基于蛹虫草全基因组水平筛选外排虫草素的候选转运蛋白

Genome-wide screening of candidate transporters responsible for Cordycepin efflux in Cordyceps militaris

摘要

为筛选介导外排虫草素的蛹虫草候选转运蛋白，本研究借助生信手段鉴定蛹虫草全基因组ABC转运蛋白，通过整合蛹虫草转录组数据、已验证研究结论和分子对接分析方法，挖掘显著正向关联虫草素积累水平的蛹虫草候选转运蛋白。结果表明：1）在蛹虫草全基因组水平共鉴定获得70个ABC转运蛋白，分布在ABCA（3个）、ABCB（12个）、ABCC（37个）、ABCD（2个）、ABCE（1个）、ABCF（5个）、ABCG（8个）、ABCI（1个）和YDR061W （1个）亚家族；2）整合3项蛹虫草转录组数据，筛选出96个与虫草素积累显著正相关的膜蛋白，将这些蛋白比对至酿酒酵母、构巢曲霉和米曲霉的全基因组蛋白，筛选相似性都大于30%的共有蛋白，并结合与智人（Homo sapiens）的ENT1/ENT2、白假丝酵母（Candida albicans）的CaCNT、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的TbAT1同源的蛋白，获得34个候选转运蛋白；3）通过构建蛋白三维结构模型并与虫草素进行分子对接，所有候选转运蛋白与虫草素的对接结合能都小于-5 kJ/mol，亚细胞定位预测显示，这些蛋白主要分布于质膜（27个）、液泡（3个）、内质网 （2个）、过氧化物酶体（1个）和线粒体（1个）。综上，通过多策略生信分析，本研究在蛹虫草CM01全基因组蛋白中鉴定到70个ABC转运蛋白，筛选介导外排虫草素相关的34个候选转运蛋白，为转运蛋白主导的虫草素外排机理和代谢重编程研究奠定理论基础。

Abstract

To screen candidate transporters involved in cordycepin efflux within Cordyceps militaris， the study employed bioinformatics approaches to analyze ATP-binding cassette （ABC） transporters across its genome. By integrating transcriptomic data， previously validated findings， and molecular docking analyses， transporters correlated with cordycepin accumulation were identified. The results showed that： 1） A total of 70 ABC transporters were identified at the genomic level， distributed in the ABCA （3）， ABCB （12）， ABCC （37）， ABCD （2）， ABCE （1）， ABCF （5）， ABCG （8）， ABCI （1） and YDR061W （1） subfamilies. 2） Integrating transcriptome data of C. militaris from three projects， 96 membrane proteins significantly positively correlated with cordycepin accumulation were screened. These proteins were compared to the whole genome proteins of Saccharomyces cerevisiae， Aspergillus nidulans， and Aspergillus oryzae， and shared proteins with a similarity greater than 30% were screened. Across the entire genome of C. militaris， proteins homologous to ENT1/ENT2 of Homo sapies， CaCNT of Candida albicans， and TbAT of Trypanosoma brucei were investigated and combined with the selected shared proteins to obtain 34 candidate transporter proteins. 3） By constructing a three-dimensional protein structure model and performing molecular docking analyses， the binding energies of all transporters to cordycepin were less than -5 kJ/mol. Subcellular localization predictions showed that these proteins were mainly distributed in the plasma membrane （27）， vacuole （3）， endoplasmic reticulum （2）， peroxisome （1）， and mitochondrion （1）. In conclusion， through multi-strategy bioinformatics analysis， this study identified 70 ABC transporters in the whole genome of C. militaris CM01 and screened 34 candidate transporters potentially involved in cordycepin efflux in C. militaris CM01， laying the groundwork for future research on cordycepin transport mechanisms and metabolic reprogramming.

Graphical abstract

关键词

蛹虫草 / 虫草素 / 转运蛋白 / 生物信息学 / 分子对接

Key words

Cordyceps militaris / cordycepin / transporter / bioinformatics / molecular docking

蛹虫草（Cordyceps militaris）是虫草属模式真菌，其质控产物虫草素（即3′-脱氧腺苷，Cordycepin）具有抗癌、抗阿尔茨海默病等功效^［1］，具有良好的应用潜力。然而，虫草素含量低的问题严重制约蛹虫草产业发展。内源活性产物的外排是真菌用以增强自身抗性，从而提高活性产物含量的核心策略，该过程主要依赖转运蛋白介导的运输途径。转运蛋白主导代谢重编程是提高真菌活性产物含量的重要技术手段，在代谢重编程工程中具有重要的应用价值，研究发现转运蛋白主导的代谢重编程手段能显著提高酿酒酵母的生产性能，使胞外莨菪碱和东莨菪碱产量分别提高114和7.2倍^［2］，胞内的大麻二酚含量增加了5.69倍^［3］，对胞内癸烷抗性提升了80倍^［4］。因此，筛选外排虫草素的蛹虫草转运蛋白具有重要的研究意义。

在蛹虫草的原位体系中，cns3~1依次负责腺苷到虫草素的从头合成，同一基因簇的cns4编码蛋白仅负责外排喷司他丁而非虫草素^［5］，而ABC转运蛋白通路数量^［6］和相关基因表达水平^［7］随虫草素含量的提高而显著增加，提示蛹虫草ABC转运蛋白密切正向关联虫草素含量。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）在真菌中广泛分布，是目前最大的转运蛋白家族，主导运输生物碱等活性产物。ABC转运蛋白包含跨膜运输结构域（TMD）和标志性的ATP驱动泵结构域（NBD），真核生物的绝大多数属于将底物由对侧运输到NBD测的外向型^［8-10］。依据不同物种的ABC转运蛋白结构域序列相对保守且功能相似的特征，按照HUGO（The human genome organization）系统将ABC转运蛋白划分为ABCA~ABCG、ABCI的8个亚家族和其他分类（YDR061W），每个亚家族具有特定的功能：ABCA成员主要运输脂质；ABCB成员运输重金属、铁离子和活性产物；ABCC成员转运卵磷脂、胆酸和活性产物等；ABCD成员主要运输脂肪酸；ABCE和ABCF成员通常缺乏TMD，参与起始因子、转录因子、细胞周期等细胞调控活动；ABCG成员主要介导外源化合物、药物成分、毒素、磷脂、甾醇的转运，部分成员含有多药耐药性（PDR_CDR）结构域；ABCI成员通常只含有NBD，是蛋白复合体的亚基，参与调控mRNA；YDR061W成员未被归入HUGO亚家族，其功能尚不明确^［8，11］。

蛹虫草代谢组学研究发现：相比低产虫草素的蛹虫草菌，高产虫草素的蛹虫草菌丝体中代谢产物显著富集到ABC转运蛋白通路^［6-7］，表明高产虫草素的蛹虫草菌更依赖ABC转运蛋白；在柞蚕蛹虫草的不同发育时期，子实体虫草素含量差异显著，ABC转运蛋白通路是不同发育时期子实体之间的主要差异代谢通路^［12］，提示蛹虫草细胞内的虫草素积累过程耦合ABC转运蛋白通路。蛹虫草转录组学研究发现：ABC转运蛋白通路在高产虫草素的蛹虫草子实体样本中显著富集^［13］，说明蛹虫草子实体的虫草素积累依赖ABC转运蛋白；CCM_04722编码蛋白G3JD22可能负责转运虫草素^［14］。异源体系的研究表明，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C^［15］、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）^［5］、米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB 40^［16］都能外排虫草素，说明与这3个物种同源的蛹虫草转运蛋白负责外排虫草素；智人（Homo sapiens）的ENT1/ENT2^［17］、白假丝酵母（Candida albicans）的CaCNT^［18］、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的TbAT1^［19］能介导虫草素的内向转运。目前为止，不仅国内外尚无基于全基因组水平筛选蛹虫草ABC转运蛋白的研究报道，而且外排虫草素的蛹虫草转运蛋白仍不明确。因此，筛选介导虫草素外排的蛹虫草转运蛋白对提高虫草素积累水平有重要意义。本研究通过鉴定并分析蛹虫草全基因组ABC转运蛋白，以及基于蛹虫草转录组和已验证异源运输虫草素的生物信息学分析，在蛹虫草CM01全基因组水平上系统筛选参与外排虫草素相关的候选转运蛋白，为进一步研究蛹虫草内源性虫草素的外排机理提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料

蛹虫草菌CM01，其在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）的全基因组蛋白Proteome ID为UP000001610。

1.2　筛选蛹虫草ABC转运蛋白

利用TBtools软件^［20］的HMM search工具，以Pfam数据库的PF00005（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/PF00005/）建立ABC转运蛋白保守结构域背景数据，比对（E<1×10^-5）蛹虫草全基因组蛋白序列，同时借助Pfam^［21］、Smart^［22］、NCBI CDD^［23］在线系统，剔除不含注释信息和不含NBD结构域的序列后，获得蛹虫草的候选ABC转运蛋白。

1.3　鉴定蛹虫草ABC转运蛋白

采用InterPro数据库^［24］对蛹虫草的候选ABC转运蛋白进行HUGO^［25］系统分类。整合UniProt数据库中已鉴定（Reviewed）酵母、曲霉和智人ABC转运蛋白并导入TBtools软件，与蛹虫草的候选ABC转运蛋白进行多序列比对，以最大似然法（ML）构建系统发育树（Bootstrap值为5 000），利用ITOL在线系统^［26］进行可视化，据此验证蛹虫草ABC转运蛋白隶属的亚家族正确性。

1.4　ABC转运蛋白的理化性质、保守结构域和功能分析

检索Pfam和Smart数据库获得蛹虫草ABC转运蛋白的保守结构域，合并去重后利用TBtools软件可视化。分别借助ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、ProComp（http：//www.softberry.com/）在线平台及DeepTMHMM程序（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）分析蛹虫草ABC转运蛋白的理化性质、亚细胞定位和跨膜结构。

1.5　基于生信广泛筛选候选转运蛋白

从NCBI SRA数据库下载项目PRJNA883799（Xylose vs Glucose以及Xylose vs Arabinose）^［27］和PRJNA900787（NAA-4000 vs NAA-0以及NAA-3000 vs NAA-0）^［13］中虫草素含量差异显著（P<0.01）的蛹虫草转录组原始测序数据，利用Galaxy平台（https：//usegalaxy.org）解析原始数据，与Zhang等^［14］研究数据（GYS60 vs C.militaris以及GYS60 vs GYS80）合并后，分别在每个研究中筛选与虫草素含量显著正相关且共有的上调差异表达基因并注释为蛹虫草CM01蛋白，通过DeepTMHMM程序获取其中的膜蛋白，分别比对到S. cerevisiae（UniProt ID：UP000002311）、A. nidulans（UniProt ID：UP000000560）、A. oryzae（UniProt ID：UP000006564）蛋白，选取相似性都大于30%（以下统称同源蛋白）的共有蛹虫草蛋白，然后在蛹虫草CM01全基因组蛋白中筛选与H. sapiens的ENT1（UniProt ID：Q99808）和ENT2（UniProt ID：Q14542）、C. albicans的CaCNT（UniProt ID：Q874I3）、T. brucei的TbAT1（UniProt ID：Q9Y0I0）的同源蛋白，与上一步的共有蛹虫草蛋白合并并去重后，作为候选转运蛋白。

1.6　构建候选转运蛋白结构模型

在UniProt数据库中获取已构建的候选转运蛋白3D结构模型，其他候选转运蛋白通过以下步骤构建：在UniProt数据库提取CmABCG5（即CNS4，UniProt ID： G3JF11， Gene name： CCM_04439）序列，分别利用Colab AlphaFold2^［28］、HelixFold-Single^［29］、I-TASSER^［30］、SWISS-MODEL程序构建CmABCG5结构模型，再依据QATEN程序^［31］和SAVES Ramachandran 拉氏构象（https：//saves.mbi.ucla.edu/）评估的合理性筛选CmABCG5结构模型，据此优选方法构建候选转运蛋白3D结构模型。

1.7　分子对接探究候选转运蛋白外排虫草素的潜力

利用Discovery Studio 2019准备虫草素（PubChem CID：6303）和候选转运蛋白的结构模型，包括加氢、去水和优化结构等；借助PrankWeb程序^［32］预测蛋白活性位点；在Dockey软件^［33］上搭建基于Auto Dock Vina 1.2.5的分子对接平台，以候选转运蛋白和虫草素的对接结合能为依据，探究候选转运蛋白外排虫草素的潜力，应用PyMOL软件进行可视化。

1.8　数据统计与分析

在Galaxy平台构建转录组原始数据分析流程：Fastp 1.0.1+Hisat2 2.2.1+FeatureCounts 2.0.8解析获得基因Counts；借助DESeq2程序并按照文献的标准（P<0.05）筛选差异基因，其中PRJNA883799为Log₂FC>1，PRJNA900787为FC>1.5。利用Bioinformatics（https：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制火山图，Adobe Illustrator CS6（Adobe Systems Incorporated，美国）软件绘制图形。

2　结果与分析

2.1　蛹虫草ABC转运蛋白的鉴定与系统分类

从蛹虫草CM01基因组注释的9 651个蛋白中，筛选出70个ABC转运蛋白，将这70个蛋白与已报道的140个ABC转运蛋白合并，构建系统发育树并统一命名。如图1所示，蛹虫草ABC转运蛋白分布于ABCA（3）、ABCB（12）、ABCC（37）、ABCD（2）、ABCE（1）、ABCF（5）、ABCG（8）和ABCI（1）共8个亚家族，以及YDR061W（1），其中ABCC、ABCB、ABCG成员最多，分别占52.8%、17.1%和11.4%。各亚家族成员与已知同源序列聚为同一分支，表明本研究对蛹虫草ABC转运蛋白的亚家族划分可靠。

2.2　蛹虫草ABC转运蛋白的保守结构域分析

同一亚家族成员含有保守结构域的种类与数量相近，如图2所示，蛹虫草ABC转运蛋白的结构类型分为全、3/4、半、1/4分子，都含有特征性的NBD结构域（ABC_tran）。其中，ABCA成员均为全分子，TMD均为ABC2_membrane3；ABCB成员包括全分子和半分子，其TMD为ABC_membrane；ABCC成员涵盖全分子、3/4分子、半分子，其TMD都为ABC_membrane；ABCD成员均为由ABC_membrane_2构成的半分子；ABCE和ABCF成员仅包含ABC_tran，缺乏TMD；ABCG成员为由ABC2_membrane构成的全分子、半分子，其中CmABCG3/7/8在N端包含NBD结构域（ABC_tran_N），CmABCG2/3/5/7/8含有PDR_CDR，CmABCG2/3/5/7/8可能增强蛹虫草对内源性毒素的抗性，研究证实CmABCG5负责外排蛹虫草子实体的内源性喷司他丁^［5］；CmABCI与YDR061W成员仅包含ABC_tran结构域。

2.3　蛹虫草ABC转运蛋白的理化性质分析

蛹虫草ABC转运蛋白的理化性质存在不同程度的差异（表1）：氨基酸长度284~1 766 aa、分子量30.87~194.60 ku、理论等电点5.29~7.47、不稳定指数28.62~49.83、脂肪系数84.38~113.51、总平均亲水性（GRAVY）-0.377~0.340，GRAVY>0视为疏水，其中51个为疏水蛋白，占72.9%。亚细胞定位结果显示：5个位于细胞质，5个位于内质网（其中2个为分泌型膜蛋白），7个位于线粒体，2个位于过氧化物酶体，39个位于质膜，12个位于液泡。

2.4　筛选外排虫草素的候选转运蛋白

在NCBI项目PRJNA883799和PRJNA900787中，Xylose组虫草素含量显著高于Glucose组和Arabinose组（P<0.01），NAA-4000组和NAA-3000组虫草素含量显著高于NAA-0组（P<0.01）。在研究PRJNA883799中，Xylose组相比Glucose组筛选获得949个上调表达基因（图3（a）），Xylose组与Arabinose组相比，820个基因上调（图3（b）），其中共有上调基因有432个。在PRJNA900787中，NAA-4000组相对于NAA-0组有150个基因上调（图3（c）），NAA-3000组与NAA-0组相比，筛选到234个上调基因（图3（d）），其中共有上调基因有95个。利用Zhang等^［14］研究数据，GYS60组虫草素含量显著高于C.militaris组和GYS80组（P<0.01），通过比较分析筛选获得22个共有上调基因。将上述共有上调基因对应的蛋白合并，预测跨膜结构后获得96个膜蛋白，将这些膜蛋白分别与酿酒酵母、构巢曲霉、米曲霉蛋白组进行BLASTP比对，分别获得同源蛋白64、81和78个，保留相似性均大于30%的同源蛋白，与已验证转运虫草素的ENT1、ENT2、CaCNT和TbAT1的C. militaris CM01同源蛋白合并去重，共得到34个候选转运蛋白。

2.5　构建蛋白结构模型

CmABCG5结构模型的定性评估（图4（a））显示，AlphaFold2模型的落入最适区的氨基酸数量明显高于其他模型，图4（b）显示AlphaFold2模型的高可信度区域明显多于其他模型；定量评价结果（表2）显示，落入最适区氨基酸比例最高的是AlphaFold2模型，落入最适和允许区氨基酸的比例达到99.3%；QATEN程序对模型的评估值Global Value反映了模型结构合理性，Global Value越高，模型结构越合理，AlphaFold2结构模型的Global Value明显高于其他模型。因此，以AlphaFold2程序构建候选转运蛋白的结构模型。

2.6　候选转运蛋白外排虫草素的潜力分析

氢键是形成稳定的蛋白-配体复合物的关键因素，选取与S. cerevisiae、A. nidulans、A. oryzae的蛋白都具有较高相似性的CmABCG3、CmABCC28、CmABCG8、CmABCC22对接虫草素。如图5所示，CmABCG3通过4条氢键结合虫草素，结合自由能-5.68 kJ/mol；CmABCC28-虫草素复合体有6条氢键，结合自由能-6.24 kJ/mol；CmABCG8与虫草素形成7条氢键，结合自由能-6.76 kJ/mol；CmABCC22与虫草素存在6条氢键，结合自由能-6.11 kJ/mol。

将自建及 UniProt 获取的候选转运蛋白3D结构与虫草素进行分子对接，如表3所示，候选转运蛋白与虫草素的对接结合能都小于-5 kJ/mol，说明候选转运蛋白都能与虫草素形成稳定复合体。依据UniProt功能注释，推测25个候选转运蛋白具备转运活性，其中G3JAQ7、CmABCC27、CmABCG8、G3JKC3、G3JJ35、G3JPE8、G3JDP9、G3J891、CmABCC28、CmABCB11、CmABCC22与CmABCG3可能参与虫草素的外排。候选转运蛋白呈现明显的亚细胞膜定位特征，27个位于质膜，3个位于液泡，2个位于内质网，过氧化物酶体和线粒体各分布1个，提示这些细胞器与虫草素的运输和积累调控密切关联。

3　讨 论

转运蛋白的功能取决于其一级结构和关联运输的保守结构域，同一家族成员具有标志性的保守结构域，其功能通常相似。多项研究利用代谢组学证实高产虫草素蛹虫草菌更依赖ABC转运蛋白通路，提示ABC转运蛋白可能参与虫草素的外排^［6，13］。本研究据此在蛹虫草全基因组水平鉴定获得70个ABC转运蛋白，在ABC超家族的各亚家族中都有分布。蛹虫草拥有3个ABCA成员，而大多数酵母基因组中没有发现ABCA家族成员^［8］，表明蛹虫草在ABC家族构成上具有物种特异性。ABCB、ABCC和ABCG亚家族成员通常参与活性产物的运输，这3个亚家族成员数量占81.4%，仅ABCC成员占52.8%，体现蛹虫草活性产物的多样性特征。剩余的其他亚家族成员仅占蛹虫草ABC成员的7.1%。

蛹虫草菌CM01全基因组共编码9 651个蛋白，从中筛选介导外排虫草素的少量候选转运蛋白需要多种已验证结论为支撑，本研究利用多种策略筛选获得34个候选转运蛋白。已有研究证实当结合自由能小于-5 kJ/mol时，受体和配体能形成稳定复合体^［35］。通过分子对接分析，发现所有候选转运蛋白与虫草素的结合自由能都小于-5 kJ/mol，说明都能与虫草素形成稳定复合体，具有运输虫草素的潜力，尤其在酿酒酵母、构巢曲霉、米曲霉的全基因组中均有较高相似性的候选转运蛋白CmABCG3、CmABCC28、CmABCG8和CmABCC22备受关注。

真菌主要通过外排胞内活性产物的方式避免自我细胞毒性，外排包括活性产物的胞内运输和跨质膜外排泵，其中形成亚细胞区隔是隔离胞内活性产物的有效手段。转运蛋白所在亚细胞信息能提供高水平积累的虫草素诱导特定细胞器参与虫草素运输相关的信息^［13-14］，本研究预测发现质膜、液泡、内质网、过氧化物酶体、线粒体的转运蛋白与虫草素的运输密切相关，研究证实蛹虫草菌体内的脂滴借助其驻留蛋白CNS2和CNS1合成虫草素^［5］，提示多种亚细胞结构可能共同参与虫草素的外排。内质网对细胞器的膜结构形成具有重要作用，如脂滴的单磷脂层膜系统与其部分驻留蛋白就源自内质网，据此推测内质网可能对虫草素的调控具有重要作用。目前主要有2种假说支持内质网介导运输活性物质：1）包裹活性物质的囊泡从内质网运输到高尔基体，再转运到质膜； 2）活性物质通过紧邻质膜的内质网转运进入质膜^［9］。目前仍不清楚蛹虫草菌以何种途径和机制实现内源性虫草素的外排，候选转运蛋白与虫草素外排的关联性仍需要进一步验证。

4　结 论

本研究基于生物信息学方法，在蛹虫草CM01全基因组水平共鉴定到70个ABC转运蛋白，分布于ABCA-ABCG、ABCI和YDR061W亚家族。进一步基于转录组等多种分析手段，筛选出34个可能介导外排虫草素的候选转运蛋白，其亚细胞定位如下：质膜27个、液泡3个、内质网2个、过氧化物酶体1个、线粒体1个，推测其中12个蛋白（G3JAQ7、CmABCC27、CmABCG8、G3JKC3、G3JJ35、G3JPE8、G3JDP9、G3J891、CmABCC28、CmABCB11、CmABCC22和CmABCG3）具备转运活性化合物的功能，候选转运蛋白是否参与虫草素的转运有待进一步验证。

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基金资助

甘肃省科学院优秀青年基金项目(2024YQ-07)