原核表达dsRNA发酵条件、提取方法优化及应用

Optimization and application of the fermentation conditions and extraction methods for prokaryotic dsRNA expression

摘要

为优化原核表达系统中双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）的发酵条件和提取方法，并探讨其在水稻纹枯病防治中的应用潜力，通过构建靶向水稻纹枯病RsDCL1/2基因的重组发夹结构表达载体，并导入大肠杆菌HT115（DE3）菌株中，通过对pH、IPTG诱导浓度、诱导温度转速、诱导时间、NaCl浓度进行调整优化，筛选出最佳发酵条件以提高dsRNA产量；并评估Trizol法、RNAswift法、75%乙醇固定法及PB缓冲裂解法4种提取方法对dsRNA的提取效率，采用最适提取方法对提取的dsRNA开展水稻纹枯病的温室防治效果验证。结果表明：1）经优化后的发酵条件为pH 7，0.4 mmol/L IPTG，33 ℃，160 r/min，7.5 g/L NaCl，发酵时间12 h，该发酵条件下获得的dsRNA产量比优化前增加1.32倍；2）在提取方法比较中，PB缓冲裂解法在产量和纯度方面表现最佳，产量是75 %乙醇固定法的3.89倍；3）温室盆栽防效试验表明，PB缓冲裂解法提取的dsRNA喷施水稻后，显著降低病斑的面积，进一步验证了dsRNA作为生物农药在水稻纹枯病防治中的潜力。综上，基于优化发酵条件和PB缓冲裂解法2种方式构建的dsRNA生产体系，可有效提高dsRNA的产量；同时，该体系产出的dsRNA在水稻纹枯病的防治中表现出良好的应用效果。

Abstract

To optimize the fermentation conditions and extraction methods for double-stranded RNA （dsRNA） in a prokaryotic expression system and evaluate its potential for controlling rice sheath blight （Rhizoctonia solani）， a recombinant hairpin expression vector targeting the RsDCL1/2 genes of R. solani was constructed and transformed into Escherichia coli HT115（DE3）. Six fermentation parameters （pH， IPTG concentration， induction temperature， agitation speed， duration， and NaCl concentration） were systematically optimized. The results showed that the highest dsRNA yield （1.32-fold increase over pre-optimization levels） was achieved under the following conditions： pH 7， 0.4 mmol/L IPTG， 33 °C， 160 r/min， 7.5 g/L NaCl， and 12 h induction. Comparative analysis of four extraction methods （Trizol， RNAswift， 75% ethanol fixation， and PB buffer lysis） demonstrated that PB buffer lysis yielded 3.89 times more dsRNA than 75% ethanol fixation while maintaining superior purity. In greenhouse trials， the appliction of PB-extracted dsRNA foliar significantly reduced the lesion area on rice leaves， confirming the potential dsRNA as a biopesticide in the prevention and control of rice sheath blight. Collectively， the integrated dsRNA production system combining optimized fermentation and PB buffer lysis not only enhanced dsRNA yield but also exhibited promising field-applicable potential for sustainable management of rice sheath blight.

Graphical abstract

关键词

dsRNA / 发酵条件 / dsRNA提取方法 / 水稻纹枯病

Key words

dsRNA / optimization of fermentation conditions / dsRNA extraction methods / rice sheath blight

喷雾诱导基因沉默（spray induced gene silencing，SIGS）是近些年发展的植物绿色防控新技术，是将dsRNA喷洒于病虫害表面并被病虫害直接或间接地吸收至细胞内，从而沉默靶标基因的表达，达到控制病虫害的目的^［1］。基于SIGS技术的RNA干扰（RNA interference，RNAi）农药创制被誉为“农药史上第三次革命”，具有靶向强、效率高、无污染等优点^［2］。在真核生物中，双链RNA（dsRNA）被Dicer-like（DCL）酶切割为双链siRNA（small interfering RNA），与Argonaute（AGO）结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-Induced Silencing Complex， RISC），通过切割靶标mRNA或者抑制其翻译^［3］。DCL蛋白是RNAi通路中的关键酶，在基因表达调控和病原菌致病中发挥着重要作用^［4］。以灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）为例，其BcDCL1/2基因被敲除后，病原菌毒力和生长能力显著下降，这一发现揭示了DCL基因在病原菌致病机制中的关键作用^［5］。经后续研究发现通过喷施靶向BcDCL1/2的dsRNA的水果、蔬菜、花瓣等均可有效防控灰霉病^［6］，验证了RNAi的应用潜力。SIGS除对灰葡萄孢菌具有显著的防治效果，在防治禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）^［7］、葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）^［8］、稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）^［9］及其他多种病原菌方面也具有重要的应用前景。通过RNA干扰技术开发的RNA生物农药能够特异性且持续地降低昆虫和真菌对植物的侵害^［10］，其高效无污染、靶向性强及环境兼容性佳等优势，对于推动农业领域绿色农药的可持续发展具有重要的实践意义。

目前，RNA生物农药仍处于发展的初期阶段，在大田应用中还存在量产成本高、递送效率低以及稳定性不足等问题^［11］。dsRNA的制备主要依赖于化学合成、微生物表达以及无细胞合成技术。化学合成成本较高，仅限于小规模的生产应用。早期通过微生物发酵制备dsRNA的成本约为体外转录试剂盒生产成本的1/4^［12］，随着系统的不断完善，有企业宣称生产dsRNA的成本已经能达到2美元/g^［11］。无细胞合成是目前获悉的企业报道中生产dsRNA成本最低的方式，dsRNA的生产成本仅为1美元/g^［13］。然而，这一过程需要多种酶的辅助，依赖于专业的供应链。尽管如此，基于微生物发酵和无细胞合成的dsRNA生产在田间防治方面具有广阔的应用前景，已成为RNA生物农药合成的研究热门方向^［14-15］。

微生物表达合成dsRNA的系统中，大肠杆菌因其清晰的遗传背景、快速生长和易于操作的特点，广泛应用于dsRNA的生产^［16］。例如，利用HT115（DE3）生产的以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）为靶点的dsRNA能有效保护黄瓜叶片免受病毒侵染，有效保护期最长可达24 d^［17］。将含有针对黄曲霉和灰霉菌的dsRNA的细菌HT115（DE3）自溶物分别施用于玉米种子以及本氏烟叶片时，能有效抑制病原菌的生长和毒素的累积^［18］。除此以外，RNA农药的生产还可通过谷氨酸棒杆菌^［19］、苏云金芽胞杆菌^［20］、丁香假单胞菌^［21］等其他微生物底盘得以实现。dsRNA的提取纯化是RNA农药生产中的重要环节，目前dsRNA的提取主要依赖于Trizol法^［22］、75%乙醇沉淀法^［23-24］以及RNAswift^［25］等技术，但这些方法存在一些局限性，如操作复杂、成本较高等问题。因此，迫切需要开发一种既经济高效又能够保证提取质量的dsRNA提取新方法。

水稻（Oryza sativa L.）是全球重要的粮食作物之一，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是水稻生产上的重要病害之一，已在亚洲、非洲、欧洲、美洲等水稻种植地区广泛蔓延^［26］。据全国农业技术推广服务中心统计，我国纹枯病发病趋势较重，特别是在西南、华南、长江中下游等稻区影响更甚，预计2025年该病害的受影响面积达到2.4亿亩次^［27］。目前水稻纹枯病的防治主要依赖于药剂的应用，比较常用的杀菌剂包括井冈霉素、多菌灵、代森锰锌等^［28-30］。然而，对杀菌剂的长期或不规范使用可能导致病原菌产生抗药性及环境污染等问题^［31］。因此，迫切需要采用可持续的、绿色环保的防治手段保障粮食生产安全。

兰驰^［32］研究发现，靶向立枯丝核菌RsDCL1和RsDCL2基因的dsRNA能通过干扰菌丝生长和侵染垫结构，从而减弱其致病力，有效抑制水稻纹枯病的发生。可见，DCL基因是防治水稻纹枯病的RNAi生物农药理想的靶标，为作物真菌病害绿色防控提供了新策略，但如何实现dsRNA的规模化发酵及提取还需要进一步研究。本研究通过设计并构建基于靶向水稻纹枯病关键基因RsDCL1/2的重组发夹结构表达载体，并将其导入了RNaseIII缺陷型表达载体的大肠杆菌HT115（DE3）菌株，利用该大肠杆菌原核表达生产系统，探索了产生dsRNA的最佳发酵条件，并对不同的dsRNA提取方法进行评估，以期获得dsRNA高产的最佳诱导条件，此外，还通过温室盆栽防效试验验证了获得的dsRNA对水稻纹枯病的防治效果，旨在探究dsRNA作为生物农药在水稻纹枯病防治中的应用潜力，以期为水稻纹枯病的绿色防治提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料

大肠杆菌HT115（DE3）购于上海唯地生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α，pET28a、LOOP由本实验室保存；RsDCL1/2，由实验室保存的DH5α-pMD19-T载体上扩增。

1.2　试验设计

1.2.1　pET28a-RsDCL1/2发夹结构载体构建

以pMD19-T载体为模板，利用引物（表1）扩增400 bp的RsDCL1/2的正义链（产物1）与反义链（产物2）。以LOOP DNA片段为模板，利用引物（表1）扩增136 bp的LOOP基因序列（产物3）。以产物1和产物3为模板，利用引物RsDCL1/2-L-F和LOOP-R扩增536 bp的RsDCL1/2+LOOP基因序列（产物4）。

用1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，并使用凝胶回收试剂盒（Thermo Scientific）回收目的PCR产物，分别将回收纯化的PCR产物4与pET 28a载体使用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III双酶切，随后将切好的片段连接并转化至大肠杆菌DH 5α。将转化产物涂布于含有卡那霉素抗性（50 μg/mL）的LB固体培养基平板上，挑选单菌落摇菌，并进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆后送测序。将测序正确的重组质粒命名为p28-L+LOOP。分别将重组质粒p28-L+LOOP和回收纯化的PCR产物2使用限制性核酸内切酶Hind III和Xho I双酶切，随后将切好的片段连接并转化至大肠杆菌DH5α。将转化产物涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）和四环素抗性（12.5 μg/mL）的LB固体培养基平板上，挑选单菌落摇菌，随后提取质粒并使用限制性核酸内切酶Hind III和Xho I双酶切，将酶切得到的片段进行回收纯化后送测序。将含正确测序片段的质粒命名为pET28a-RsDCL1/2，同时将pET28a-RsDCL1/2转化至大肠杆菌HT115（DE3）。

1.2.2　含重组质粒的菌液dsRNA表达诱导

将含有pET28a-RsDCL1/2重组质粒的大肠杆菌HT115（DE3）在含卡那霉素（50 μg/mL）和四环素抗性（12.5 μg/mL）的LB固体培养基平板划线，37 ℃恒温培养过夜。挑取单菌落加入到5 mL上述相同抗生素LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜。吸取初培液以1∶50（V/V）体积比加入100 mL上述相同抗生素LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min扩培3 h至OD₆₀₀=0.6。在灭菌的超净台中以1∶1 000（V/V）加入终浓度为0.6 mmol/L的无菌异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside， IPTG），继续诱导6 h。

1.2.3　原核表达dsRNA-RsDCL1/2发酵条件优化

以dsRNA表达水平作为评价指标，将表达菌株接种至含50 μg/mL卡那霉素和12.5 μg/mL四环素的LB液体培养基，依次对pH、IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导转速、诱导时间、NaCl浓度6个自变量进行单因素试验，探究dsRNA表达菌株的最佳诱导表达体系，见表2。

1.2.4　dsRNA提取方法优化

Trizol法（TR）：取50 mL诱导菌液，8 000 r/min离心8 min，弃上清。菌体沉淀通过涡旋震荡彻底重悬于1 mL Trizol，加入200 μL氯仿，涡旋震荡，冰上静置5 min至液体分层。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，吸上清于新的无酶EP管中。上清加入等体积异丙醇，颠倒均匀，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃，12 000 r/min离心20 min。沉淀加入1∶1（V/V）75%乙醇，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，重复2次。沉淀风干15 min后，加入DEPC ddH₂O溶解RNA。-80 ℃保存备用。前期发酵条件优化主要以该方法提取获得的dsRNA。

RNA swift（RS）：参照Nwokeoji等^［25］的方法进行操作。取50 mL诱导菌液，8 000 r/min离心8 min，弃上清。菌体沉淀通过涡旋震荡彻底重悬于5 mL裂解液（4% SDS pH 7.5、0.5 mmol/L NaCl），90 ℃加热4 min，以8 000 r/min离心6 min，吸上清于新的无酶EP管中。上清加入7.5 mL 1 mol/L盐酸胍和2 mL 5 mol/L NaCl，室温静置10 min。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，吸上清于新的无酶EP管中。上清加入等体积异丙醇，颠倒均匀，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃，12 000 r/min离心20 min。沉淀加入1∶1（V/V）75%乙醇，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，重复2次。沉淀风干15 min后，加入DEPC ddH₂O溶解RNA。-80 ℃保存备用。

75%乙醇固定法（AH）：参照Posiri^［23］的方法进行操作。取50 mL诱导菌液在80 ℃条件下加热20 min，8 000 r/min离心5 min。菌体沉淀重悬于75%乙醇（以PBS制备），4 ℃，12 000 r/min离心5 min。菌体沉淀重悬于150 mmol/L NaCl，4℃，12 000 r/min离心5 min，吸上清于新的无酶EP管中。上清加入等体积异丙醇，颠倒均匀，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃，12 000 r/min离心20 min。沉淀加入1∶1（V/V）75%乙醇，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，重复2次。沉淀风干15 min后，加入DEPC ddH₂O溶解RNA。-80 ℃保存备用。

PB缓冲裂解法（PB）：取50 mL诱导菌液，8 000 r/min离心8 min，弃上清；菌体沉淀通过涡旋震荡彻底重悬于含有1.5 mg/mL 溶菌酶的1 mL DEPC ddH₂O中，37 ℃处理1 h。重悬液中加入60 ℃预热的1 mL裂解液（0.5% SDS，2 mol/L NaCl，0.2 mol/L K₂HPO₄、 NaH₂PO₄ pH 7.4）中，颠倒混匀。超声裂解5 min（超声3 s，间隔5 s）。4 ℃，8 000 r/min离心5 min，吸上清于新的无酶EP管中。上清加入等体积异丙醇，颠倒均匀，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃，12 000 r/min离心20 min。沉淀加入1∶1（V/V）75 %乙醇，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，重复2次。沉淀风干15 min后，加入DEPC ddH₂O溶解RNA，冰上静置5~10 min，12 000 r/min离心5 min，上清即为RNA溶液。-80 ℃保存备用。

1.2.5　dsRNA表达水平测定及数据统计

测定浓度后以1%琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA表达情况，用ImageJ进行灰度分析比较目的基因表达水平。

1.2.6　dsRNA对水稻纹枯病温室防效试验

离体试验：在培养皿底部铺上经ddH₂O湿润的滤纸片用于叶片保湿，选取4周左右长势一致的水稻叶片平铺于滤纸片上。将新培养的纹枯菌菌饼接种至叶片中心位置。各处理滴加20 μL溶液于叶片中心位置，置于28 ℃培养箱培养24 h，观察叶片形态并利用Photoshop对病斑面积进行统计分析。

活体试验：选取4周左右长势一致的水稻，喷施各处理溶液，为确保每片叶片均能保持挂水状态，每盆使用10 mL的喷雾量进行均匀喷洒。药后3 d，将新培养的纹枯菌菌饼接种至水稻茎秆基部同一位置，接种处理4~5 d，观察水稻发病情况，并利用Photoshop对病斑面积进行统计分析。

2　结果与分析

2.1　pET28a-RsDCL1/2重组质粒构建及dsRsDCL1/2表达

在重组质粒内部，2条互补链通过自我折叠构建出1个更加稳定的RNA发夹结构。鉴于LOOP片段为无义内含子，目标dsRNA片段大小约为400 bp。将该重组质粒pET28a-RsDCL1/2导入大肠杆菌DH5α扩培后，再转化至大肠杆菌HT115（DE3）中，并通过IPTG诱导dsRNA表达，诱导表达条带与预期目的片段大小相符合（图1）。

2.2　pH对dsRNA表达水平的影响

由图2可知，在pH 4.5~8.5处理中，随着pH的增加dsRNA的表达水平呈下降趋势，pH 5.5、6.5、7.0处理的dsRNA表达量无显著差异。pH<5.5时，dsRNA表达水平则有所提高。pH=4.5时，条带最宽亮度最大，统计结果也验证了pH=4.5时dsRNA表达水平最高。尽管酸性环境有利于dsRNA的表达，但实际生产中发酵体系初始是7.0左右，若添加酸碱试剂调节pH，不够简便经济，因此，最终确定培养基初始pH 7.0进行后续试验。

2.3　IPTG诱导浓度对dsRNA表达水平的影响

由图3可知，dsRNA表达水平随着IPTG诱导浓度的升高而增加，表明大肠杆菌原核表达系统在IPTG的诱导下能够有效启动目的基因的转录与表达。当IPTG浓度达到0.4 mmol/L时dsRNA表达水平达到峰值，且表达水平显著高于低浓度组（0.1~0.2 mmol/L）。当IPTG浓度进一步提高（≥0.6 mmol/L）dsRNA的表达水平并未呈现显著上升趋势，说明0.4 mmol/L已接近该表达系统的饱和诱导浓度。故确定IPTG诱导浓度为0.4 mmol/L进行后续试验。

2.4　温度对dsRNA表达水平的影响

由图4可知，在试验设定温度范围内，高温或低温都会影响dsRNA的表达，dsRNA表达水平表现出先升高后降低的趋势。琼脂糖核酸电泳结果显示，随着诱导温度的升高，条带的亮度先增强后减弱，统计分析表明，当诱导温度为25~33 ℃时，dsRNA表达水平随温度上升而显著增加，在33 ℃达到峰值而后逐渐递减；当温度>37 ℃时，表达水平显著下降，表明高温对表达系统产生一定负面影响。故确定诱导温度为33 ℃进行后续试验。

2.5　转速对dsRNA表达水平的影响

由图5可知，dsRNA表达水平随着转速的升高呈现先升高再下降的趋势，在转速为160 r/min时表达水平达到最高，故确定诱导转速为160 r/min进行后续试验。

2.6　诱导时间对dsRNA表达水平的影响

由图6可知，随着诱导时间的延长，条带亮度明显增强，dsRNA的表达量呈现出阶梯状的增长趋势。在2~4 h，表达水平大约为5 μg/mL；当时间延长至6~10 h，表达水平增长了1倍；继续延长至12~16 h，表达水平在先前的基础上又增加了约15%。在这个过程中，12 h的表达量最高，故确定诱导时间为12 h进行后续试验。

2.7　NaCl浓度对dsRNA表达水平的影响

由图7可知，LB培养基中NaCl浓度对dsRNA具有正调控作用，当LB液体培养基中NaCl浓度在1.25~2.50 g/L时，dsRNA表达水平处于低水平状态；随着浓度的增加，当NaCl浓度在5.0 g/L时，dsRNA表达水平达到第1个表达高峰，较低水平状态提升约3.3倍；当浓度>5.0 g/L时，dsRNA表达水平再次显著升高，并在7.5~10.0 g/L表达水平达到稳定平台期，较5.0 g/L处理组表达水平又提升约1.3倍。故最终选用NaCl浓度为7.5 g/L进行后续试验。

2.8　扩大验证

通过系统的条件优化试验，确定最终的发酵方案，优化前后关键参数发生显著变化。在未优化条件下，采用LB培养基（初始pH 7.0，NaCl 10 g/L）培养至OD₆₀₀=0.6后，以终浓度0.6 mmol/L IPTG在37 ℃、200 r/min条件下诱导6 h；经过多参数优化后，培养条件调整为LB培养基（初始pH 7.0，NaCl 7.5 g/L）培养至相同OD₆₀₀，随后以0.4 mmol/L IPTG在33 ℃、160 r/min条件下诱导12 h，见表3。

为确保大规模生产提供高效稳定的体系，试验将该方案进行扩大验证。未优化前500 mL菌液产dsRNA的水平为9.30±0.69 μg/mL，而经优化后的dsRNA表达水平显著升高，是未优化前的1.32倍，为12.28±0.83 μg/mL（图8）。

2.9　dsRNA提取方法比较

由图9和表4可知，上述4种方法均能得到dsRsDCL1/2，第4条泳道的条带最亮，这表明该方法获取dsRNA能力较强。PB缓冲裂解法的dsRNA表达水平最高为14.44 μg/mL，Trizol法和RNA swift法的dsRNA表达水平次之，而75%乙醇固定法的dsRNA表达水平最低。PB缓冲裂解法的dsRNA表达水平是75%乙醇固定法的3.89倍。除此之外，除了RNA swift法之外，Trizol法、75%乙醇固定法和PB缓冲裂解法提取方法得到的RNA纯度均较高，稳定性也很好，A₂₆₀/A₂₈₀均处于2.0~2.2，A₂₆₀/A₂₃₀保持在1.8~2.2。而RNA swift法的A₂₆₀/A₂₃₀达到2.4，远超出上述范围，表明RNA swift法提取的RNA可能发生了降解。可见，PB缓冲裂解法提取的dsRNA具有较高的表达水平和纯度。

2.10　温室防效试验

由图10可知，与对照组（DEPC ddH₂O）相比，喷施dsRNA后水稻叶片病斑面积减少45.22%（P<0.01）。此外，dsRNA处理水稻茎秆基部显著抑制了病斑的扩展，病斑面积减少44.33%。可见，采用PB缓冲裂解法提取的dsRNA可显著降低病斑面积的扩大，有效控制了水稻纹枯病的病情发展。

3　讨 论

RNAi技术在现代农业生物技术中具有重要功能，因微生物发酵合成dsRNA成本低廉且发酵简便，大肠杆菌原核表达系统已经成为生产dsRNA的有力工具^［10］。优化发酵条件有助于明确细胞的最佳培养条件。本研究IPTG浓度优化结果表明，0.4 mmol/L为最佳诱导浓度，这与徐翔等^［33］的研究一致，但显著低于Mo等^［17］当诱导条件为37 ℃、2.0 mmol/L IPTG、时间为17 h时dsRNA表达量最高所用的IPTG浓度，这可能是因为靶标基因和培养基不同^［34-35］以及其他不同诱导条件相互作用引起的对诱导剂敏感性的差异。在诱导过程中，IPTG会导致细菌死亡、裂解，对人体健康也有一定毒害作用^［36-37］，因此，传统的使用IPTG作为诱导大肠杆菌表达系统仍需进一步完善。已有研究表明，组成型表达的绝缘启动子proD与T7的协同作用可以实现不添加诱导剂即可提高菌株自身表达dsRNA的能力^［36］；使用乳糖诱导的dsRNA产量相比IPTG诱导可提升10倍^［35］。此外，在原核生物表达蛋白的研究中，建议可用脱脂奶粉代替IPTG来诱导蛋白表达^［38］，但在RNA生产领域尚未发现类似的研究报道。转速通过影响锥形瓶内含氧量控制菌群生长和影响细菌生长周期，而处于指数初期的细菌生长量少，导致大肠杆菌体内dsRNA表达量也相对较低，处于指数后期诱导的dsRNA产量和质量均会下降^［39］。长时间的诱导过程可能会引起细菌细胞的自溶，并且会减少dsRNA的稳定性^［34］。此外不同的载体也会影响dsRNA的表达效率。对于表达dsRNA的载体，一般pGEM-T、pET28a/22b这类含有单个T7启动子的构建体比pL4440等含有双T7启动子的构建体往往能获得更好的表达水平^［40］。Ma等^［24］研究显示，采用pET 28a载体的大肠杆菌表达系统的产量是L4440载体的3倍。为了解决RNA生产中的难题，还可以考虑更换为TB培养基，并采用分批补料的发酵策略以提高质粒产量，或通过改造质粒引入多重合成转录终止子以实现提高dsRNA表达水平的目标^{［35，41-44］}。

本研究4种提取方法均能有效裂解细胞使其释放dsRNA。Trizol法广泛应用于小规模细菌培养中dsRNA的提取，其核心原理是借助苯酚-胍试剂提取^［22］。Figueiredo等^［39］研究指出，基于相同原理的QIAzol试剂在dsRNA提取过程中的成本占比高达85%，同时试剂具有较大的毒性，这使得该类型试剂并不适合于大规模生产。虽然采用75%乙醇固定法能够得到dsRNA，但其表达水平并不高。这一现象与Ma等^［24］的结论相吻合，而Mo等^［17］研究报道的摇培表达量可达（17.90±4.20） µg/mL。本试验中RNAswift法提取的dsRNA质量波动较大，出现部分降解的现象。试验在探究PB缓冲裂解法提取dsRNA的过程中，主要依据超声、溶菌酶和SDS，通过破坏细胞壁和细胞膜有效裂解细胞来提高dsRNA获取量^{［25，45］}，其中SDS还能起到抑制核糖核酸酶的作用^［46］。同时，高盐浓度（≥0.5 mol/L NaCl）下RNase A会特异性切割单链RNA（ssRNA）^［17］。但高浓度的NaCl会导致SDS-蛋白质复合物沉淀生成，RNA纯度受影响，可通过二次离心或添加有机物溶解加以解决^［25］。

本研究通过单因素试验初步解析了各诱导条件对dsRNA产量的影响规律。然而，考虑到多因素交互作用在发酵过程中的重要性，后续还可采用正交试验设计等方法进行更深入的系统优化。

4　结 论

本研究采用大肠杆菌原核表达系统，以pET28a作为载体，以RsDCL1/2为研究目标，构建了pET28a-RsDCL1/2发夹结构载体。通过筛选，确定了最佳的发酵条件为pH 7.0、IPTG诱导浓度0.4 mmol/L、诱导温度33 ℃、诱导转速160 r/min、诱导时间12 h、LB中的NaCl浓度为7.5 g/L，表达水平较优化前提升1.32倍。4种提取方法中，PB缓冲裂解法提取dsRNA效果最好，所获得的dsRNA纯度好、表达水平高，其dsRNA表达水平是75 %乙醇固定法的3.89倍。温室防效试验结果表明，采用PB缓冲裂解法提取的dsRNA喷施水稻可显著降低病斑面积，充分验证了dsRNA作为生物农药在水稻纹枯病防治中的巨大潜力。

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