白消安缓释剂对鸡内源性生殖细胞消减能力和孵化性能的影响

Study on the ablation ability of busulfan sustained-release agent on chicken endogenous germ cells and its influence on hatching performance

摘要

为分析种蛋中注射白消安对鸡内源性生殖细胞的消减能力和孵化性能的影响，以寻求最优化的使用方式，本研究采用芝麻油和乳化器制备白消安缓释剂，分别按照最终注射白消安剂量为每个蛋0（不注射的空白对照组和只注射不含白消安的试剂的试验对照组）、50、75和100 μg注射到孵化3 h的种蛋的卵黄中，比较各组鸡胚内源性生殖细胞消减情况和孵化性能。结果表明：1）白消安注射引起7胚龄性腺中原始生殖细胞数量显著减少（P<0.05），具备很好的消减能力，其中75和100 μg组原始生殖细胞数量差异不显著（P>0.05），但显著少于对照组和50 μg组（P<0.05）。2）在孵化性能方面，75 μg组死胚率（43.2%）远小于100 μg组（71.6%）。3）雏鸡及死胚解剖发现各试验组性腺相对较小，部分消化道（肌胃）受到不同程度损伤。综上，白消安缓释剂可以有效去除内源性生殖细胞，并成功孵化，75 μg/蛋的剂量是制备移植受体的最适浓度，而在控制死胚率方面仍然有很大研究空间。

Abstract

To analyze the ability of busulfan injected into hatching eggs to ablate chicken endogenous germ cells and its effect on hatching performance， and to determine the optimal dosage protocol， this study prepared busulfan sustained-release formulations using sesame oil. The agents were injected into the yolk of hatching eggs at 3 hours of incubation at final busulfan doses of 0 （blank control group without injection and test control group injected with reagents without busulfan）， 50， 75， and 100 μg per egg， respectively. The ablation of endogenous germ cells in chicken embryos and hatching performance were compared among groups. The results showed that： 1） Busulfan injection significantly reduced the number of primordial germ cells （PGCs） in the gonads at 7 embryonic days （E7） （P<0.05）， demonstrating good ablation ability. There was no significant difference in the number of PGCs between the 75 and 100 μg groups （P>0.05）， but both groups contained significantly fewer PGCs compared to the control and the 50 μg group （P<0.05）.2） In terms of hatching performance， the 75 μg treatment group demonstrated significantly lower embryonic mortality（43.2%） compared to the 100 μg group （71.6%）. 3） Dissection of chicks and dead embryos found that the gonads of each test group were relatively small， and part of the digestive tract （muscular stomach） was damaged to varying degrees. In conclusion， the busulfan sustained-release agent can effectively eliminated endogenous germ cells and achieve successful hatching. The dose of 75 μg/egg is the optimal concentration for preparing transplantation recipients. However， further research is required to significantly reduce embryonic mortality rates.

Graphical abstract

关键词

白消安 / 不育受体 / 种系传播率 / 毒性作用

Key words

busulfan / sterile recipient / germline transmission rate / toxic effect

随着专业化生产方向的商业化鸡品种和配套高效养殖技术的发展，我国地方鸡遗传资源的开发和养殖量受到限制，品种数量和品种内遗传多样性逐渐减少^［1］。迫切需要高效的保种技术来减缓这一趋势，为家禽产业的可持续发展和生物多样性的保持夯实基础。除活体保种外，遗传材料低温保存和活体复原技术的发展为珍稀种质资源的长期、安全、有效保存提供了条件。理论上讲，所有生殖细胞及其前体细胞、胚胎都可以用于畜禽种源的复原，但是由于卵生禽类特殊的卵子和胚胎结构，使其无法进行冷冻保存，在禽类种质资源冷冻保存上主要开发了以精液、原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）、精原干细胞（Spermatogonia stem cells，SSCs）和性腺等遗传材料的冷冻保存与活体复原方法^［2-3］。其中，冻存的精子可以直接通过人工输精的方式完成其使命，其他遗传材料则需要通过移植的方式，在受体体内完成供体配子的发生发育^［4-6］。但在这些过程中，遗传材料的冷冻保存效果和品系复原阶段的种系传播率是影响保种效率与安全性的重要因素。此外，PGCs是家禽基因编辑的重要操作对象，也涉及向受体移植的关键步骤^［7］。受体内大量存在的内源性生殖细胞，限制了外源性生殖细胞的定植和发育，极大影响复原过程中的种系传播率。研究者一般通过物理或化学手段来尽可能消除受体内源性生殖细胞^［8］，其中白消安注射法是常用的化学手段之一。

白消安（1，4-丁二醇二甲基磺酸，Busulfan）是一种高细胞毒性的烷基化剂，可以打开DNA中的磺酸酯基环结构，使鸟嘌呤烷基化，破坏DNA的复制功能^［9］。因此能够优先进入代谢活性和分裂频率更高的生殖细胞，对生殖细胞造成相对的靶向消除^［10］。白消安已被用于消耗内源性生殖细胞以提高遗传材料复原鸡或基因编辑鸡的产生效率^［11］，但白消安毒性作用引起的胚胎畸形或死亡的问题不可忽略，使用方式有待优化。由于白消安在水或油中的溶解度非常有限，很难向每个胚胎中输送等量的白消安，且白消安在短时间内释放的剧烈药效会造成胚胎死亡或畸形，因此有研究引入对白消安溶解度较高的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），作为优先溶解白消安的溶剂^［12-13］，再将不同浓度白消安溶剂与无菌芝麻油混合，通过乳化的方式形成油包水结构，制备了一种可以在胚胎内缓慢释放药物效果的白消安缓释剂，可能是解决毒性问题的有效方法，但在以往研究中，制备效率仍制约不育受体在实际中的广泛应用。因此，本研究验证通过胚胎注射制备可以作为PGCs、SSCs和性腺移植受体的同时，统计其消除内源性生殖细胞能力和孵化性能，客观评价其安全性，优化白消安使用剂量，为提升禽类保种和分子育种效率的研究提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验种蛋和分组

白来航鸡种蛋取自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平试验基地，选取蛋重在45~50 g的种蛋440个，随机分为5组，其中不注射组为空白对照（70个蛋），不含白消安的缓释剂注射组为试验对照（70个蛋），3个试验组为不同剂量白消安缓释剂注射组，即每个胚胎注射50、75或100 μg白消安（每组100个蛋），其中每组10个用作分离性腺细胞，其余统计出雏情况。

1.2　主要试剂及配置

杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，DPBS）、PBS、4%多聚甲醛、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自索莱宝公司；糖原染液试剂盒购于南京建成科技有限公司；CP01培养基购自江苏品格生物科技有限公司，Avian KO-DMEM培养基；白消安、DMF、芝麻油、牛血清白蛋白（BSA）、Triton X-100、Hoechst33342购自Sigma公司，一抗免多克隆抗体anti-DDX4（MVH antibody）和二抗Cy3标记的山羊抗免IgG购于Abcam公司，其余普通化学试剂均为国产或进口分装。白消安缓释剂的制备：参照 Nakamura 等^［13］的方法，将白消安溶于DMF，浓度为15 mg/mL，再用DPBS按照注射浓度进行稀释，之后与芝麻油等体积混合，采用SPG乳化器进行乳化，空白对照和试验对照组白消安缓释剂最终浓度为0 μg/mL，试验组预混液白消安浓度分别为1 000、 1 500和2 000 μg/mL，待用。

1.3　种蛋注射和孵化

在注射前3 h将种蛋沿长径水平放置在孵化器内，注射时期为前条纹期（HH1）^［14］，将提前乳化好的白消安缓释剂或不含白消安的缓释剂（试验对照组）从种蛋的锐端注射到卵黄中，每个蛋注射量为50 μL，注射深度约为2.5 cm。空白对照组种蛋只参照其他组打孔和封口，不注射任何物质。

将注射小孔用小块石蜡封口膜热处理封好，放回孵化器孵化，温度为37.8 ℃，湿度为60%。种蛋水平放置，孵化第1天不进行翻蛋，防止卵黄破裂，此后每1 h翻蛋一次，角度为45°。孵化18 d后转入出雏器继续孵化至21 d出雏。

1.4　胚胎性腺生殖细胞形态观察、鉴定与计数

孵化7 d后（ED7），取性腺组织酶解后倒置显微镜下观察细胞形态，通过糖原染色（Periodic Acid-Schiff stain，PAS）和免疫荧光染色对生殖细胞进行鉴定，并依据特异性荧光染色结果进行生殖细胞计数。

1.4.1　胚胎性腺生殖细胞分离与形态观察

将活鸡胚从蛋中取出，体视镜下打开腹腔，拨开内脏暴露性腺，根据性腺形态判断鸡胚性别，每组各选取2个雌性和雄性鸡胚分离左侧卵巢和2对睾丸，在PBS中清洗3次，用0.125%胰蛋白酶-EDTA消化，37 ℃消化5 min，加入500 mL CP01培养基。接种于24孔培养板中培养4 h后，吸弃上层150 μL培养液，然后轻轻吹起沉在底部的细胞，全部转移到离心管中，于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。

1.4.2　糖原染色

添加培养基使得细胞制备的细胞悬液体积为200 μL，每次取30 μL进行染色，在荧光显微镜200倍镜下观察。根据试剂盒说明进行操作。将染色后的细胞悬液轻轻混匀后，吸取20 μL涂片晾干，滴加4%多聚甲醛固定3~5 min，在0.5%高碘酸溶液中孵育10~12 min，蒸馏水冲洗2次，每次5 min；倾去载玻片上的液体，放入Schiff试剂中避光孵育10 min，迅速用蒸馏水冲洗后，用亚硫酸氢钠溶液冲洗2次，每次5 min，再依次用自来水和蒸馏水分别冲洗5 min，滴一滴中性树胶，盖上盖玻片，显微镜下观察。

1.4.3　免疫荧光染色计数验证白消安缓释剂消减生殖细胞能力

取30 μL细胞悬液离心收集细胞样本，4%多聚甲醛固定，4 ℃过夜；离心去除固定液，用PBS-T（含有0.05% Tween 20的PBS）洗涤3次，每次3 min，离心去除固定液，用20 μLPBS重悬细胞，均匀涂在表面带正电荷的粘附载玻片上一小块区域，自然风干，用PBS-T清洗载玻片3次，每次30 min，用1% BSA处理载玻片6 h，以阻断非特异性蛋白，用0.1% Triton X-100处理10~20 min，PBS-T清洗后，用1∶100稀释anti-DDX4一抗4 ℃过夜孵育，PBS-T清洗后，1∶1 000稀释二抗37 ℃避光孵育1 h，加入10 μg/mL Hoechst 33342，避光染色2 min，倒置荧光显微镜下观察，每个处理随机选取6个视野进行细胞计数，以验证不同剂量白消安缓释剂对鸡胚内源性生殖细胞的消减能力。

1.5　白消安处理种蛋孵化性能

每3 d照蛋一次，并在孵化21 d后磕破未出雏鸡胚进行死亡日龄判定，计算出雏率和孵化截至7、15 和21 d的死胚率，用于分离性腺的鸡胚不计入统计范围。对出雏鸡与死胚进行剖检，观察性腺及其他重要组织器官，对肌胃进行固定、切片和HE染色。分别从孵化率、死胚率及剖检观察等角度评估注射种蛋的孵化性能。

1.6　数据分析

采用R中ANOVA进行相关统计学分析，显著性差异以P<0.05为标准。

2　结果与分析

2.1　胚胎性腺与生殖细胞形态学观察

体视镜下观察7胚龄鸡胚性腺的基本形态和分布位置，去除多余脏器，可见中肾位于鸡胚腹部下侧，性腺位于中肾中部靠腹中线一侧，与中肾颜色区分明显，左右各一条，呈细长条形，公鸡性腺呈双侧条状，大小无明显差别（图1（a）），母鸡左侧性腺略大于右侧，也更加扁平（图1（b））。

分别取雄性鸡胚两侧性腺和雌性鸡胚左侧性腺消化制备的细胞悬液，在显微镜下可以看到符合PGCs形态特征的圆形细胞^［15］，略大于其他细胞。培养4 h后，除较大的圆形细胞外，其他细胞几乎都已贴壁或悬浮于培养液表面（图1（c）），纯化后，多数细胞为圆形细胞，直径约为15~20 μm（图1（d））。

上述细胞经过糖原染色后呈深紫色，证明其为PGCs（图2（a））。同时可见PGCs数量随着白消安浓度的增加明显降低（图2（b）~2（f）），具体数量参照免疫荧光计数方式。

2.2　生殖细胞消减情况

免疫荧光染色是利用PGCs特异表达Vasa蛋白，用抗Vasa的多克隆抗体anti-DDX4（一抗）处理分离的细胞，再用Cy3标记的二抗（红色荧光）处理后于荧光显微镜下观察，可以看到PGCs除细胞核被Hoechst33342染成蓝色外，细胞膜周围呈红色荧光（图3），从图中同样可以看出，随白消安浓度增加，被染色的细胞密度呈梯度下降。

对这些细胞进行计数，空白对照组和试验对照组生殖细胞数量差异不显著（P>0.05），相比之下，各白消安处理组生殖细胞的数量都显著下降（P< 0.05）。其中50 μg白消安剂量组每个视野的PGCs数量从400个以上减少到不足150个。值得注意的是，75 与100 μg剂量组之间不显著（P>0.05）（图4）。

2.3　75 μg剂量组白消安注射对雏鸡性腺影响

确定75 μg剂量组为白消安注射的最优组后，重点观察75 μg剂量组成功孵化雏鸡性腺在对照组与白消安组的区别，观察发现公鸡睾丸较正常雏鸡小（试验对照组睾丸长度5~6 mm，白消安注射组睾丸长度3~4 mm），注射组卵巢呈现发育不良的半透明状，整体较小（2 mm×5 mm）（图5）。

2.4　75 μg剂量组白消安注射对孵化率和雏鸡质量的影响

如表1所示，无白消安缓释剂注射组孵化率受到较小影响，但随白消安注射浓度的增加，受精蛋孵化率随之降低（表1），增加到100 μg时受精蛋孵化率下降到不到30%。死胚多发生于注射初期与胚胎发育15 d后，同时发现白消安对死胚消化道，尤其是肌胃影响较大。无论是死胚还是成功孵化的雏鸡，肌胃胃壁都较正常肌胃薄，鸡胚肌胃及肠道充盈气体（图6（a）、图6（b）），切片显示白消安处理组肌胃角质层、粘膜层、柱状上皮层变薄且分界不明显（图6（c）和6（d））。

3　讨 论

不育受体制备的研究是家禽种质资源保护中与基因编辑等生物育种技术应用中十分重要的组成部分。目前科研人员已开发了多种受体鸡内源性生殖细胞消除的方法，主要包括手术去除性腺法、化学法、辐照法与基因编辑法^［8］，其中性腺手术去除的方法只适用于性腺的原位移植，且手术难度较大^［16-17］；辐照法需要大型设备，但制备的效率不高^［18-19］，且难以避免非必要部位的辐照引起的负面影响；基因编辑的方法是如今最具潜力的手段^{［11， 20-21］}，可操作难度、伦理限制和高昂的成本使其并不具普适性；白消安注射的化学方法较为常用，其制备的受体适用于包括PGCs、SSCs和性腺在内的多种遗传材料的移植，成本低，易操作，并已有研究利用白消安制备的受体成功完成了PGCs的移植和品系复原，因此白消安处理的方法可能是禽类种质资源保护过程中更安全有效的手段^［22-23］，尤其是白消安缓释剂的开发，使白消安可以缓慢而广泛作用于内源性生殖细胞，减少鸡胚死亡，极大提高受体制备效率^{［13， 24］}。

本研究为更准确对生殖细胞进行计数，首先通过细胞形态、糖原染色及细胞特异蛋白免疫荧光染色鉴定了分离出的细胞为生殖细胞^［25-26］，糖原染色与免疫荧光染色显示出相似的细胞密度变化趋势，并最终通过免疫荧光染色对细胞进行计数，验证了白消安缓释剂在消减内源性生殖细胞中的作用。无白消安的缓释剂对生殖细胞数量没有影响^［22］，本研究中试验对照组与空白对照组鸡胚性腺生殖细胞数量无显著区别，但是在孵化率方面是有细微差异的，且主要发生在胚胎发育早期，推测由注射引起的鸡胚污染和结构破坏可能是无法避免的。

在试验组中，可以看到白消安缓释剂并不能完全去除内源性生殖细胞，因此，本研究主要关注优化合适的注射浓度。每个鸡胚注射50 μg白消安只能消除不到2/3的内源性生殖细胞，而100 μg的注射能够减少85%以上的内源性生殖细胞，但却造成了极高的死胚率，这样的受体制备效率可能超过了内源性生殖细胞对整体效率的影响，因此对于蛋重45~50 g的鸡胚而言，75 μg/蛋可能是优先选择的注射浓度。

选择75 μg剂量组继续观察1日龄雏鸡性腺发育情况，观察显示无论是公鸡还是母鸡，都表现性腺发育滞后，这对外源性生殖细胞的定植和分化是否有影响还待进一步深入研究；与前人结果不同的是本研究观察到白消安对雏鸡性腺发育和消化道的严重影响，这或许是引起死胚的主要原因，而这些影响可能发生在内源性生殖细胞被消除之后，是否能够抑制白消安对鸡胚孵化前期和15 d后的影响来降低死胚率是一个值得研究的课题。另一方面，体内剩余的白消安是否影响再移植细胞的定植和分化，注射浓度是否也需要同时考虑对供体生殖细胞的影响，这是白消安处理法另一个让人关注的问题。Kim 等^［27］制备了一类对白消安细胞毒性具备抗性的PGCs，结合白消安缓释剂注射的方法，显著提高了嵌合效率。然而，在鱼类PGCs移植的研究中，单个PGC具有重新填充生殖系并产生功能配子的能力已被证实^［28］，Lee 等^［29］也发现鸡PGCs在经历细胞毒性作用后也能通过促进其细胞周期进入恢复途径^［29］。因此，解决白消安对受体和再移植生殖细胞影响的同时，更要完全去除内源性生殖细胞，后续可通过进行可追踪PGCs的移植和损伤机制的挖掘，继续完善这种处理方法。这种方法不只适用于胚胎期和雏鸡上的移植，在特定条件下同样适用于成年鸡内源性生殖细胞的消除^［30］。

4　结 论

本研究通过种蛋内注射白消安缓释剂，制备适用于多种遗传材料移植的不育受体，客观的评价了白消安缓释剂对内源性生殖细胞的消除能力和对鸡胚的致死、致畸作用，并筛选到45~50 g种蛋最适注射剂量为75 μg，此外，发现白消安对鸡胚消化道也存在严重的负面影响。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2021YFD1200301)

中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-CSAB-202402)

现代农业产业技术体系蛋鸡体系项目(CARS-40)