MyoD1的转录活性，进一步调控山羊骨骼肌卫星细胞（SCs）增殖和分化，对于维持肌肉健康和功能至关重要^［18］。肌动蛋白细胞骨架调控信号通路在骨骼肌中参与细胞形态维持、细胞增殖、细胞迁移、信号传导以及肌肉再生和修复等生物学过程^［19］。这些通路可能是miR-133c-3p调控肌肉生长发育的桥梁。

结合清远麻鸡RNA-seq数据，研究初步筛选出了SGK1、NFAT5、KLF7、MYH9 4个靶基因。Wang等^［20］发现KLF7在骨骼肌和肌干卫星细胞（SC）的静止期高度表达，KLF7的沉默促进了骨骼肌卫星细胞的活化和成肌细胞的增殖，而在成肌细胞向肌管的过渡过程中，KLF7的mRNA表达下调，其肌源性分化中的作用有限；SGK1在骨骼肌生长发育中扮演着多重角色，包括调节肌肉细胞的生长、代谢、保护肌肉免受萎缩，以及维持肌肉卫星细胞的稳态^［21-23］；同时SGK1被富集到mTOR信号通路中，可介导Akt-mTOR信号通路下调蛋白质降解和自噬以及在冬眠期间增加蛋白质合成来调节小鼠肌肉质量的维持^［24］。MYH9在快速生长型肉鸡和慢速生长型肉鸡的骨骼肌中差异表达，并且MYH9基因敲除的细胞中其肌动蛋白细胞骨架结构也会发生改变，表明它在调节骨骼肌的生长和发育中发挥重要作用，但对其作用机制的认识仍十分有限，有待进一步探索^［25-26］。

本研究中，卫星细胞增殖和分化期间miR-133c-3p与候选靶基因（SGK1、NFAT5、KLF7、MYH9）的表达并不呈负相关规律，但并不能排除KLF7、MYH9、SGK1是miR-133c-3p的靶基因的可能性，有可能miR-133c-3p的表达以及与靶基因的结合受细胞内环境、时空的影响，还需多层面的验证。而NFAT5与miR-133c-3p的表达总体上呈相反趋势，这意味着NFAT5很可能是miR-133c-3p的靶基因。大量研究表明，NFAT5在动物肌肉生长发育中不可或缺，这一点在多个物种中均已得到证实。在人上，NFAT5的异常缺失可能诱导杜氏肌营养不良的发生^［27］；在小鼠上，NFAT5敲除小鼠显示出肌肉再生缺陷，受伤后早期形成的肌纤维较少^［28］。而对其机制研究也发现miR-10b-5p靶向NFAT5调控小鼠成肌细胞的增殖分化^［29］；此外NFAT5可响应上游肌源性miR-1和miR-206的表达量变化调控成肌细胞的分化^［30］，这说明NFAT5作为枢纽基因在肌肉损伤修复、成肌细胞分化以及肌纤维形成等过程传递重要的生物信息，这与本研究结果吻合。而双荧光素酶报告基因结果进一步证实了NFAT5与miR-133c-3p存在靶标关系，本研究为解析miR-133c-3p调控肌肉生长发育的分子机制提供了一个新的靶点和研究方向。

4　结 论

研究预测出103个gga-miR-133c-3p的靶基因，显著富集于骨骼系统发育、肌球蛋白结合等条目及磷酸酰肌醇信号系统、肌动蛋白细胞骨架调控、mTOR信号通路、FoxO、p53等肌肉相关通路。组织表达分析发现gga-miR-133c-3p在胸肌和腿肌中高表达，并在卫星细胞增殖分化期间呈先下降后上升的规律；候选靶基因NFAT5的表达与其负相关，双荧光素酶报告基因系统检测进一步证实NFAT5与miR-133c-3p存在靶标关系。因此鸡miR-133c-3p在胸肌中很可能通过靶向NFAT5发挥肌肉生长发育等相关生物学功能。

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基金资助

四川省苗子工程培育项目(MZGC20240106)

国家肉鸡产业技术体系项目(CARS-41-G07)

国家现代农业产业技术体系四川肉鸡创新团队项目(SCCXTD-2024-24)

四川省省级科研院所基本科研项目(SASA202503)