两株菌及其组合对苹果再植病的防效

Efficacy of two biocontrol strains and their combination against apple replant disease

摘要

为构建可高效防治苹果再植病的生防菌组合，将已筛选获得的拮抗菌‘H166’和促生菌‘C35’进行亲和性鉴定并构建组合菌；通过室内试验测定组合菌对尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢菌（F. solani）、层出镰孢菌（F. proliferatum）和串珠镰孢菌（F. moniliforme）4种病原镰孢菌的抑菌活性，并测定组合菌的发酵液、无菌滤液和胞外代谢产物对尖镰孢菌孢子萌发，及组合菌发酵液对上述4种病原镰孢菌菌丝形态的影响和对其他植物病原菌的抑菌作用；通过盆栽和田间试验测定组合菌对苹果再植病的防治效果。结果表明：拮抗菌‘H166’（解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens）和促生菌‘C35’（铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）的亲和性良好，2个菌株按1∶1体积比构建组合菌‘H166+C35’。组合菌的无菌滤液对尖镰孢菌、腐皮镰孢菌和层出镰孢菌的抑菌率分别为58.33%、36.88%和44.25%。电子显微镜观察发现，‘H166’、‘C35’和‘H166+C35’处理均可导致4种病原镰孢菌的菌丝分枝、断裂和膨大。与无菌水处理孢子萌发率（98.44%）相比，‘H166+C35’的发酵液、无菌滤液及胞外代谢产物均可显著抑制尖镰孢菌孢子萌发，萌发率分别为52.66%、19.75%和12.88%。抑菌谱试验表明，‘H166+C35’对葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、链格孢菌（Alternaria alternata）的抑制效果均显著优于‘H166’、‘C35’的单菌处理，抑菌率均高达71％以上。盆栽试验中，‘H166+C35’处理的八棱海棠株高、根长、根鲜重及侧根数分别比清水处理升高20.07%、47.23%、64.33%和68.54%，保护与治疗效果分别达74.82%和68.15%。田间试验调查显示，‘H166+C35’处理八棱海棠的死苗率为0%，显著低于‘H166’（10%）、‘C35’（30%）及清水处理（50%）的死苗率。综上，组合菌‘H166+C35’可通过破坏病原菌菌丝结构、抑制孢子萌发，降低苹果再植病的发生，增强植株的抗性，可开发成菌剂应用苹果再植病的生物防治。

Abstract

To construct a combination of biocontrol bacteria with efficient prevention and control effects on apple replanting disease， the antagonistic bacterium ‘H166’ and growth-promoting bacterium ‘C35’ obtained from previous screening were identified for affinity and a combination of bacteria was constructed. Through indoor experiments， the antibacterial activity of the combination bacteria against four pathogenic fungi， namely Fusarium oxysporum， F. solani， F. proliferatum， and F. moniliforme，and the effects of the fermentation broth， sterile filtrate， and extracellular metabolites of the combination bacteria on the spore germination of F. oxysporum and the mycelial morphology of the four pathogenic F. oxysporum strains mentioned above， as well as their antibacterial effects on other plant pathogens were determined pot and field experiments were adopted to investigate the prevention and control effect of combined bacteria on apple replanting disease. The results showed that：The antagonistic bacterium ‘H166’ （Bacillus amyloliquefaciens） exhibited good affinity with the growth-promoting bacterium ‘C35’（Pseudomonas aeruginosa）. The two bacterial strains were combined as ‘H166+C35’ at a 1：1 volume ratio. The antibacterial rates of the sterile filtrate of the combination bacteria against F. oxysporum， F. solani and F. proliferatum were 58.33%， 36.88%， and 44.25%， respectively. Electron microscopy revealed that the combination of bacteria caused hyphal branching， breakage and enlargement of four pathogenic fungi. The fermentation broth， sterile filtrate， and extracellular metabolites of the combination bacteria can significantly inhibit the spore germination of the Fusarium oxysporum， with germination rates of 52.66%， 19.75%， and 12.88%， respectively， compared to sterile water （ 98.44%）. The bacterial combination showed stronger inhibitory effects on Botryosphaeria dothidea and Alternaria alternata than single bacterium， and the inhibition rates are all over 71%. In the pot experiment， the height， root length， root fresh weight and number of lateral roots of the eight-edge crabapple（Malus robusta Rehd.） treated with the combination bacteria increased by 20.07%， 47.23%， 64.33%， and 68.54%， respectively， compared to water treatment. The protective and therapeutic effects reached 74.82% and 68.15%， respectively. Field experiments discovered that the death rate of seedlings treated with the combination bacteria is 0%， which was significantly lower than that of a single strain （‘H166’ 10% and ‘C35’ 30%） and the water treatment （50%）. In summary， the ‘H166+C35’ combination reduces apple replanting disease by disrupting fungal hyphae， inhibiting spore germination， and enhancing plant resistance， demonstrating potential for production control.

Graphical abstract

关键词

苹果再植病 / 镰孢菌 / 生防细菌 / 组合菌 / 防治效果

Key words

apple replant disease / Fusarium spp. / biocontrol bacteria / combined bacteria / control efficacy

中国是全球最大的苹果生产国，种植面积达198万hm^2［1］，近年来由于耕地资源的限制和农业政策的调整，我国苹果主产区扩展新果园较为困难，导致果农不得不对老果园进行原址重建，并重复利用果树苗圃，这种现象导致了苹果再植病的严重发生^［2］。苹果再植病，又称连作障碍，是指在相同地块连续种植苹果树后，导致新植果树生长不良的一种病害，该病可导致再植果树生长缓慢、根系受损、树木活力减弱，并引发严重的病虫害问题，最终导致果实品质下降和产量降低^［3-4］，严重时，再植苹果树的死亡率可高达50%^［5-6］，给果农带来重大经济损失^［7-8］，已成为我国苹果产业可持续发展的重要限制因素^［9-10］。

苹果再植病在世界范围内普遍发生^［11］，尽管不同地区的发病程度和致病菌种类有所差异，但多项研究表明，镰孢属（Fusarium）、柱孢属（Cylindrocarpon）、丝核菌属（Rhizoctonia）、疫霉菌属（Phytophthora）和腐霉菌属（Pythium）等真菌及卵菌在我国的多个苹果产区分别被确认为主要致病菌^［12-13］。已有研究表明，镰孢属真菌是引起河北省苹果再植病的主要致病菌^［14］，也是西北黄土高原地区苹果再植病的主要致病菌^［15-16］，通过分泌毒素或侵染根系，导致植株生长受阻，其丰度与苹果再植病的严重程度呈显著正相关^［17-18］。王功帅^［19］的研究进一步证实，尖孢镰孢菌、层出镰孢菌、腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌4种病原镰孢菌对苹果砧木平邑甜茶（Malus hupehensis var. pingyiensis）具有强烈的致病性，与未接种病原菌相比，接种1个月后幼苗的干重分别减少了35.60%、51.92%、40.96%和40.96%。目前，我国防治苹果再植病主要依靠化学药剂熏蒸，与其他作物进行轮作和间作，以及施用拮抗微生物等措施^［20］。化学药剂熏蒸虽然见效快，但对环境污染较大，且容易导致病原菌产生抗药性；轮作和间作虽然环保，但实施周期较长，且受限于土地资源；单一拮抗微生物防治效果不稳定，难以满足大规模生产需求^［21］。因此，筛选并构建高效的生防菌组合，既能克服单一微生物的局限性，又能减少对环境的污染，对防控苹果再植病具有重要意义。

目前，国内外关于生防菌组合防治植物病害的研究报道已有很多，这些研究表明生防菌组合通过多种微生物的协同作用，能够更全面地抑制病原菌的生长，同时促进植物健康生长^［22］。马志远等^［23］以47株降解菌和1株生防菌类芽胞杆菌为基础，通过亲和性试验构建了Z₁、Z₂、Z₃和Z₄等4个组合菌，其中组合菌Z₁的综合防治效果最好，可促进番茄的生长，提高产量，对番茄灰霉病的防治效果为27.92%。董琼娥等^［24］用组合菌培养物萃取液为试材，分别鉴定了单一菌和组合菌对草莓白粉病的防治效果，结果表明组合菌的防治效果最好，在5次施用后防效可高达94.0%。陈哲等^［25］利用盆栽试验证实，组合菌对草莓炭疽病有明显的抑制效果，抑制率为68.69%，与化学农药相比，抑制效果升高23.63%。

课题组前期研究中从苹果根际土壤中分离获得的拮抗菌‘H166’鉴定为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），促生菌‘C35’鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。目前，基于这2个菌株组合防效的相关研究尚未见报道。本研究对2个菌株的亲和性进行鉴定并构建组合菌，通过室内相关试验测定组合菌的抑菌活性，并通过盆栽和田间试验鉴定组合菌对苹果再植病的综合防效，旨在构建出高效的生防菌组合，明确该菌株组合对镰孢菌的抑制作用，及对苹果再植病的防治效果，以期为苹果再植病的生物防治提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料

尖镰孢菌（F. oxysporum）、层出镰孢菌（F. proliferatum）、串珠镰孢菌（F. moniliforme）、腐皮镰孢菌（F. solani）、假禾谷镰孢菌（F. pseudograminearum）、链格孢菌（Alternaria alternata）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、黑腐皮壳菌（Valsa mali）、疫霉菌（Phytophthora capsici）、褐座坚壳菌（Rosellinia necatrix）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、粉红聚端孢菌（Trichothecium roseum）均由河北农业大学植物保护学院苹果病害与病害流行学创新团队提供，-80 ℃保存菌种，使用前在PDA培养基上活化和纯化。拮抗菌‘H166’和促生菌‘C35’是从河北农业大学植物保护学院苹果病害与病害流行学创新团队苹果试验园（38.827° N，15.447° E，海拔17.2 m）中健康苹果树根际土壤中分离获得。

八棱海棠（Malus robusta Rehd.）种子购买自河北省怀来县好运八棱海棠苗木基地。本试验中使用的培养基有PDA、PDB、LB固体和液体培养基^［26-27］；解磷培养基^［28］；固氮培养基^［29］；CAS检测培养基和刚果红液体培养基^［30］。

1.2　两株菌的拮抗及促生效果测试

采用平板对峙法^［31］测定2个菌株对苹果再植病原尖镰孢菌‘HS2’的抑制作用，将尖镰孢菌的菌饼接种在PDA培养基中心，在距离菌饼约2.5 cm处2个不同方向放置无菌滤纸片，滤纸片上分别接种1 μL的2株菌发酵液，以只接种病原菌的处理为对照（CK₁），每个处理3个重复，28 ℃培养4~5 d，计算抑菌率，抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

将2株菌发酵液接种在解磷、固氮、CAS检测等功能培养基，以及含有50 mL刚果红液体培养基中进行培养，检测菌株能否在功能培养基上产生透明圈以及在刚果红液体培养基中分泌IAA，若菌株产生透明圈和分泌IAA，则表明具有促生能力。

1.3　组合菌的构建

采用十字交叉法和混毒平板法测定2个菌株的亲和性，并通过微生物生长分析仪测定单菌株和混合菌株的生长曲线^［31］。2个菌株单独发酵后，调节菌液浓度为1×10⁸ CFU/mL，按1∶1体积比混合获得组合菌。

1.4　组合菌无菌滤液对病原镰孢菌抑菌活性的测定

将组合菌发酵液离心后，上清液经d=0.22 μm细菌过滤器得无菌滤液，将无菌滤液按10%（V/V）加入PDA培养基中制备平板，待平板冷却后，挑取病原镰孢菌的菌饼至PDA平板中心，以加ddH₂O的PDA平板为对照（CK₂），每个处理3次重复。待CK₂的菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量各处理组的菌落直径（d），计算抑菌率，抑菌率公式同1.2。

1.5　组合菌对病原菌孢子萌发及菌丝形态的影响

参考Duan等^［32］的方法，测定组合菌对病原尖镰孢菌孢子萌发的影响，设置ddH₂O（CK₃）、发酵液（FB）、无菌滤液（CFCF）、粗提物（CE）4个处理，再将上述每个处理的混合液充分混匀，吸取30 μL置显微镜载玻片上，每个处理重复3次，28 ℃倒置培养13 h后，观察各处理的孢子萌发情况。孢子萌发率=（萌发孢子个数/调查孢子总个数）×100%。

组合菌分别与4种病原镰孢菌对峙培养5 d后，用灭菌刀片将对峙处培养基切成薄片，置于载玻片上，于电子显微镜下观察病原菌菌丝形态变化，以在PDA平板上正常生长的菌丝为对照（CK₄），放大倍数为1 000×。

1.6　组合菌抑菌谱测定

取不同植物病原真菌菌饼至PDA平板中心，在距离菌饼2.5 ㎝处左、右2个方向放置d=5 mm无菌滤纸片，在滤纸片上滴加1 μL的组合菌发酵液，以只接种病原菌的处理为对照（CK₅），每个处理重复3次，28 ℃倒置培养5~7 d，待CK₅的菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量各处理组的菌落直径（d），计算抑菌率，抑菌率公式同1.2。

1.7　组合菌室内生防效果测定

1.7.1　组合菌对盆栽海棠苗的促生作用

2023年，于河北农业大学植物保护学院苹果病害与病害流行学创新团队苹果试验园（N纬度38.827°，经度E115.447°，海拔17.2 m）温室中进行试验，以苹果砧木八棱海棠作为试验材料，在提前育好的海棠苗上，挑选叶片（4叶期）大小、长势一致的海棠幼苗进行试验，采用灌根的方式将组合菌发酵液（1×10⁸ CFU/mL）灌入海棠苗的根部，灌根量为50 mL/株，以清水灌根处理为对照（CK₆），每个处理3个重复，10株/重复。处理30 d后，统计株高、鲜重、叶片数、主根长、侧根数等指标。

1.7.2　组合菌对盆栽海棠苗的防治效果

保护效果试验处理：选择叶片大小、长势较一致的4叶期八棱海棠苗进行试验，首先将组合菌与单一菌发酵液（1×10⁸ CFU/mL）灌入八棱海棠苗的根部，灌根量为50 mL/株，24 h后再向八棱海棠苗根部灌入50 mL病原尖镰孢菌‘HS2’孢子悬浮液（7.5×10⁶ 个/mL）。治疗效果试验处理：将50 mL尖镰孢菌‘HS2’孢子悬浮液（7.5×10⁶ 个/mL）灌入八棱海棠苗根部，24 h后，向被病原菌灌根过的八棱海棠苗根部分别灌入组合菌和单一菌的发酵液（1×10⁸ CFU/mL），灌根量均为50 mL/株。保护效果和治疗效果均以尖镰孢菌孢子悬浮液灌根处理为阴性对照（CK₇），以‘木美土里’复合微生物菌剂灌根处理为阳性对照（KMM₁），10株海棠苗为1个重复，每个处理3次重复。接种30 d后，测量植株的形态指标、生理指标，并评估植株的发病程度，计算病情指数和防治效果。病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值×100），防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

病害分级标准参照张艳杰^［33］和Mohd-Yusuf^［34］的方法，略有改动。评估标准如下，0级：植株完全健康；1级：叶片开始出现发黄现象，发病叶片的数量少于植株总叶片数的1/8；2级：叶片发黄现象更加明显，发病叶片的数量占植株总叶片数的1/8~1/4；3级：叶片发黄严重，发病叶片的数量占植株总叶片数的1/4~1/2；4级：植株整体出现萎蔫，部分叶片干枯，发病叶片的数量超过植株总叶片数的1/2。

1.8　组合菌田间防治效果评价

2024年，于河北农业大学苹果试验园中开展田间试验，种植八棱海棠苗的地块为12年连续种植海棠苗的重茬地块，首先对重茬地块进行除草、翻耕。2024年3月中旬，将在温室培育的8叶期海棠苗移栽至田间重茬地块。移栽48 h后，对海棠苗进行灌根处理，将组合菌和单一菌（浓度均为1×10⁸ CFU/mL）分别灌入海棠苗根部土壤中，灌根量为300 mL/株，以清水处理作为阴性对照（CK₈），以‘木美土里’复合微生物菌剂处理作为阳性对照（KMM₂），重复3次，每个重复10株海棠苗，每隔10 d灌根1次。在灌根后的第30、60和90 天分别测量海棠的株高、茎粗、相对叶绿素含量（SPAD）、叶片数和死苗率，死苗率=（死苗植株数/调查植株总数）×100%。

2　结果与分析

2.1　两株菌的拮抗效果及促生潜力

由图1可知，菌株‘C35’能在解磷、固氮、嗜铁培养基上产生透明圈，并具有分泌IAA的能力，说明该菌株具有促生潜力，同时能够降低尖镰孢菌色素的产生。菌株‘H166’在解磷、固氮培养基上未产生透明圈，说明不具有解磷、固氮功能；在嗜铁培养基上产生透明圈，表明具有嗜铁功能，对尖镰孢菌的抑制率达到71.30%。

2.2　两株菌的亲和性

由图2可知，在LB固体培养基上，菌株‘H166’和‘C35’在交叉位置均可以生长（a），在混毒平板上未出现清晰可见的抑菌圈（b），说明两株菌之间无拮抗作用，具有亲和性。‘C35’生长速度最快，‘H166’次之，2个菌株复合之后介于二者之间，说明2个菌株之间没有明显的拮抗作用（c），可进行组合。

2.3　组合菌无菌滤液对病原镰孢菌的抑菌活性

由表1可知，组合菌无菌滤液对4种病原镰孢菌菌丝生长均具有显著的抑制效果。其中，对尖镰孢菌‘HS2’、腐皮镰孢菌和层出镰孢菌的抑菌率均较高，抑菌率分别为58.33%、36.88%、44.25%，与‘H166’和‘C35’处理相比差异均显著，组合菌能显著降低病原菌生长速度。虽然组合菌对串珠镰孢菌抑菌效果不佳，仅为8.76%，但还是优于2个单一菌株的抑制效果，菌株‘C35’和‘H166’抑菌率分别为4.79%、7.01%。

2.4　组合菌对病原菌孢子萌发及菌丝形态的影响

由图3可知，‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’处理均能显著抑制病原尖镰孢菌孢子萌发。‘H166+C35’的发酵液、无菌滤液及胞外代谢产物处理后，孢子萌发率分别为52.66%、19.75%和12.88%，显著低于对照（CK₃）孢子萌发率（98.44%）。其中以‘H166’发酵液处理的孢子萌发率最低，为7.01%；其次是‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’的胞外代谢产物处理，孢子萌发率分别为14.81%、16.82%、12.89%。

由图4可知，‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’的发酵液与尖镰孢菌（F. oxysporum）、腐皮镰孢菌（F. solani）、层出镰孢菌（F. proliferatum）和串珠镰孢菌（F. moniliforme）4种病原镰孢菌对峙培养后，与PDA平板培养菌丝（CK₄）相比，菌丝分枝较多，呈不规则状、厚度不均、呈现皱缩、膨大、变薄、断裂等现象。

2.5　组合菌的抑菌谱

由表2可知，‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’处理对多种植物病原真菌均具有显著的抑菌效果。其中，‘C35’、‘H166+C35’对疫霉菌和粉红聚端孢的抑菌较高，均>80%。‘C35’、‘H166’和‘H166+C35’对白纹羽束丝菌的抑菌率均在71%~80%，‘C35’和‘H166+C35’对腐皮镰孢菌的抑菌率都在71%~80%。针对串珠镰孢菌、链格孢菌、疫霉菌、葡萄座腔菌这4种病原菌，组合菌抑菌效果优于‘C35’、‘H166’单菌处理。综上，‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’处理对多种植物病原真菌均具有不同程度的抑制作用，抑菌谱均较广。

2.6　组合菌对盆栽八棱海棠苗的促生作用

由表3可知，‘H166+C35’灌根处理的八棱海棠在株高、根长、叶片数、总鲜重、根鲜重、根干重、SPAD和侧根数分别比对照（CK₆）升高20.07%、47.23%、81.47%、64.33%、57.65%、22.41%和68.54%；‘H166’处理的八棱海棠株高、根长、总鲜重、根鲜重、根干重、SPAD和侧根数分别比CK₆高19.92%、22.05%、60.54%、42.46%、26.57%、22.36%和15.54%，‘C35’的八棱海棠株高、根长、总鲜重、根鲜重、根干重、SPAD和侧根数分别比CK₆高40.21%、33.40%、93.69%、49.18%、55.63%、26.26%、61.14%。‘H166+C35’在根长、根鲜重、根干重和侧根数方面上均优于‘H166’和‘C35’单菌处理。综上，组合菌‘H166+C35’处理对八棱海棠植株具有一定的促生作用。

2.7　组合菌对盆栽八棱海棠苗的防治效果

由表4可知，‘H166+C35’对尖镰孢菌引起的再植病害具有显著的防治效果。‘H166+C35’处理的八棱海棠幼苗病情指数仅为20.37，显著低于对照组（CK₇）病情指数（80.55），预防效果达74.82%，防效略低于‘H166’（77.04%）。并且该组合菌的保护效果与阳性对照‘木美土里’复合微生物菌剂（KMM₁）相比无显著差异（P>0.05），对八棱海棠苗的保护效果仅次于KMM₁。经过浓度为7.5×10⁶ 个/mL的尖镰孢菌孢子悬浮液灌根接种48 h后，再将‘H166+C35’发酵液灌入八棱海棠苗的根部，处理30 d后发现该组合菌处理的病情指数为25.92，治疗效果为68.15%，优于‘C35’（53.33%），与‘H166’处理的治疗效果（69.26%）相当，并且 ‘H166’与‘H166+C35’、KMM₁相比，其治疗效果也无显著差异。综上，‘C35’、‘H166’、‘H166+C35’均可以显著降低尖镰孢菌对八棱海棠苗的进一步侵害。

2.8　组合菌田间防治效果的评价

由表5可知，‘H166+C35’和‘H166’处理第30、60、90天的八棱海棠植株在株高、茎粗、SPAD均显著高于清水灌根的对照（CK₈），但叶片数无显著差异。随着处理时间的延长，各处理八棱海棠植株的各项生长指标均显著高于CK₈，说明不同处理降低了病原菌对八棱海棠植株的侵染。同时发现‘木美土里’复合微生物菌剂（KMM₂）和‘H166+C35’处理的海棠植株无死苗率，而‘H166’和‘C35’处理的海棠植株出现了死苗率，死苗率分别为10%和30%，但显著低于CK₈的死苗率（50%），说明‘H166+C35’的田间防治效果要优于2个单一菌株。综上所述，KMM₂与‘H166’对海棠苗具有一定的保护作用，可以降低八棱海棠的死苗率，并且在一定程度上促进了八棱海棠苗的生长。

3　讨 论

3.1　生防菌的拮抗特性

根际微生物是抵御植物病原菌在土壤中传播的第一道防线，是一个主要的植物病害生物防治来源，可直接形成抗受力蛋白和脂肽类等生物活性产物^［35-36］，间接诱导植物分泌功能性物质，激发其抵抗能力等，在防治植物病害方面发挥着重要作用^［37］。高娃等^［38］研究结果证明，解淀粉芽胞杆菌‘TF28’抗菌蛋白Tas A基因的表达产物能有效抑制黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）和柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri pv.citri）的侵染。本研究测定了‘C35’和‘H166’对病原尖镰孢菌‘HS2’的拮抗能力，发现2个菌株均具有不同程度的拮抗作用，其中‘C35’还能够降低尖镰孢菌‘HS2’色素的产生，当2个菌株及其组合在与病原镰孢菌对峙培养时，可导致菌丝膨大、皱缩和断裂，并且‘C35’、H166’、‘H166+C35’的发酵液和无菌滤液以及胞外代谢产物均可以显著降低病原菌孢子的萌发。推测，2个菌株及其组合菌的抗菌作用可能是由于产生了某种抗菌物质，进而显著抑制病原镰孢菌的生长，但造成这种抑制作用的特定抗菌蛋白或脂肽类物质目前了解不多。因此，今后应对2个菌株所产生的脂肽类物质进一步深入研究和分析，还应利用PCR 特异性扩增技术，确认菌株编码的生物防治功能基因类型，如bmyB、fenD、srfAA和srfAB。此外，还可用不同饱和度的硫酸铵对其发酵产物的粗提取物进一步进行抗菌试验，以确定菌株产生的抗菌蛋白类型。

3.2　生防菌的促生特性

刘彩霞等^［39］研究表明，生防菌大多数具有固氮、溶磷、溶钾和拮抗植物病原菌等多种功能。如成团泛菌‘XD20’的特性包括固氮、产生铁载体、溶解磷和产生吲哚乙酸（IAA），当成团泛菌‘XD20’接种到不同类型的甘蔗品种上，不仅能够使株高增加，还能提高植物叶片中叶绿素的含量，增强谷氨酰胺合成酶活力进而提高生物量等^［40］；从柠条根系中分离出的泛菌‘C9’能分泌有机酸，溶解土壤中的难溶性磷，从而提高磷的可用性^［41］。Liu等^［42］研究表明根际促生菌主要是通过产生嗜铁素和IAA等物质来促进植物的生长。本研究分析了‘C35’和‘H166’在溶磷、固氮、嗜铁和分泌IAA等方面的特性，发现‘C35’具有解磷、固氮、嗜铁和分泌IAA的能力，对海棠苗具有较强的促生作用，‘C35’处理八棱海棠苗后，其株高、根干重、侧根数相较于清水对照（CK₆）分别升高了40.21%、55.63%、61.14%。‘H166’不具有解磷、固氮功能，但有嗜铁功能，其处理的八棱海棠苗株高、根干重和侧根数分别比CK₆高19.92%、26.57%和15.54%，促生效果要低于‘C35’。后续，应对‘C35’和‘H166’分泌IAA的情况进行定量检测，以阐明菌株促进植物生长的特性。

3.3　组合菌的防治效果

本研究结果发现，组合菌不仅对促进植物生长具有积极作用，可显著提高植物SPAD、产量和土壤微生物多样性，提高土壤酶活性，对病害也有显著的抑制作用，与雷先德等^［43］研究结果相似。傅春风^［44］将筛选到的PGPR（plant growth-promoting rhizobacteria）细菌菌株的组合菌施用于烟草的根部，可降低烟草黑胫病的发生，防治效果达到了49.05%；李苗苗等^［45］研究发现，组合菌‘GY1+GY10+GY12’使用对烟草黑胫病的防治效果达到74.53%，分别比单独施用‘GY1’、‘GY10’和‘GY12’高15.34%、27.42%和44.94%。Zheng等^［46］研究表明，3种菌株组合‘FGD5-2+HCH2-3+MTD4-1’处理烟草防病效果最好，可将发病时间推迟8~10 d，在田间病害发生较轻的情况下，防病效果可达50%以上。本研究同时测定了‘H166+C35’‘C35’‘H166’对八棱海棠苗的保护和治疗效果，发现经组合菌与单菌处理的海棠苗均较尖镰孢菌孢子悬浮液处理（CK₇）发病轻，保护效果均达67%以上，治疗效果均在53%以上，显著降低了病原菌对海棠苗的侵染。在本试验中，发现‘H166+C35’的促生作用比‘C35’稍差，防治效果比‘H166’稍差，其原因尚不清楚。因此，在后续试验中，应进一步分析2个菌株的生防机制，以明确组合菌的内部作用机制。

4　结 论

解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）‘H166’表现出显著的拮抗特性，能够有效抑制病原镰孢菌的生长。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）‘C35’则能够通过解磷、固氮、嗜铁和分泌IAA等机制促进八棱海棠苗的生长。2个菌株具有亲和性，按照体积比1∶1进行混合获得的组合菌‘H166+C35’可显著抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长，抑菌谱较广，并可促进八棱海棠苗的生长，室内盆栽保护效果为74.82%，治疗效果为68.15%，田间处理无死苗率，防治效果较强。综上，组合菌‘H166+C35’通过破坏病原菌菌丝结构，抑制孢子萌发，降低了苹果再植病的发生，增强了植株的抗性，可开发成菌剂应用于苹果再植病的生物防治。

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基金资助

国家现代农业（苹果）产业技术体系专项(CARS-27)

河北省农业高质量发展关键共性技术攻关专项(21326506D)

河北省现代农业产业技术体系专项(HBCT2024150208)

河北省现代农业产业技术体系专项(HBCT2024170205)