功能化负载噬菌体磁靶向递送系统构建及对污水中耐药菌高效靶向去除作用

Construction of functionalized loaded phage magnetic targeted delivery system and its efficient targeted removal of drug-resistant bacteria in wastewater

摘要

为构建一种基于表面活性素（Surfactin）功能化修饰的负载噬菌体磁性纳米Fe₃O₄颗粒递送系统，用于污水处理的环境友好型纳米-微生物复合材料，本研究以水热合成法制备磁性纳米Fe₃O₄（MNs），通过1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐活化得到活化的MNs（AMNs），经Surfactin功能化修饰获得功能化的MNs（FMNs），再与不同噬菌体共同孵育形成复合体系（MNs-P、AMNs-P、FMNs-P）；通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒的形态与粒径分布；通过磁吸附试验评估FMNs的磁性；通过双层平板法测定噬菌体负载量并绘制吸附曲线；通过平板计数法评估不同修饰纳米颗粒的抗菌活性；通过结晶紫染色法检测其抑制生物被膜形成能力；通过回收试验评估其循环使用能力。结果表明：1）成功制备了平均粒径为（11.52±3.31） nm的MNs和（9.37±3.52） nm 的FMNs，TEM和磁吸附试验结果显示，纳米粒子呈现分散-团聚的微观形貌。FMNs较MNs分散性显著改善，粒径略有减小，且具备优异的磁响应性。2）噬菌体负载结果显示，FMNs可负载多种宿主菌属（如大肠杆菌、沙门菌）及不同形态（肌尾、长尾）的噬菌体，其中GEP101噬菌体负载量达2.44×10⁸ PFU/mL，负载率达85.12%。3）吸附曲线表明FMNs在0~2 h内负载噬菌体效率最高。4）抗菌试验和抑制生物被膜形成能力试验显示，FMNs-P（GEP101）在3 h内对大肠杆菌的杀菌率达96.82%，并且能够显著抑制生物被膜的形成。5）材料回收试验证明，经过3次循环使用后，FMNs-P仍然保持92.67%回收率和70.35%噬菌体负载率，显示出良好循环稳定性。综上，Surfactin显著提升了Fe₃O₄的分散性与噬菌体负载能力，FMNs-P兼具靶向清除耐药菌并抑制生物被膜和磁性回收能力，能有效减少试剂使用与二次污染风险。本研究为解决畜禽养殖场污水中的耐药菌污染问题提供了创新方案，有望推动纳米-微生物材料在环境修复领域的实际应用。

Abstract

The study was to construct a Surfactin-functionalized magnetic Fe₃O₄ nanoparticles loaded phage delivery system， as an environmentally friendly nano-microbial composite material for wastewater treatment. In this study， magnetic nano-Fe₃O₄ （MNs） was prepared by hydrothermal synthesis. Activated MNs（AMNs） were obtained by activation of 1-ethyl-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride， and functionalized MNs（FMNs） were obtained by Surfactin functional modification. Then， they were incubated with different phages to form composite systems （MNs-P， AMNs-P， FMNs-P）. The morphology and particle size distribution of nanoparticles were observed by transmission electron microscopy （TEM）. The magnetism of FMNs was evaluated by magnetic adsorption. The phage load was determined by double-layer plate method and the adsorption curve was drawn. The antibacterial activity of different modified nanoparticles was evaluated by plate counting method. The ability to inhibit biofilm formation was detected by crystal violet staining. The recycling ability was evaluated by recycling test. The results showed that： 1） MNs and FMNs with an average nanoscale diameter of （11.52±3.31） nm and （9.37±3.52）nm were successfully prepared， and TEM and magnetic adsorption test results showed that the nanoparticles exhibited a dispersed-agglomerated micro-morphology. A comparison of FMNs with MNs revealed that the dispersion of FMNs was significantly enhanced， the particle size was marginally reduced， and FMNs possessed exhibited strong magnetic responsiveness. 2） Phage loading results showed that FMNs can load phages of various host genera （such as Escherichia coli and Salmonella） and different morphologies （Myoviridae and Siphoviridae）. Among them， the loading amount of phage GEP101 reached 2.44×10⁸ PFU/mL， with a loading rate of 85.12%. 3） The adsorption curve indicated that FMNs exhibited the optimal phage loading efficiency within the initial 2 h. 4） Antibacterial test and inhibition of biofilm formation ability test showed that FMNs-P （GEP101） had a bactericidal rate of 96.82% against E.coli within 3 h and could significantly inhibit the formation of biofilm. 5） The material recovery test showed that FMNs-P still maintained a 92.67% recovery rate and a 70.35% phage loading rate after three cycles of use， demonstrating good cycle stability.In conclusion， Surfactin significantly improved the dispersibility of Fe₃O₄ and the loading capacity of phages. FMNs-P had the ability to target the removal of drug-resistant bacteria and inhibit biofilm and magnetic recovery， which could effectively reduce the risk of reagent use and secondary pollution. It provided an innovative solution to the problem of drug-resistant bacteria contamination in wastewater from livestock and poultry farms.

Graphical abstract

关键词

噬菌体 / Fe₃O₄ / 表面活性素 / 污水 / 耐药菌

Key words

bacteriophage / Fe₃O₄ / Surfactin / wastewater / resistant bacteria

抗生素常用于畜禽养殖领域，以促进动物生长和预防疾病。但抗生素在动物体内吸收不完全，大部分药物及其代谢产物会随粪尿排出，进而污染土壤和水环境，最终导致环境中耐药菌的产生^［1-2］；而动物排泄物也因此成为细菌耐药性传播的重要源头^［3-4］。养殖业中过度使用抗生素还会增加动物群体中耐药细菌的流行，使人类控制耐药菌感染更加复杂化^［5］。研究表明，噬菌体能够有效靶向并杀灭特定的耐药菌，减少对环境有益细菌的影响，在控制细菌种群、改善水质和处理污水等方面具有重要的潜力^［6-7］。Pallavali等^［8］从未处理的污水中成功分离出对多种耐药性细菌具有裂解活性的噬菌体；Lekota等^［9］利用噬菌体特异性裂解Klebsiella variicola，从而减少污水中的细菌负荷，控制水环境中病原菌的传播。尽管噬菌体在污水处理中展现出显著的应用潜力^［10］，但在复杂环境中大量投加噬菌体时，不仅可能导致宿主菌产生抗性，且噬菌体在水中只能通过扩散方式移动，缺乏主动靶向机制，进而降低其与耐药菌的结合及裂解效率^［11-13］，因此，仍需更多研究来优化其应用效果，如将噬菌体与其他材料结合使用。赵远超等^［14］将生物炭与噬菌体疗法结合，有效降低了土壤-蔬菜系统中耐四环素大肠杆菌和耐氯霉素铜绿假单胞菌的丰度。磁性纳米Fe₃O₄是材料科学、化学和物理学领域的研究热点之一，具有良好的生物相容性、高比表面积、稳定的化学性质、与污染物相互作用的能力强、优异的表面活性及环保特性，这些特性使其成为环境修复的良好候选材料之一^［15-17］。Shi等^［18］利用Fe₃O₄与零价铁耦合去除水中的重金属离子及有机污染物；Sharma等^［19］利用绿色合成的Fe₃O₄抑制水体中的有害微生物。然而，裸露的磁性纳米Fe₃O₄化学活性高，易氧化、易团聚^［20］。使用不同的化学修饰剂（如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、表面活性剂等），可改善Fe₃O₄的分散性和生物相容性，增强其应用潜力^［21］。表面活性素（Surfactin）是一种由芽孢杆菌属（Bacillus）微生物产生的脂肽类生物表面活性物质^［22］。Surfactin因其广泛的生物活性而备受关注，包括抗菌活性、抗病毒活性、抗真菌与抗植物病害等^［23-24］。Rahman等^［25］利用Surfactin包覆银纳米颗粒，其对耐药性铜绿假单胞菌表现出优异的抗菌及抗生物被膜活性。Surfactin能够降低不相容溶液间的表面张力，且经济环保，因此通过其对Fe₃O₄进行表面功能化，可以有效增强Fe₃O₄的适用性^［26］。因此，本研究旨在制备一种用表面活性素修饰的、简单高效且环境友好的功能化磁性纳米Fe₃O₄，并负载噬菌体，从而构建一种纳米-微生物材料，将噬菌体与Fe₃O₄进行联用，以发挥各自优势，靶向去除污水中的耐药菌，为环境友好型纳米-微生物材料在畜禽养殖场污水处理中的应用提供依据和参考。

1　材料与方法

1.1　主要试剂和仪器

四水氯化亚铁（FeCl₂·4H₂O），六水氯化铁（FeCl₃·6H₂O）购于上海麦克林生化科技股份有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC），表面活性素（Surfactin）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

LB琼脂培养基（Luria-Bertani Agar），LB肉汤（Luria-Bertani Broth），胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soy Broth）均购于青岛海博生物有限公司；污水采集自黑龙江省大庆市周边牧场，采集后于4 ℃保存。

水热合成反应器（KH-PPL 100 mL）购自西安仪贝尔仪器设备有限公司；钕磁铁（Nd₂Fe₁₄B）购自宁波宇烁磁性材料有限公司；酶联免疫分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）；高速冷冻型微量离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；透射电子显微镜（TEM）Talos-F200C（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2　菌株培养与噬菌体扩增

本试验所用菌株和噬菌体均保存于黑龙江八一农垦大学动物科技学院兽医公共卫生实验室，其中大肠杆菌ATCC 35150和肺炎克雷伯菌ATCC 700603购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC），其余菌株和噬菌体均由本实验室分离并保藏。参照潘顺圆等^［27］的方法，将实验室保存的大肠杆菌（ATCC 35150）作为宿主菌进行研究。将宿主菌在3 mL LB液体培养基中培养，37 ℃培养至对数生长期后将噬菌体与对数期宿主菌混合，37 ℃恒温振荡培养6~8 h，将培养物在12 000 g下离心 5 min，经0.22 µm滤器过滤，得到噬菌体扩增液。连续梯度稀释后，采用双层平板法测定噬菌体效价。宿主菌和噬菌体于4 ℃保存。

1.3　制备负载噬菌体的功能化磁性纳米Fe₃O₄

本研究通过水热合成法制备磁性纳米Fe₃O₄（MNs）。参照Peng等^［28］和张彩权^［29］的方法并稍作改动。将Fe³⁺∶Fe²⁺以摩尔比为2∶1进行混合，并加入氨水调节至pH≈10.0，于200 ℃反应8 h。冷却至室温后，用无水乙醇反复清洗。使用钕磁铁分离产物，并在60 ℃干燥，得到MNs。

参考Qamar等^［26］的方法对MNs进行修饰。将200 μL EDAC溶液与10 mg Fe₃O₄混合，低温超声分散，得到活化的磁性纳米Fe₃O₄（AMNs）。将AMNs与Surfactin按1∶1（mg/μL）的比例混合搅拌1 h，超声处理后，使用无水乙醇和蒸馏水交替洗涤3~5次后烘干，得到功能化的磁性纳米Fe₃O₄（FMNs）。

将噬菌体（10⁸ PFU/mL）分别加入到AMNs和FMNs中，振荡2 h，形成负载噬菌体的活化磁性纳米Fe₃O₄（AMNs-P）和负载噬菌体的功能化的磁性纳米Fe₃O₄（FMNs-P）。

1.4　形态及磁性表征

使用TEM观察Fe₃O₄形态并进行粒径分析。为确定FMNs的磁性性能，通过记录并比较其在水溶液中自然沉降和外加磁场作用下沉降时间及状态进行评价。

1.5　噬菌体负载量与负载率测定

参照周瑜桥^［30］的方法并稍作改动，通过双层平板法对噬菌体数量进行量化。公式如下：

噬菌体负载量/（PFU/mL）=噬菌体原液量（PFU/mL）－游离噬菌体量（PFU/mL）（1）

噬菌体负载率/%=噬菌体负载量（PFU/mL）/

噬菌体原液量（PFU/mL）×100%（2）

1.6　噬菌体的吸附曲线

将步骤1.2扩增得到的噬菌体按1∶1的比例加入FMNs中，于0、0.5、1、2、4、8、16和24 h，取等量上清液。通过双层平板法测定噬菌体效价，并绘制磁性纳米颗粒的噬菌体吸附曲线。

1.7　抗菌性能测定

参考Xu等^［31］的方法并稍作改动，确定负载噬菌体的磁性纳米颗粒的抗菌活性。将MNs、AMNs、FMNs、MNs-P、AMNs-P和FMNs-P用PBS悬浮。将50 μL宿主菌（OD₆₀₀ ≈0.3）与 100 μL悬浮液混合，总体积为2 mL。于37 ℃下培养3 h后，用PBS将菌液稀释10³倍。将稀释后的菌液（100 μL）均匀涂布在琼脂平板上，培养12 h并进行菌落计数。

1.8　抑制生物被膜形成能力测定

采用多功能酶标仪测定负载噬菌体的磁性纳米颗粒对生物被膜形成的抑制能力。参照孔祥宇等^［32］的方法，将过夜培养的宿主菌稀释至10⁶ CFU/mL，取100 μL稀释后菌液加入到96孔培养板中，对照组加入100 μL菌液，处理组分别加入100 μL噬菌体GEP101、MNs、AMNs、FMNs、MNs-P、AMNs-P和FMNs-P，37 ℃静置培养48 h后，取出96孔板，并去菌液，用PBS洗涤3次。每孔加入200 μL甲醇，固定15 min后弃去甲醇，通风干燥5 min。加入200 μL结晶紫，染色15 min。使用缓水流冲洗96孔培养板，以去除结晶紫染料。室温下通风干燥30 min，每孔加入200 μL 33%的冰醋酸，静置20 min。将处理好的96孔板置于酶标仪中，测定溶液在595 nm处的吸光值，每组做6个重复，并取平均值。

1.9　回收效率测定

按照Wei等^［33］的方法做出相应改动，确定负载噬菌体的磁性纳米颗粒的循环使用能力。将50 mg FMNs-P超声处理10 min，通过磁场对FMNs-P进行收集并用蒸馏水和无水乙醇交替洗涤3次，得到回收的FMNs-P。紫外照射30 min后进行干燥称重。按上述方法重复3次。

1.10　数据统计分析

试验数据应用GraphPad Prism 9软件进行单因素方差分析，图形应用Origin 2024软件进行绘制，结果用平均值±标准差表示。P<0.05为有统计学差异，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1　制备与表征

本研究通过水热合成法制备了磁性纳米Fe₃O₄颗粒，并使用EDAC和Surfactin对制备的磁性纳米Fe₃O₄颗粒进行表面活化和功能化修饰，制得活化的Fe₃O₄（AMNs）和功能化的Fe₃O₄（FMNs）。制备纳米材料的简易模式图如图1所示。

通过TEM对MNs和FMNs进行表征。结果表明，这些纳米颗粒个体多接近方形，不过存在团聚现象，多个方形颗粒聚集在一起，形成了不规则的簇状、团块状等集合形态，但单个颗粒的基础形状以方形为主。和MNs（图2（a））相比，FMNs（图2（d））分散性较好，团聚性较低，整体呈现出纳米材料典型的分散-团聚混合的微观形貌。通过选区电子衍射（SAED）检测，制备的MNs为多晶材料，Surfactin功能化修饰后（FMNs）并不会改变MNs的晶体性质。TEM检测表明，对（图2（a））和（图2（d））中颗粒大小测量分析得到（图2（c））和（图2（f）），制备的MNs颗粒直径大小分布在5~21 nm，其中多数分布于9~13 nm（图2（c））；FMNs颗粒直径大小分布在3~19 nm，其中多数分布于7~11 nm（图2（f））。如（图2（g）~（i））所示，FMNs在水中的悬浮液呈黑色浑浊，300 s内仍无法沉降；通过在侧壁和底部放置强磁铁可以缩短沉降时间，提高沉降效果，表明FMNs具有良好的磁响应性。

2.2　噬菌体载量测定

本试验所制备的FMNs可以负载不同宿主和不同形态的噬菌体，如肌尾的大肠杆菌噬菌体GEP101（PQ036202）与GEP191、克雷伯菌噬菌体LAL003（PQ658157）、沙门菌噬菌体pp003和长尾的变形杆菌噬菌体vb_PMC-PL1（PP502408）等。

根据公式（1）计算可得磁性纳米Fe₃O₄颗粒的噬菌体负载量，由公式（2）可得负载率。修饰前后磁性纳米Fe₃O₄颗粒的噬菌体负载量及负载率如表1所示。结果表明，EDAC和Surfactin活化与功能化修饰均能提高纳米Fe₃O₄颗粒的噬菌体负载量与负载率。相比之下，功能化修饰后的Fe₃O₄颗粒噬菌体负载量更高，负载率均达到70%以上。

2.3　噬菌体吸附曲线测定

FMNs负载噬菌体时，游离噬菌体效价随时间的变化如图3所示。游离噬菌体效价在0~2 h变化明显，表明FMNs在0~2 h负载噬菌体效率最高，至4 h时，噬菌体负载量达到最高。在4 h之后游离噬菌体效价的整体趋势随时间延长而逐渐降低，表明FMNs负载噬菌体的过程中，噬菌体稳定或少量释放至外界环境。

2.4　抗菌性能测定

如图4所示，FMNs-P（GEP101噬菌体）在3 h内，能够有效清除细菌（P＜0.001），其中FMNs-P组（图4（e））杀菌效果达到96.82%，抗菌效果明显优于噬菌体组（图4（b））和AMNs-P组（图4（d））（P＜0.001），证明Surfactin功能化修饰纳米Fe₃O₄能够有效地提高Fe₃O₄负载GEP101噬菌体后的抗菌活性。

2.5　抑制生物被膜形成能力测定

生物被膜是微生物生长并产生的胞外聚合物，能够为细菌提供物理屏障，使其能在恶劣环境中存活。因此，对不同修饰的Fe₃O₄负载噬菌体GEP101前后的抑制生物被膜形成能力进行了测定，结果如图5所示。宿主菌ATCC 35150所形成的生物被膜OD₅₉₅ 值约为0.359，噬菌体组和FMNs-P组的值约为0.156和0.132，均能显著抑制宿主菌形成生物被膜（P＜0.001）。其中，未负载噬菌体的处理组也能一定程度上抑制生物被膜的形成。

2.6　回收效率测定

如图6所示，负载GEP101噬菌体的FMNs在重复使用3次后回收效率仍约92.67%，噬菌体GEP101负载率仍约70.35%，证明功能化纳米Fe₃O₄颗粒具有良好的回收效率和循环使用能力。

3　讨 论

3.1　表征分析

本研究中，通过水热合成法合成的MNs平均纳米粒径为（11.52±3.31） nm，小于张彩权^［29］和Chen等^［34］通过水热合成法和简单的化学还原法合成的Fe₃O₄粒径，与Ba-Abbad等^［35］通过共沉淀法合成的Fe₃O₄平均粒径相近。FMNs平均纳米粒径为（9.37±3.52） nm，略小于MNs，同时颗粒聚集现象明显减轻，表明FMNs具有更高的分散性，进而具有更强的噬菌体负载能力。Fe₃O₄的粒径与比表面积大小成反比^［36］，比表面积是决定Fe₃O₄噬菌体负载能力的关键因素。对Fe₃O₄进行表面修饰，不仅可以改善其分散性和稳定性，还能进一步调控其粒径分布^［37］。MNs在水中静置短时间无法完全沉降，磁吸附能够定向移动和缩短沉降时间，表明制备的MNs具有优异的磁响应性能，优异的磁响应性能使其具有导向性和可回收性，通过施加磁场可实现定向移动，提高在特定区域的浓度，还可在使用后迅速地回收进行重复利用。

3.2　性能测定

MNs通过物理吸附或化学偶联与噬菌体结合。Wang等^［38］研究表明，噬菌体可以与磁性纳米颗粒共价结合，形成稳定的复合物，不仅保留了噬菌体的特异性识别能力，还增强了磁性分离和富集能力。本研究对不同噬菌体进行了负载能力测定。结果显示，FMNs能够负载不同宿主菌属和不同形态的噬菌体，噬菌体负载量均达到10⁸ PFU/mL，其中噬菌体GEP101负载量为2.44×10⁸ PFU/mL，负载率为85.12%。

FMNs-P的应用取决于噬菌体的负载与释放。研究结果表明FMNs能够在2 h内快速高效负载噬菌体。高效的噬菌体负载能够增强对耐药菌的捕获能力，从而提高清除效率。在4 h时，负载量达到最大值。噬菌体的缓慢释放能够提高FMNs-P持续使用能力，避免噬菌体局部大量释放，造成只能通过扩散作用在受污染水体中发挥作用，无法实现在外部磁场控制下的精准噬菌体递送^［39］。本研究制备的FMNs-P的噬菌体效价仅在4 h后略有降低，表明FMNs能够有效减缓噬菌体的释放，使FMNs-P的噬菌体负载量始终保持在较高水平。

噬菌体负载量取决于MNs表面修饰程度。高噬菌体负载量的非修饰Fe₃O₄能够捕获更多的细菌（约70%捕获效率），显著高于低负载量^［40］。其中，表面功能化修饰后的FMNs负载量明显高于表面活性化修饰的AMNs，远高于未修饰的MNs，这与Qamar等^［26］的研究结果相同。

通过将Fe₃O₄纳米颗粒与噬菌体结合，可以显著增强其抗菌和抗生物被膜性能。本研究制备的FMNs-P（GEP101）对宿主菌表现出显著抗菌活性和抑制生物被膜作用，效果明显优于AMNs-P和MNs-P。其中，噬菌体组与FMNs-P组相比具有显著差异，表明纳米颗粒与噬菌体联合应用能够增强抑菌效果，这与Xu等^［31］的研究结果相似。负载噬菌体的磁性纳米颗粒的优势之一是它们能够克服传统抗生素和独立噬菌体疗法的局限性，实现噬菌体在受污染水域的精准递送；优势之二是纳米颗粒可以被设计成对特定的环境信号（如pH值、温度）做出响应，从而在最佳的时间和地点实现噬菌体的可控释放；优势之三是具有特定靶向能力的磁性纳米颗粒可以降低对非目标微生物的损伤，从而保护了污水生态系统的平衡^［41-43］。因此，FMNs-P是一种具有广阔应用前景的抗菌策略，有望成为污水耐药菌的新型处理手段。

Fe₃O₄优异的磁响应性能使其能够在处理后快速地回收，从而实现资源的再利用并最大限度减少潜在的环境影响，在污水处理的实际应用中起着重要作用^［44］。本研究制备的FMNs回收效率较高，重复利用能力与Wei等^［33］的研究结果相近，重复3次后的回收效率约为92.67%，且噬菌体负载率仍能达到70.35%，表现出了良好的稳定性。FMNs不仅回收简单，而且可以强化与噬菌体的结合，增强复杂环境下的使用效率^［26］。相较于传统方式，这种方式减少了化学试剂的使用，降低了环境污染的风险。FMNs重复利用能力和低环境影响展现了其在环境科学中的潜在应用，通过无毒的合成方法与较高的回收效率，促进噬菌体的应用和可持续地管理水资源。

4　结 论

本研究通过对Surfactin修饰的功能化Fe₃O₄纳米颗粒的粒径、噬菌体载量、抗菌活性等性能分析，证明了FMNs能够有效负载多种噬菌体，并显著抑制生物被膜的形成和清除靶标菌。

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基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(31802226)

黑龙江省自然科学基金资助项目(LH2022C072)

黑龙江省生态环境保护科研项目(HST2024S018)

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2024-Y21)