基于BSA-seq和RNA-seq的西瓜裂刻叶候选基因挖掘

Candidate gene mining of watermelon lobed leaf based on BSA-seq and RNA-seq

摘要

裂刻叶是植物适应环境的重要特征，挖掘西瓜裂刻叶相关基因对西瓜育种、遗传改良及叶缘形态发育的分子调控机制研究具有重要意义。首先以西瓜裂刻叶自交系SW246（P₁）与全缘叶自交系SW247（P₂）为亲本，通过杂交构建六世代遗传群体（P₁、P₂、F₁、F₂、BC₁P₁、BC₁P₂）；后采用BSA-seq进行基因定位，并结合转录组测序RNA-seq数据进行关联分析，从而挖掘叶片裂刻关键调控基因。遗传分析结果表明：在后代群体中，F₁、BC₁P₁群体西瓜叶片均为裂刻叶，F₂群体裂刻叶和全缘叶的分离比符合3∶1的孟德尔分离比例，BC₁P₂群体裂刻叶和全缘叶分离比符合1∶1的理论比，说明裂刻叶和全缘叶性状符合单基因显性遗传模式，裂刻叶对全缘叶为显性。BSA-seq分析发现SNP和InDels关联交集位于4号染色体23164320—24976967 bp内，长度1.81 Mb，包含171个候选基因。其中在此区间亲本间存在非同义突变的SNP共22个，混池间存在非同义突变的SNP共16个；亲本间存在移码突变的InDel共3个，混池间存在移码突变的InDel共4个。联合BSA-seq与RNA-seq分析发现共有26个基因显著相关。此外，通过对BSA-seq和RNA-seq联合分析得到的4个候选基因及26个显著相关基因进行生物信息学分析、转录因子预测和基因注释，推测结果发现：1个编码PPR蛋白的基因（Cla97C04G076940），与HD-Zip、TCP、LOB、E2F-DP、TIFY等转录因子相关；另有1个与IAA-氨基酸水解和E3泛素连接酶相关的基因，该基因可能在叶缘性状的调控过程中发挥关键作用。本研究可为进一步精细定位西瓜裂刻叶调控基因奠定基础。

Abstract

Lobed leaf is an important feature for plant to adapt environment， and the mining of watermelon lobe leaf-related genes is of great significance for watermelon breeding， genetic improvement and molecular regulatory mechanisms of leaf margin morphogenesis. Firstly， six generations of genetic populations （P1， P2， F1， F2， BC1P1 and BC1P2） were constructed by crossing the watermelon lobed leaf inbred line SW246 （P1） with the entire leaf inbred line SW247 （P2） as the parental parents. Later， gene localization was carried out by using BSA-seq and association analysis was conducted in combination with RNA-seq data from transcriptome sequencing， To excavate the key regulatory genes of leaf lobed. The key regulatory genes were analyzed by BSAseq and RNA-seq. The results of genetic analysis showed that in the progeny population， the watermelon leaves of F1 and BC1P1 populations were all lobed leaves. The segregation ratio of lobed and entire leaves in the F2 population conformed to the Mendelian segregation ratio of 3∶1. In contrast， the segregation ratio of lobed and entire leaves in the BC1P2 population conformed to the theoretical ratio of 1∶1， which indicated that the traits of lobed and entire leaves conformed to the single-gene dominant mode of inheritance. The lobed was dominant to entire leaves. BSA-seq analysis revealed that the SNPs and InDels association intersections were located within 23 164 320 to 24 976 967 bp of chromosome 4， with a length of 1.81 Mb， containing 171 candidate genes. Among them， there were 22 SNPs with non-synonymous mutations between parents and 16 SNPs with non-synonymous mutations between mixed pools； 3 InDels with shifted code mutations between parents and 4 InDels with shifted code mutations between mixed pools. Combining BSA-seq and RNA-seq analysis， it was revealed that a total of 26 genes were significantly associated. In addition， the bioinformatics analysis， transcription factor prediction， and gene annotation of the four candidate genes and 26 significantly related genes obtained from the combined BSA-seq and RNA-seq analyses resulted in the speculative discovery of one gene encoding a PPR protein （Cla97C04G076940）， which is related to HD-Zip， TCP， LOB， E2F-DP， TIFY， and other transcription factors， and another gene is related to IAA-amino acid hydrolysis and E3 ubiquitin ligase， which may play a key role in the regulation of leaf margin traits. This study lays the foundation for further fine localization of watermelon leaf margin regulation genes.

Graphical abstract

关键词

西瓜 / 裂刻叶 / BSA-seq / RNA-seq / 候选基因

Key words

watermelon / lobed leaf / BSA-seq / RNA-seq / candidate genes

西瓜（Citrullus lanatus）属于葫芦科西瓜属重要园艺作物，栽培历史悠久分布地域广泛，被誉为“夏季水果之王”^［1］。叶片作为植物光合作用和蒸腾作用的主要场所，不仅直接影响光合效率和水分平衡，还在植物对环境的适应性中发挥重要作用^［2］。合理的叶形能够增强植物叶片空间延展性和光源竞争力，提高光合效率，更适应密植^［3-4］，能够优化叶面积指数，改善通风透气性^［5］。此外，合理叶形还能够提升耐高温、抗旱能力，并增强对水分胁迫和冷害的抵抗力^［6-7］。西瓜叶形因裂刻的有无，可分为裂刻叶和全缘叶（板叶）。裂刻做为西瓜叶片的重要的表型之一，在西瓜的生长发育和农艺性状方面发挥着重要作用^［8］。因此，研究西瓜裂刻叶有助于提升种质资源的利用效率，并对西瓜育种及叶缘形态发育的分子调控机制研究具有重要意义。

植物叶片形态的形成涉及多条复杂的调控网络，主要被认为参与叶缘裂刻形成的通路有3条：1）在TCP-CUC-PIN1-Auxin通路中，通过调控生长素的分布和梯度直接影响叶缘锯齿的发育。生长素的极性运输由PIN1（PIN-FORMED1）调控^［9-10］，例如拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）和苜蓿（Medicago sativa L.）中，PIN1基因的功能缺失会导致叶缘锯齿减少^［11-12］。此外，在拟南芥和番茄等作物中发现，转录因子NAM（NOAPICALMERISTEM）/CUC（CUP-SHAPEDCOTYLEDON1）是叶缘锯齿发育调控的重要节点。当NAM/CUC基因表达下调，叶缘锯齿程度减少^［9，13］。已有研究表明，TCP（TEOSINTEBRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF）转录因子的活性对于植物叶片形态和大小的形成至关重要^［14］。例如，在拟南芥中，TCP4通过抑制CUC基因的表达进一步限制锯齿的形成^［15］；2）在KNOX-GA/CK通路中，KNOX（KNOTTED1-like homeobox）基因通过调控激素平衡发挥作用，其正向调控细胞分裂素（CK，cytokinins）合成，负向调控赤霉素（GA，gibberellin）生物合成。GA与CK具有拮抗作用，GA降低叶形复杂度，使叶缘光滑，CK促进小叶分化和复杂叶片形成^［16］；3）在LMI1-like（RCO）-CK通路中，RCO（REDUCEDCOMPLEXITY）是调控小叶形成的关键基因，在复叶植物中通过延缓叶缘局部成熟进而促进叶形复杂化。例如，在碎米荠（Cardamine hirsute L.）中发现RCO通过调节与细胞分裂素相关的基因表达，增强小叶和叶缘锯齿的形成^［17］，并且发现该通路在复叶植物陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中尤为重要^［18］，而在拟南芥中由于RCO基因缺失，叶片表现为单叶形态^［18］。

不同作物中裂刻叶性状相关基因的遗传分析和定位研究已取得重要进展。如：油菜（Brassica napus L.）叶缘裂刻性状由不完全显性基因BnLL1控制，该基因被精确定位于一个36.7 kb的基因区域^［20］；棉花主要叶形基因（L）被定位于15号染色体短臂远端的一个5.4 cM区间，其中2个位于该区间内的LMI1-like基因被认为是最有可能的候选基因^［21］。HD-Zip转录因子GhLMI1-D1b（Gorai.002G244000）在棉花叶片形状的形成过程中发挥了关键作用^［17］。Wei等^［22］的研究将西瓜裂叶性状的关键位点定位于第4号染色体，而Xu等^［23］在4号染色体的0.7 Mb区域初步定位到了全缘叶位点。

集群分离分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）是一种在生物信息学中广泛应用的基因定位方法^［24］。由于其具有快速、准确和低成本的优势，已成为定位重要农艺性状基因的重要工具^［25-26］。RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）作为研究基因表达与功能的关键技术，特别是在植物功能基因挖掘中，具有广泛的应用前景。近年来，多组学分析技术为挖掘相关候选基因提供了有力支持。

目前关于西瓜叶形的基因定位和关键基因挖掘研究尚少。因此，为深入解析西瓜叶形发育的分子调控网络，精准鉴定调控叶形性状的关键基因，通过裂刻叶自交系SW246（P1）与全缘叶自交系SW247（P2）杂交构建F2代群体，利用BSA-seq对亲本池和F2代2个极端表型池进行全基因组重测序，利用SNP标记定位目标性状关联区域，结合RNA-seq测序结果确定调控西瓜叶形的关键候选基因，以期为进一步精细定位西瓜叶形关键调控基因奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

选用自交系SW246（P₁，裂刻叶）和自交系SW247（P₂，全缘叶）为亲本，杂交获得F1代，分别与双亲回交后获得（BC1P1、BC1P2）群体，F₁自交获得F2分离群体，用2个不同叶片性状亲本，构建六世代遗传群体。其中SW246和SW247来自宁夏农林科学院园艺研究所西瓜育种课题组，2022年获得F₁代，2023年获得BC₁P₁、BC₁P₂和F₂代，2024年春季将P₁、P₂、F₁、F₂、BC₁P₁、BC₁P₂植株种植于宁夏农林科学院农业试验基地。

1.2　BSA-seq测序分析

1.2.1　DNA混池构建

采用BSA法对西瓜裂刻叶性状进行基因定位。在2个亲本材料，选取裂刻叶和全缘叶植株各30株，其次在F₂分离群体中，各选取30株与亲本叶型相同的裂刻叶和全缘叶植株。分别取幼嫩叶片并保存在液氮中，构建4个DNA混池。

1.2.2　DNA提取、文库构建及测序

采用CTAB法提取全缘叶亲本（PQ）、裂刻叶亲本（PL）以及F2分离群体中全缘植株和裂刻植株的DNA^［27］。亲本及极端混合池重测序由北京百迈科生物技术公司完成。参考基因组版本信息：Citrullus_lanatus.97103_v2.genome.fa。

1.2.3　生物信息学分析

对原始片段（Raw reads）进行质量评估，利用BWA软件将4个混池的过滤后的clean reads与西瓜97103_V2参考基因组序列进行比对^［28］。采用GATK-pipline和SnpEff软件对单核苷酸多态性（SNP）以及插入和缺失（InDel）进行识别和注释^［29-30］。根据位点缺失率、深度和质量值等进行变异位点过滤，得到高置信度的SNP和InDel位点。采用ED和InDel-index进行关联分析^［31-32］。

1.3　RNA-seq测序分析

对全缘叶FQ和裂叶FL进行转录组测序。设置3个生物学重复，共6个样品。转录组测序分析委托北京百迈客生物科技有限公司开展，构建测序文库并进行质量检测，利用Illumina HiSeq^TM测序平台进行样品转录组测序。所测数据与西瓜97103_V2参考基因组进行比对，差异表达基因通过DESeq2-edgeR软件进行筛选与检测，筛选标准设定为：Fold Change≥2且FDR<0.01。使用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释^［33］。

1.4　RT-qPCR验证候选基因

选择与西瓜叶形相关的9个差异基因进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证（表1），用植物RNA提取试剂盒（物元吉因生物科技有限公司，武汉，中国）提取植物RNA。使用RT Easy TM Ⅱ（RT-01022/01023，FOREGENE，成都，中国）反转录试剂盒进行cDNA合成。引物依照NCBI中检索到的序列在primer5或BD中设计合成。使用SYBR qPCR SuperMix Plus（M00041，岚云生物科技有限公司，成都，中国）在LightCycler仪器上进行定量PCR（qPCR）分析。每个处理3个生物学重复，3个技术重复。基因表达量采用2^-ΔΔCt法计算^［34］。

2　结果与分析

2.1　西瓜裂刻叶的遗传分析

根据叶片的田间表型性状统计结果见表2。可见：F₁群体，西瓜叶片性状均表现为裂刻叶；F₂群体，性状出现分离，150株表现为裂刻叶，62株表现为全缘叶，分离比例经过卡方检验符合3∶1的孟德尔分离比例（χ²=2.04<χ²_0.05=3.841）；BC₁P₁群体植株叶片均表现为裂刻叶；BC₁P₂群体中裂刻叶和全缘叶株数分别为89株表现为裂刻叶，81株表现为全缘叶，分离比例符合1∶1的理论比（χ²=0.37<χ²_0.05=3.841）。遗传分析表明，西瓜裂刻叶与全缘叶性状是一对质量性状，其遗传受一对显性基因控制，且裂刻叶对全缘叶为显性。

2.2　基于BSA-seq测序结果及分析

2.2.1　测序质量评估

通过对2个亲本池（PL、PQ）和2个混池（FL、FQ）进行了测序，结果见表3。共获得48.86 Gbp的Clean reads，平均Q30达到了94.59%。与参考基因组的平均比对效率为99.28%，平均覆盖深度为32×，基因组覆盖率为99.59%。PL中有59 530 136条reads，PQ中有57 892 598条reads，FL中有103 496 546条reads，FQ中有107 385 168条reads，Clean reads的平均GC含量为36.36%，并且AT、CG碱基基本未发生分离，曲线较平缓，测序结果正常，适用于后续的下游分析。

2.2.2　关联分析预测西瓜叶形候选基因

对4个样品进行重测序后，在FL、FQ、PL、PQ分别检测到288 631和91 033、289 634和937 87、226 459和66 226、220 230和62 974个SNP和InDel；去除共有位点，总SNP和InDel 有318 019和106 186个，引起非同义突变的SNP共3 835个（图2）。对SNP和InDel进行过滤，得到高质量可信SNP和InDel位点共106 985和25 612个。使用ED和index 2种算法对这些高质量SNP和InDel位点进行关联分析。利用两混池间基因型存在差异的SNP和InDel位点，统计各个碱基在不同混池中的深度，计算每个位点ED值，并进行拟合，取所有位点拟合值的median+3×SD作为分析的关联阈值^［35］，计算得0.35和0.20。根据关联阈值判定，SNP和InDel的ED关联结果如图3（a）和（b）所示。选择阈值以上的区域作为与性状相关的区域。SNP指数和InDel指数方法关联结果的分布如图3（c）和（d）所示。

将2种关联分析方法得到的SNP关联区域结果取交集，最终确定了一个与性状相关的候选区域，总长度为1.88 Mb，间隔内有181个基因。将2种关联分析方法得到的InDel关联区域结果取交集，最终确定了2个与性状相关的候选区域，总长度为3.07 Mb。对SNP和InDel关联结果取交集，共得到1个与性状相关的侯选区域，总长度为1.81 Mb，在此区间亲本间存在非同义突变的SNP共22个，混池间存在非同义突变的SNP共16个，亲本间存在移码突变的InDel共3个，混池间存在移码突变的InDel共4个，候选区域内共171个基因（表4）。将测序分析结果和关联分析结果可视化，并将样品的变异结果及BSA关联分析结果使用circos软件（http：//circos.ca/）作图（图4）。

此外，将非同义突变和移码突变的基因进行整合，去除冗余后，共得到17条基因。其中，有3条基因（Cla97C04G077350、Cla97C04G076970、Cla97C04G076940）与表5中的基因重复，故在此不再赘述。最终，对剩下的14条基因进行了功能注释，结果如表5所示。注释结果显示，这些基因主要及苯丙氨酸代谢、核融合、细胞结构锚定、氮代谢、转录调控、糖基转移等过程。

2.3　基于RNA-Seq测序结果分析

2.3.1　数据质控

对样品转录组RNA-seq测序，在滤除所有低质量序列和接头后，共获得39.90 Gb Clean data，各样品Clean data均达到6.45 Gb，Q30碱基百分比在94.46%及以上。将各样品的Clean reads与指定的参考基因组进行序列比对，比对效率在95.50%~97.28%。结果见图5。可知本研究方法的数据处理规范，数据的质量较高且分组差异显著，可进行后续转录组分析。

2.3.2　差异基因分析

使用DESeq2软件对基因表达数据进行差异分析，结果见图6（a）。可见共筛选出892个差异表达基因，其中上调基因有196个，下调基因有696个。为了直观地展示不同分组中基因的表达差异以及挖掘新的功能基因，对筛选出的所有差异表达基因进行层次聚类分析，结果见图6（b）。可见同一组内基因表达模式相似。

2.3.3　差异基因的GO富集分析

对获得的892个差异基因，利用GO（Gene Ontology）数据库进行富集分析，结果发现这些基因分别被注释到三大功能领域，即生物学过程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）。针对每个领域富集程度最高的前20个GO条目绘制富集气泡图结果见图6（a）~（c）。由图7（a）可见在生物学过程中，差异基因主要富集于核转录mRNA降解（5个）、花器官发育（7个）、叶系发育（6个）和近轴/远轴的极性确定（2个）等条目；由图7（b）可见在细胞组分中，差异基因集中于细胞核（117个）、细胞器（53个）、细胞内细胞器（53个）等条目；由图7（c）可见在分子功能中，差异基因显著富集于有机环状化合物结合（27个）、杂环化合物结合（27个）、锌离子跨膜转运活性（3个）及序列特异性DNA结合（42个）等条目。

2.3.4　差异基因的KEGG富集分析

利用KEGG数据库对892个差异基因进行富集分析，结果显示这些基因被归入101条代谢通路。选择富集程度排名前20的代谢通路绘制气泡图结果见图7（d）。可见：差异基因主要集中在以下通路，植物-病原相互作用（40个）、脂肪酸延长（5个）、类固醇生物合成（4个）、倍半萜和三萜生物合（4个）、植物昼夜节律（5个）、硫转运系统（2个）、糖磷脂酰肌醇（GPI）锚定物生物合成（4个）、MAPK信号传导通路（20个），胡萝卜素生物合成（5个）等。其中，植物-病原相互作用（ko04626）、脂肪酸延长（ko00062）、半萜和三萜生物合成（ko00909）以类固醇生物合成（ko00100）通路富集显著。

2.4　BSA-seq和 RNA-seq联合分析

2.4.1　候选基因差异表达分析

针对BSA-seq分析鉴定出的171个候选基因，结合RNA-seq数据筛选这些基因的表达水平，绘制表达量热图结果见图8。可见所有候选基因中，Cla97C04G076610、Cla97C04G077200、Cla97C04G076940、Cla97C04G077080共计4个基因在F2群体的2种叶形试材中发生了显著的差异表达，且表达水平较高。4个差异表达的候选基因中：Cla97C04G076610编码一个激酶家族蛋白，该蛋白在植物体内广泛存在，并参与多种生理过程。可作为信号转导的关键分子，能够响应外界刺激，并将信号转化为细胞内的生化反应。这些反应进一步调控细胞的增殖、分化、代谢等过程，从而维持植物的正常生长发育^［36］；Cla97C04G077200编码一个类HVA22蛋白，该蛋白能够响应干旱、盐胁迫、低温等逆境条件，并通过调控细胞内的信号转导途径来增强植物的抗逆性^［37］；Cla97C04G077080编码一个类毛状体双折射蛋白8（protein trichome birefringence-like 8，TBL8），该蛋白在植物细胞壁的形成、修饰和维持中发挥着重要作用^［38］；Cla97C04G076940编码一个五肽重复序列（Pentatricopeptide repeat，PPR），该蛋白属于PPR基因家族。水稻研究结果表明，PPR蛋白主要定位于线粒体和叶绿体，并且某些PPR蛋白的突变会导致叶片形态异常、育性降低等表型。因此推测Cla97C04G076940可能是4个候选基因中导致叶形差异的关键基因^［39］。

2.4.2　叶形相关的基因调控网络构建

基于差异表达基因和候选基因表达量的相关性构建共表达网络，设置相关性阈值为0.8，显著性阈值为0.005，筛选出与候选基因最显著共表达基因，结果见图9。可见：19个候选基因与9个非候选差异表达基因显著共表达，这些基因包括3个转录因子，Cla97C11G217260属于LOB家族转录因子，Cla97C04G077210属于E2F-DP家族转录因子，Cla97C04G077350属于TIFY家族转录因子；PPR（Cla97C04G076940）与4个DEGs存在高度表达相关，包括一个LOB转录因子，一个ABA响应蛋白HVA22（Cla97C04G077200）、一个胁迫响应NLP（Cla97C09G173540）基因和一个metalloendoproteinase 4‑MMP（Cla97C05G080250）基因，这些基因可能通过参与激素介导的细胞壁重塑、细胞增殖和分裂等过程，影响西瓜叶片形态发育。对这些显著共表达基因进行KEGG和GO富集分析结果见图10。可见这26个基因在GO数据库中仅富集于生物学过程功能领域，而在KEGG数据库中则显著富集于41条代谢通路。选择富集程度排名前10的代谢通路绘图，发现这些共表达基因主要集中在丙酮酸代谢、糖酵解、蛋白质合成和外泌体相关过程，同时还富集在“脂肪酸合成”和“蛋白质输出”等通路，这些功能可能间接影响叶片发育。

2.4.3　叶形相关基因的功能注释

为了进一步研究西瓜叶形的关键基因，将26个共表达基因与4个关键候选基因进行功能注释（去除冗余共29个），结果见表6。可见这些基因主要参与细胞活动调控、细胞壁形成与细胞连接、器官发育调控及激素响应，同时还涉及脱水和盐胁迫的应对等过程。

2.5　实时荧光定量PCR验证结果分析

选择9个候选区间内基因（Cla97C04G076610、Cla97C04G076940、Cla97C04G077080、Cla97C04G077200、Cla97C04G076510、Cla97C04G069760、Cla97C04G079560、Cla97C03G052930、Cla97C05G083220）进行qRT-PCR验证，结果见图11。可见：Cla97C04G076610、Cla97C04G076940、Cla97C04G0697603个基因在FL样品中相比FQ样品显著高度表达；Cla97C04G079560、Cla97C03G052930和Cla97C05G0832203个基因在FQ样品中高度表达。其中：Cla97C04G076510在FQ和FL样品中表达无显著差异，所有这7个基因qRT-PCR检测到的表达趋势与转录组中的结果一致；Cla97C04G077080和Cla97C04G077200在转录组中发生差异表达，而在qRT-PCR中表达无显著差异。

3　讨 论

在葫芦科作物中，调控叶缘性状的相关基因也有报道。在南瓜中，控制裂叶表型的是由显性等位基因Lo-2控制^［40］，但在甜瓜中，研究发现叶缘裂刻性状由一个隐性单基因控制，并被定位于第3连锁群标记G69和784RS之间的14.6 kb区域内^［41］。本研究遗传分析结果表明，西瓜裂刻叶的形成是由单显性基因控制的性状，其中裂刻叶对全缘叶表现为显性。F₂和BC₁P₂群体的性状分离比例符合经典孟德尔分离比例，这一结果与柴兴荣^［42］研究结论一致。

利用BSA-seq分析，在西瓜4号染色体上定位出长度为1.81 Mb的SNP关联区域，并在该区域定位了与裂刻叶形成相关的候选基因，共筛选出171个候选基因。相关的研究中，有学者对莴苣的叶裂性状进行了基因定位，最终将目标基因精确定位于3号染色体的116.24—118.15 Mb区域，该区域包含24个候选基因^［43］。在对羽衣甘蓝叶裂性状进行基因定位时，不同研究的定位结果存在差异，表明裂叶性状可能是数量性状^［44-45］。在多种十字花科植物中发现，裂叶性状大多定位于HD-Zip I（Homeodomain-leucine zipper I）转录因子家族^［46-47］。众所周知，该转录因子在植物的形态发育、细胞分裂及组织分化等过程中发挥着重要作用^［48］。本研究对2个亲本进行RNA-seq分析，筛选出892个差异表达基因，并对其进行了功能富集分析。在GO富集的生物学过程中，发现叶系发育（Phyllome development）和近轴‑远轴极性确定（polarity specification of adaxial/abaxial axis）是叶缘性状调控的关键因素。在拟南芥和番茄研究中，叶缘基从顶端分生组织边缘起始后，迅速侧向扩展并进行发育与分化；在生长后期，近轴-远轴和非对称性的极性生长调控成为影响叶片形成与延伸的主要因素^［49］。并且在叶原基形成过程中，植物会在三维空间轴（近-远轴（adaxial-abaxial axis）、基-顶轴（proximal-distal axis）和中-边轴（central-lateral axis）上确立极性，这是形成具有独特形状和叶片大小的关键步骤^［50］。在KEGG富集分析中，主要富集的通路包括植物昼夜节律和MAPK信号传导通路等，这些通路在调控叶片形态和适应性方面发挥重要作用。

通过候选基因在转录组中的表达量，本研究对171个候选基因进行转录因子预测，发现有16个转录因子。其中TCP转录因子是植物叶片发育的重要调控因子^［51］。研究表明，Ⅱ类CINCINNATA-TCP转录因子通过促进细胞分化调节叶片的形状和大小。许多tcp突变体表现出叶片大小和曲率的增加。在叶用莴苣中，抑制LsTCP4的表达会导致叶缘变为锯齿状或卷曲^［52］。此外，本研究也对HD-Zip（Cla97C04G076510）转录因子进行了实时荧光验证。结果显示，该基因在FQ与FL样品间的表达水平未呈现出显著性差异；然而，在裂叶样品中，其表达量相较于全缘叶样品显著升高。这一发现表明，该基因可能在调控叶缘裂刻形态发育过程中扮演着关键角色。Wei等^［22］的研究将西瓜裂叶性状的关键位点定位于第4号染色体的127.6 kb区间（21 111 771~21 239 030 bp），并提出了2个候选基因：Cl97C04G076480和Cl97C04G076510，但与本研究定位的区间存在差别，可能是品种等因素所致。本研究的定位结果中存在一个编码PPR蛋白的基因Cla97C04G076940，该基因在不同叶形的西瓜中发生显著的差异表达，已有研究报道PPR蛋白的突变会导致叶片形态异常、育性降低等^［41］。其在西瓜中的功能尚未得到验证。

本研究基于差异表达基因和候选基因构建了共表达网络，在26个基因中预测到了3个转录因子。LOB家族转录因子的Class IA分支在植物地上部器官的发育中发挥重要作用，其成员功能涉及叶片形状与大小、叶柄发育、叶片向性运动以及光形态建成等过程^［53］。此外，在GO富集分析中，Cla97C11G21726（LOB转录因子）也被归类于近轴/远轴极性确定相关条目。E2F/DP家族转录因子调控了一系列与细胞周期相关的生物学过程。在拟南芥中，过表达AtE2Fb会导致转基因植株的根、子叶及叶片形态发生显著改变^［54］。TIFY家族转录因子在植物茎、叶和花的发育调控中也具有重要功能。在拟南芥中，AtTIFY4a（PPD1）和AtTIFY4b（PPD2）基因参与叶片发育的调节，主要表现为控制叶片大小并限制叶缘的弯曲程度^［55］。候选基因PPR同样存在于共表达网络中，与其表达量直接显著相关的几个基因通常被认为参与细胞壁修饰、细胞增殖等过程，这一结果进一步表明PPR可能是控制西瓜叶缘裂刻的关键基因。

在对共表达网络和差异表达的29个候选基因进行功能注释后发现Cla97C11G221230基因编码的蛋白属于RING结构域的E3泛素连接酶。在拟南芥中的研究表明，RING结构域的E3泛素连接酶通过泛素化调节TIE1（TCPINTERACTOR-CONTAININGEARMOTIFPROTEIN1）的稳定性或活性，间接影响TCP转录因子的功能，从而参与叶片锯齿的形成^［56-57］。Cla97C04G077140基因属于IAA-氨基酸水解酶ILR1（Indole-3-Acetic Acid-Leucine-Resistant 1），其主要功能是将结合态的生长素水解，释放出游离的生长素。然而，激素在复叶发育和叶缘裂刻的形成中起着重要的作用，研究表明生长素（Auxin）、细胞分裂素（CK）和赤霉素（GA）可以单独或与其他激素、转录因子相互作用来影响叶形的发育。生长素协调叶序并调节小叶起始过程，对植物叶缘锯齿的形成具有重要的作用^［58］。因此，PPR可能在复叶发育和叶缘裂刻形成过程中，通过包括IAA、ABA等在内的复杂激素串扰网络调控西瓜叶形发育。

4　结 论

为深入解析西瓜叶形发育的关键候选基因，本研究以裂刻叶自交系SW246（P1）与全缘叶自交系SW247（P2）为研究对象，采用BSA-seq和RNA-seq测序，探究西瓜叶形发育的分子调控网络。主要结论如下：

1）西瓜裂刻叶的形成是一种由单显性基因控制的性状；

2）基于BSA-seq分析，目的基因被定位于4号染色体上的一个1.81 Mb区域内，共筛选出171个候选基因。同时，RNA-seq分析共筛选出892个差异表达基因，这些基因显著富集于叶系发育、近轴-远轴极性、植物昼夜节律以及MAPK信号传导通路等，与叶片发育和形态调控密切相关；

3）结合BSA-seq和RNA-seq的测序结果、生物信息学分析及基因功能注释，初步推断HD-Zip、TCP、LOB、E2F-DP和TIFY等转录因子相关基因，以及IAA-氨基酸水解和E3泛素连接酶相关基因可能在叶缘性状的调控中发挥重要作用。一个编码PPR蛋白的基因（Cla97C04G076940）被认为是最可能控制叶缘裂刻形成的关键基因。

这些发现为揭示西瓜叶形态发育的分子机制提供了重要的理论依据，同时为候选基因的精细定位和功能验证奠定了基础，并为西瓜品种改良提供了潜在的分子标记资源。此外，鉴于候选基因功能阐释的精准性，应通过基因功能验证手段，以充分证实其生物学功能。

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[78] 李世宽， 洪慧龙， 付佳祺， 谷勇哲， 孙如建， 邱丽娟. BSA-Seq结合RNA-Seq技术挖掘大豆叶片提前黄化衰老基因［J］. 作物学报， 2024， 50（2）： 294-309

[79] Li S K， Hong H L， Fu J Q， Gu Y Z， Sun R J， Qiu L J. Mine the genes of premature yellowing and aging in soybean leaves by BSA-seq combined with RNA-seq technology ［J］. Acta Agronomica Sinica， 2024， 50（2）： 294-309 （in Chinese）

基金资助

宁夏农林科学院农业高质量发展和生态保护科技创新示范项目(NGSB-2021-7-02)