贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562的鉴定及其对黄瓜根结线虫病的防效

Identification of Bacillus velezensis Sneb2562 and its efficacy in controlling cucumber root knot nematode disease

摘要

为筛选能有效防治黄瓜根结线虫病的微生物资源，通过离体线虫毒性试验从本实验室保存的52株细菌中筛选优良菌株，对筛选得到的菌株形态特征、生理生化和分子生物学特性进行鉴定，并测定其对根结线虫卵孵化的抑制率及黄瓜种子萌发率的影响，通过盆栽及田间试验分析其对黄瓜根结线虫病的防治效果。结果表明：从52株细菌中筛选到1株对南方根结线虫二龄幼虫（J2）具有良好毒杀活性的菌株Sneb2562，对J2处理24 h的致死率为79.25%；结合形态特征、生理生化特性以及分子生物学方法将其鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）；Sneb2562处理能显著抑制线虫卵的孵化，具有产蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶和解磷能力，且处理后的黄瓜种子发芽率比LB液体培养基（LB）高4.00%（P>0.05）。盆栽试验结果显示，Sneb2562可显著减少线虫侵染后黄瓜植株的根结数量，根结减退率和防治效果分别为50.27%和52.00%；该菌株能显著增加黄瓜植株株高和株鲜重，与LB相比，株高和株鲜重分别升高16.05%和63.68%（P<0.05）。此外，2024年第1次田间试验结果表明，Sneb2562对黄瓜根结线虫病防治效果为42.03%，其处理的黄瓜植株鲜重与LB相比显著增加4.01%（P<0.05），第2次田间试验结果表明，Sneb2562对黄瓜根结线虫病田间的防治效果为53.73%，其处理的黄瓜植株株高、株鲜重比LB分别增加25.18 cm、29.41 g（P<0.05）。综上，贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562能有效防治黄瓜根结线虫病，具有开发应用潜力，可作为该病害新的潜在生物防治资源。

Abstract

In order to screen microbial resources that can effectively prevent and control cucumber root knot nematode disease， excellent strains were selected through in vitro nematicidal assays. The strains were identified based on their morphological characteristics， physiological and biochemical properties， and determined by molecular biology methods. The effects on nematode egg hatching rate and cucumber seed germination rate were determined， and the control effects of the strains on cucumber root knot nematode disease were further determined through pot and field experiments. The results showed that strain Sneb2562 displayed high toxicity activity against second-stage juvenile （J2） of Meloidogyne incognita was screened from 52 bacterial strains preserved in this study. After 24 h of treatment， the mortality rate of M. incognita J2 exposed to Sneb2562 reached 79.25%. Based on morphological characteristics， physiological and biochemical properties， and molecular biology methods， the strain Sneb2562 was identified as Bacillus velezensis. B. velezensis Sneb2562 treatment significantly inhibited the hatching of nematode eggs， exhibited the capabilities to produce protease， phosphatase， amylase， and solubilize phosphate. The germination rate of cucumber seeds treated with B. velezensis Sneb2562 increased by 4.00% compared with the LB control （P>0.05）. The results of the pot experiment showed that Sneb2562 significantly reduced the number of root galls on cucumber plants after nematode infestation， with a root gall reduction rate and control effect of 50.27% and 52.00%， respectively. Additionally， this strain significantly increased the height and fresh weight of cucumber plants， with the plant height and fresh weight increasing by 16.05% and 63.68% compared to the LB control， respectively （P<0.05）. In addition， the field trial results in the 1^st field experiment of 2024 showed that the control effect of strain Sneb2562 on cucumber root knot nematode disease was 42.03%. The fresh weight of cucumber plants treated with this strain increased significantly by 4.01% compared to LB （P<0.05）. The experimental results in the 2^nd field experiment of 2024 showed that strain Sneb2562 had a 53.73% control effect on cucumber root knot nematode disease， and the plant height and fresh weight of cucumber plants treated with it were significantly higher than LB， increasing by 25.18 cm and 29.41 g， respectively （P<0.05）. In summary， B. velezensis Sneb2562 can effectively control cucumber root knot nematode disease， and has great potential for development and application， and can be used as a new potential biocontrol resource for the biological control of this disease.

Graphical abstract

关键词

南方根结线虫 / 芽胞杆菌 / 鉴定 / 防治效果

Key words

Meloidogyne incognita / Bacillus spp. / identification / biocontrol effect

植物寄生线虫引起的线虫病目前已成为危害农业生产的第二大类病害，每年造成世界范围内经济损失超 1 730亿美元^［1-2］。根结线虫（Meloidogyne spp.）是严重危害农业生产的植物寄生线虫之一，每年造成我国蔬菜产量减少30%以上^［3-4］。在我国，由南方根结线虫（M.incognita）引起的黄瓜根结线虫病普遍发生，已成为黄瓜生产中最具破坏性的威胁之一，严重影响黄瓜的产量和品质^［5-7］。目前对根结线虫病的防治主要以化学药剂防治为主，常用的化学药剂包括噻唑膦、阿维菌素、氟噻虫砜等^［8］。频繁使用化学农药导致了严重的环境污染、线虫的抗药性持续增强和对人畜不安全等问题。相较于化学防治，生物防治展现出对环境的友好性、不易产生抗性以及对人畜的无害性等特点，更符合现代农业的绿色可持续发展理念^［9-11］。因此，利用生防微生物防治根结线虫病，探寻绿色高效的防治措施，对黄瓜产业可持续发展具有重要的意义。

芽胞杆菌属（Bacillus spp.）因其具有较强的定殖和抗逆能力，可通过多种生防机制保护植物免受病原侵染，是防治根结线虫病的主要生防微生物资源^［12-13］。付艳艳等^［14］报道坚强芽胞杆菌YB-1503发酵滤液处理48 h，南方根结线虫二龄幼虫的死亡率达73.0%。刘雅洁等^［15］分离筛选获得的解淀粉芽胞杆菌HJ03能显著抑制南方根结线虫卵的孵化，抑制率为71.1%。盆栽和田间试验结果表明，蜡样芽胞杆菌Bc-cm103可显著减少根结数量，有效防控黄瓜根结线虫病^［16］。Ji等^［17］发现贝莱斯芽胞杆菌TA-1通过诱导番茄产生系统抗性进而防治番茄根结线虫病。李德全等^［18］研究表明，枯草芽胞杆菌NH-8对番茄根结线虫病的防效为81.8%，同时对番茄植株生长具有促进作用。目前，高效、稳定的黄瓜根结线虫病生防资源的研究鲜见报道。本研究以南方根结线虫为靶标，筛选对南方根结线虫J2具有良好毒杀活性的菌株并进行鉴定，进一步测定其对南方根结线虫卵孵化的抑制作用、生防特性、对黄瓜种子的萌发及生长的影响、盆栽及田间条件下对黄瓜根结线虫病的防治效果，旨在丰富黄瓜根结线虫病绿色防控的微生物资源，以期为黄瓜根结线虫病的生物防治提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

供试52株细菌均由沈阳农业大学北方线虫研究所分离保藏。供试细菌培养温度为37 ℃，培养基为肉膏蛋白胨培养基。选用南方根结线虫感病黄瓜品种‘中农6号’，购于北京中蔬种业科技有限公司。供试线虫为南方根结线虫，从辽宁省沈阳市辽中区四方台镇八音台村（122°99′ E，41°59′ N）南方根结线虫病发病严重的黄瓜大棚中采集病根，在北方线虫研究所温室的黄瓜植株上进行单卵囊扩繁。

试验所用肉膏蛋白胨培养基（LB）^［19］（购于青岛海博生物技术有限公司）、蛋白酶检测培养基^［20］、磷酸酯酶检测培养基^［21］、淀粉酶检测培养基^［22］、几丁质酶检测培养基^［23］、β-1，3葡聚糖酶检测培养基^［19］、纤维素酶检测培养基^［23］、解磷培养基^［24］、解钾培养基（碳酸钙0.1 g/L，氯化铁0.2 g/L，玻璃粉1 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钠2 g/L，蔗糖5 g/L，琼脂15 g/L）。除LB培养基121 ℃高压灭菌30 min外，其余培养基均121 ℃高压灭菌20 min。

1.2　细菌发酵液及发酵滤液的制备

将供试细菌活化于LB^［19］平板上，37 ℃倒置培养12 h。挑取生长状态良好的单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，获得细菌发酵液（浓度为1×10⁸ CFU/mL）并用LB液体培养基稀释至所需浓度进行后续试验。将上述细菌发酵液8 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤菌体，获得细菌发酵滤液。

1.3　南方根结线虫J2及卵悬液的制备

选取1.1中温室培养的南方根结线虫病发病重的黄瓜根系，用1%（w/V）NaClO消毒3 min，无菌水冲洗3次，挑取单卵囊放入含无菌水的孵化池中，置于25 ℃条件下孵化，收集孵化的南方根结线虫J2悬液，用无菌水（ddH₂O）调节至所需浓度，用于杀线虫生防菌筛选试验^［14］。部分卵囊用无菌昆虫针挑破用于制备卵悬液，无菌水（ddH₂O）调节至所需浓度，用于卵孵化抑制试验^［25］。

1.4　防治南方根结线虫J2的生防细菌筛选

取不同供试细菌菌株发酵滤液400 μL加入24孔板中，每孔加入100 μL的线虫悬液（约30条南方根结线虫J2），设置加入等量LB液体培养基处理（LB）为对照。将24孔板放于25 ℃培养箱内培养12和24 h后，在体视显微镜（SMZ-161-BLED，沈阳宁远技术服务有限公司）下观察并记录线虫死亡数，毛针拨动无反应视为死亡，计算线虫死亡率和校正死亡率^［26］。

死亡率=死亡线虫总数/处理线虫总数×100%；

校正死亡率=（处理线虫死亡率-对照线虫死亡率）/（100-对照线虫死亡率）×100%。

选择24 h毒杀南方根结线虫校正死亡率≥80%以上的菌株进行复筛，每孔加入100 μL的线虫悬液（约100条南方根结线虫J2），其余试验流程同上，每个处理3次重复。

1.5　菌株Sneb2562的鉴定

采用平板划线法将菌株Sneb2562接种于LB平板上，37 ℃培养12 h形成单菌落后，观察菌落颜色、形状及透明度等形态学特征。并采用革兰氏染色法^［15］观察菌体颜色。

根据《常见细菌鉴定手册》^［27］及《伯杰细菌鉴定手册》^［28］对菌株Sneb2562进行甲基红、V-P、接触酶、氧化酶、硫化氢、淀粉水解、明胶液化、吲哚、柠檬酸盐、1%~7%（w/V）NaCl、pH 5.7等项目的生理生化特性测定。

参考Sutyak等^［29］方法提取Sneb2562的基因组DNA，使用引物27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492 R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）和gyrA F（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）、gyrA R（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）分别扩增Sneb2562的16S rDNA和gyrA序列，PCR反应体系（25 μL）：ddH₂O 8.5 μL，上下游引物各1 μL，细菌基因组DNA 2 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性90 s；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循环30次；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在NCBI数据库进行比对分析，利用MEGA 11软件以Neighbor-joining法构建系统发育进化树。将Sneb2562的16S rDNA和gyrA序列提交至GenBank，获得基因登录号。

1.6　Sneb2562发酵滤液对南方根结线虫卵孵化的影响

取400 μL Sneb2562发酵滤液于24孔板中，每孔加入100 μL的南方根结线虫卵悬液（约含200粒卵），以等量无菌水（ddH₂O）和LB液体培养基处理（LB）分别作为对照，每个处理3次重复。将24孔板放于25 ℃避光孵化，于24、48 h分别用体式显微镜观察卵孵化情况，计算卵孵化率和相对抑制率^［30］。

孵化率=（孵化线虫数/供试卵数）×100%；

相对抑制率=［（对照孵化率－处理孵化率）/对照孵化率］×100%。

1.7　Sneb2562的生防特性测定

取2 μL菌株Sneb2562发酵液接种至蛋白酶^［20］、磷酸酯酶^［21］、淀粉酶^［22］、几丁质酶^［23］、β-1，3葡聚糖酶^［19］、纤维素酶^［23］、解磷^［24］和解钾检测培养基中央，每个检测平板重复3次。28 ℃培养5 d后，观察菌落周围是否有透明圈产生，若有则证明待检测菌株具有相应活性。

1.8　Sneb2562发酵液对黄瓜种子萌发及胚根生长影响的测定

将健康饱满、大小相近的黄瓜种子用0.5%（w/V）NaClO消毒3 min，无菌水冲洗3次并晾干。将晾干的黄瓜种子放于Sneb2562发酵液中（浓度为1×10⁸ CFU/mL）浸泡处理5 min，取出晾干后整齐摆放于含无菌湿滤纸的培养皿中。分别以浸泡在等量无菌水（ddH₂O）和LB液体培养基（LB）中的种子作为对照，每个处理3次重复，每个重复25粒种子。将培养皿放于28 ℃保湿、避光催芽，以黄瓜种子露白长度≥1/2种子长度计为发芽，每天记录1次发芽种子数，培养5 d后，测量胚根长度，计算发芽率和发芽指数。

发芽率＝（发芽种子个数/25）×100%

发芽指数（GI）＝Σ（G_t/D_t）

式中：G_t为第t天的种子发芽数；D_t为相应发芽时间，d。

1.9　Sneb2562发酵液对黄瓜根结线虫病盆栽防效试验

挑选健康饱满、大小相近的黄瓜种子，0.5%（w/V）NaClO消毒3 min，无菌水冲洗3次后晾干。将晾干的黄瓜种子置于含无菌湿滤纸的培养皿中催芽，种子露白后播种于含灭菌基质土（w_基质∶w_沙＝1∶1）的育苗盘（4 cm×4 cm×9 cm）中。黄瓜幼苗长至两叶一心时，移栽至含灭菌营养土（w_基质∶w_沙∶w_土＝2∶2∶1）的塑料杯中，每个塑料杯1株黄瓜苗，将塑料杯随机放在25 ℃、16 h光/8 h暗的温室中 进行正常水肥管理。待黄瓜幼苗2片真叶完全展开后，采用灌根法^［31］，将Sneb2562发酵液（浓度为1×10⁸ CFU/mL）10 mL灌根接种于黄瓜苗根部，分别以等量清水（H₂O）、LB液体培养基（LB）、1.8%阿维菌素乳油1 000×稀释液（AVM）灌根处理作为对照，同时接种南方根结线虫J2悬液2 mL（约1 000条J2），每个处理5次重复，每个重复1株苗。将塑料杯随机摆放于25 ℃、16 h光/8 h暗的温室中并进行正常水肥管理，30 d后测量黄瓜植株的株高、株鲜重、根长、根鲜重，调查黄瓜植株的发病情况，统计根结数量，计算根结减退率、根结指数和防效。根结指数分级标准：0级，无根结；1级，须根有少量小根结；2级，须根有少量明显小根结、主根无根结；3级，须根有一些较大根结、主根无根结；4级，须根以大根结为主、主根无根结；5级，50%根系有根结、主根部分有根结；6级，主根出现较大根结；7级，所有主根有根结、根系未变形；8级，所有主根有根结、根系变形；9级，所有根系有根结；10级，所有根系根结严重、植株通常已死亡^［32］。

根结减退率＝［（对照根结数－处理根结数）/对照根结数］/×100%。

根结指数=［Σ（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）］×100%；

防效＝［（对照根结指数－处理根结指数）/对照根结指数］×100%。

1.10　Sneb2562发酵液对黄瓜根结线虫病田间防效试验

于2024年5月在辽宁省鞍山市海城市前公村（122°56′ E，41°06′ N）南方根结线虫病发病较重的温室大棚开展第1次田间试验，垄长4.00 m，垄间距0.40 m，植株间距0.25 m，每垄种植约12株黄瓜苗。同年6月在辽宁省沈阳市辽中区大黑岗子镇茨梅花岗子村（122°35′ E，41°44′ N）发病较重的温室大棚开展第2次田间试验，垄长6.00 m，垄间距0.65 m，植株间距0.30 m，每垄种植约12株黄瓜苗。种子处理方法同1.9，待黄瓜幼苗培养至四叶期后移栽至田间。移栽当天对黄瓜幼苗进行灌根处理，每株苗灌根200 mL Sneb2562发酵液10×稀释液（浓度为1×10⁷ CFU/mL），分别以等量清水（H₂O）、LB液体培养基（LB）、1.8%阿维菌素乳油1 000×稀释液（AVM）灌根处理为对照，每处理3次重复，每个重复4株黄瓜苗，试验小区随机分布。处理30 d后，将黄瓜植株挖出，保留完整根系，测量生理指标，调查所有黄瓜植株的发病情况，计算根结指数和防效，计算公式同1.9。

1.11　数据统计分析

采用Excel 2021和SPSS statistics 27.0软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法（P<0.05）进行差异显著性分析。

2　结果与分析

2.1　南方根结线虫生防细菌的筛选

由表1可知，52株细菌发酵滤液处理24 h后，对南方根结线虫J2的校正死亡率>80%的有2株，71%~80%的菌株有8株，61%~70%的菌株有4株。以细菌发酵滤液处理24 h时，J2的校正死亡率>80%为复筛标准，选取2个菌株进行复筛。2个细菌菌株发酵滤液对南方根结线虫J2有高毒杀活性，其致死效果随着处理时间的增加而增强；其中，Sneb2562处理12、24 h时J2校正死亡率均为最高，分别为23.46%、79.25%（表2）。因此，选择菌株Sneb2562为研究对象进行后续试验。

2.2　菌株Sneb2562的鉴定

由图1可知，Sneb2562在LB培养基上形成的菌落呈圆形或近圆形，初期呈白色不透明，表面湿润有黏性，后期菌落呈淡黄色，表面皱缩干燥。菌株Sneb2562革兰氏染色后菌体呈紫色，为革兰氏阳性菌。

由表3可知，Sneb2562具有淀粉水解、明胶液化的能力，不产吲哚和H₂S，接触酶反应和VP反应呈阳性，在pH 5.7及1%~7%（w/V） NaCl条件下均能生长，可初步确定Sneb2562为芽胞杆菌属。

通过16S rDNA序列测序分析构建了Sneb2562的16S rDNA系统发育树。Sneb2562与贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）具有较高的同源性（图2（a））。为了进一步确定Sneb2562的分类地位，构建了Sneb2562的gyrA序列系统发育树，Sneb2562与贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）具有较高的同源性（图2（b））。Sneb2562的16S rDNA和gyrA基因序列已提交GenBank数据库，登录号分别为PQ892074和PV089818。

因此，结合形态学特征（图1）、生理生化特性（表3）和分子生物学（图2）分析，将Sneb2562鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）。

2.3　Sneb2562发酵滤液对南方根结线虫卵孵化的影响

由图3可知，Sneb2562发酵滤液处理显著抑制南方根结线虫卵孵化，抑制率随处理时间的延长呈上升趋势。处理24 h时，无菌水（ddH₂O）和LB液体培养基（LB）的卵孵化率分别为13.90%和13.08%。与LB相比，Sneb2562发酵滤液处理后南方根结线虫卵孵化率降低68.88%（P<0.05）；处理48 h时，Sneb2562发酵滤液的南方根结线虫卵孵化率为5.26%，均显著低于ddH₂O和LB处理，抑制率为77.58%（P<0.05）。

2.4　Sneb2562生防特性分析

由图4可知，培养5 d后，Sneb2562在蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶、解磷检测培养基上均能产生透明圈，说明Sneb2562具有产蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶和解磷能力；在几丁质酶、纤维素酶、β-1，3葡聚糖酶、解钾检测培养基上均无透明圈的产生，说明菌株Sneb2562没有产几丁质酶、纤维素酶、β-1，3葡聚糖酶及解钾能力。

2.5　Sneb2562发酵液对黄瓜种子萌发及生长的影响

由图5和表4可知，Sneb2562发酵液处理可显著提高黄瓜种子发芽指数，但对种子的发芽率和胚根长度无显著影响。培养5 d后，无菌水（ddH₂O）和LB液体培养基处理（LB）的发芽指数分别为2.29和2.44，经Sneb2562处理的黄瓜种子发芽指数为2.57，与LB相比，发芽指数升高4.8%，发芽率、胚根长度则均无显著差异（P>0.05）。

2.6　Sneb2562发酵液对黄瓜根结线虫病的盆栽防效分析

由表5可知，接种南方根结线虫J2 30 d后，清水（H₂O）和LB液体培养基（LB）处理的根结数量分别为110.60和101.20，根结指数分别为98.00和94.00，经Sneb2562发酵液和阿维菌素（AVM）处理的黄瓜植株的根结数量分别降低至55.00和43.00（P<0.05），根结指数分别降低为48.00和38.00（P<0.05），根结减退率分别为50.27%和61.12%，防效分别为52.00%和62.00%。此外，与LB相比，Sneb2562发酵液处理的黄瓜地上部分的株高、株鲜重分别增加16.05%、63.68%（P<0.05），根长及根鲜重则与LB无显著差异。因此，在盆栽条件下，Sneb2562发酵液能有效防治黄瓜根结线虫病，并对黄瓜植株的生长具有促进作用。

2.7　Sneb2562发酵液对黄瓜根结线虫病的大田防效分析

由表6可知，2024年第1次田间试验结果表明，在黄瓜移栽至田间30 d后，清水（H₂O）和LB液体培养基（LB）的根结指数分别为95.83和91.67，阿维菌素乳油1 000×稀释液（AVM）和Sneb2562发酵液处理后，黄瓜植株的根结指数较LB均显著下降，分别为52.78和55.56（P<0.05）；防效分别为44.93%和42.03%，Sneb2562与AVM处理的防效无显著差异。同时，Sneb2562发酵液处理的黄瓜植株的株鲜重比LB增加4.01%（P<0.05），株高、根长和根鲜重分别增加3.95%、4.54%和1.45%，但差异均未达显著水平。2024年第2次田间试验得到了类似的试验结果。在黄瓜移栽至田间30 d后，AVM处理的根结指数为46.91，Sneb2562发酵液处理的根结指数为45.68，均显著低于LB（96.30）（P<0.05）；Sneb2562防效为53.75%，略高于AVM的防效（52.50%）。同时，经Sneb2562发酵液处理的黄瓜植株的株高、株鲜重均显著高于LB（P<0.05），分别增加25.18 cm、29.41 g；根长和根鲜重与LB无显著差异。综上，贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562在田间能够有效防治黄瓜根结线虫病，并能够促进黄瓜植株的生长。

3　讨 论

随着设施蔬菜的连作障碍日益加重，根结线虫危害日益加剧^［33］。化学农药的过度使用造成环境污染、线虫抗药性增强、危害人类健康和破坏生态平衡等问题，因此，利用芽胞杆菌开发生物杀线剂，以生物防治的方式来应对根结线虫危害，已成为根结线虫病害防治的重要研究方向之一^［34］。芽胞杆菌作为生态环境中的优势微生物种群，能分泌多种次生代谢产物，是其发挥生防功效的重要机制之一^［35］。Tian等^［36］研究发现，贝莱斯芽胞杆菌Bv-25产生的挥发性有机物2-庚酮、3-甲基硫代丁酸S-甲酯、二甲基二硫化物、三氯甲烷和2，6-二甲基吡嗪等对南方根结线虫均具有抑制作用。短小芽胞杆菌S1-10产生的2-甲氨基乙醇对南方根结线虫有很强的熏蒸活性^［37］。巨大芽胞杆菌GIUBAM-2020的次生代谢物2-（乙基-咪唑基）乙酸盐酸盐对南方根结线虫J2具有致死效果^［38］。Chen等^［39］从阿氏芽胞杆菌MCCC 1K02966发酵液中鉴定出硫代乙酸甲酯，其对南方根结线虫有触杀、熏蒸、趋避及抑制卵孵化的作用。本研究发现贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562在体外表现出良好的毒杀J2活性和抑制卵孵化的效果，其代谢产物中毒杀线虫的活性物质仍有待深入研究。

芽胞杆菌能产生胞外酶、有机酸、铁载体等物质，改善土壤结构，加快氮、磷、钾、铁等营养元素转化^［40］，从而促进作物生长^［41］。袁洪波等^［42］研究发现，贝莱斯芽胞杆菌P2-1具有蛋白酶和纤维素酶活性，可分解草莓褐色叶斑病菌细胞壁，抑制菌丝生长，还能促进草莓植株生长。王海霞等^［43］研究发现，解淀粉芽胞杆菌YN-J3能够通过解磷、解钾和产生吲哚乙酸等方式促进燕麦生长。枯草芽胞杆菌CLB-17能产生蛋白酶、葡聚糖酶、磷酸酯酶及铁载体，对烟草的生长具有促进作用^［44］。Margalef等^［45］研究表明，磷酸酯酶能将不可利用的磷转化为可同化的磷，与促进植物生长密切相关。本研究发现贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562能分泌蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶并具有解磷能力，盆栽和田间条件下均能显著促进黄瓜植株生长，但其促生机制还需进一步研究解析。

生防菌的施用方式多样，不同施用方式对其在寄主体内的吸收、传播和活性影响不同，进而影响其防治效果^［46］。因此，研究生防菌的施用方式是十分关键的。周园园等^［47］利用巨大芽胞杆菌Sneb207包衣处理大豆种子可降低大豆根及周围土壤中的胞囊数量。贝莱斯芽胞杆菌TB-68灌根处理对烟草根结线虫病防效可达64.4%^［48］。孙孟娇等^［49］通过研究贝莱斯芽胞杆菌P87不同施用方式对松材线虫病防治效果的影响发现，树干注射方式的防治效果可达96.5%，显著高于喷雾和灌根方式。本研究结果表明，贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562发酵液灌根处理黄瓜植株，能有效防控黄瓜根结线虫病。在农业生产中，灌根处理是防治线虫病害比较高效的方法，后续可以开展贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562的不同施用方法对根结线虫病的防效试验，以探明该菌株在大田生产中的最佳施用方式。

4　结 论

从52株细菌中筛选得到1株可有效拮抗南方根结线虫的贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562，处理24 h的南方根结线虫J2校正死亡率为79.25%，48 h卵孵化抑制率为77.58%，具有产蛋白酶、磷酸酯酶、淀粉酶和解磷能力，不影响黄瓜种子萌发及胚根生长，盆栽试验防效为52.00%，2次田间试验防效分别为42.03%和53.73%，对黄瓜植株生长具有促进作用，贝莱斯芽胞杆菌Sneb2562在防治黄瓜根结线虫病方面具有良好的应用前景。

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基金资助

中国博士后科学基金(2022T150442)

中国博士后科学基金(2021M692234)

国家寄生虫资源库(NPRC-2019-194-30)

国家自然科学基金(32372481)