Ralstonia生物炭菌剂对重金属污染菜地土壤细菌群落结构及氮磷钾碳含量的影响

Impact of Ralstonia-inoculated biochar on bacterial community structure and nitrogen, phosphorus, potassium, and carbon content in vegetable soil polluted with heavy metals

摘要

为阐明西红柿秸秆生物炭及Ralstonia生物炭菌剂（Ralstonia-inoculated biochar）对蔬菜种植园土壤细菌群落多样性和养分含量的影响，以盆栽种植芥菜为研究对象，盆栽土为菜地土壤和重金属复合污染土壤，分别设置重金属污染、西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂的共13种不同处理，每个处理3个重复，在芥菜收获期测定不同处理下土壤的细菌群落结构、差异菌群数量和氮磷钾碳含量等，探究西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤优势细菌丰度、外源菌Ralstonia存活和土壤供肥能力的影响，以及改善重金属复合污染菜地土壤的能力。结果表明：西红柿秸秆经过高温碳化得到热解生物炭和水热生物炭在性质和官能团方面差异较大， 均能与Ralstonia菌体固定化制备成Ralstonia生物炭菌剂；西红柿秸秆生物炭+Ralstonia有效提高菜地土壤的细菌丰富度，增加优势菌Proteobacteria（门水平，47.92%~72.44%）和Rhodanobacter（属水平，24.11%~51.18%）的相对丰度，并提高差异菌群数量（8~12个）和维持外源菌Ralstonia长期存活（0.32%~1.23%）；与此同时，Ralstonia生物炭菌剂增加菜地土壤的碱解氮（7.53%~35.44%）、硝态氮（1.57%~22.24%）、有效磷（1.46%~50.04%）、速效钾（1.03%~6.57%）和有机炭（129.20%~239.45%），并减少铵态氮残留（19.69%~49.45%）；与单施西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）或Ralstonia相比，Ralstonia生物炭菌剂高效改善菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌群落结构和氮磷钾碳含量，并能缓解西红柿秸秆生物炭或Ralstonia对菜地土壤细菌菌群生长的抑制。综上，Ralstonia西红柿秸秆生物炭菌剂兼具不同类型西红柿秸秆生物炭和外源菌Ralstonia的优点，能有效改善菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌丰富度、优势菌丰度、差异菌群数量和氮磷钾碳含量，对促进西红柿秸秆资源化利用和改良蔬菜种植园土壤肥力具有重要的应用潜力 。

Abstract

To clarify the impact of tomato straw biochar and Ralstonia-inoculated biochar on bacterial community diversity and nutrient content in vegetable cultivation soil， the potted mustard plants are used as the research object； the pot soil is either vegetable soil or soil contaminated with heavy metals. Thirteen different treatments were set up， including heavy metal pollution， tomato straw biochar， and Ralstonia-inoculated biochar， with three replicates for each treatment. During the harvest period， the bacterial community structure， differential bacterial populations， and the contents of nitrogen， phosphorus， potassium， and carbon in the soil were measured. The effects of tomato straw biochar and Ralstonia-inoculated biochar on the relative abundance of dominant bacteria， exogenous Ralstonia survival， and soil fertilizer supply capacity， as well as the ability to improve the vegetable soil contaminated with compound heavy metals， were determined. The results indicate that： High-temperature carbonization of tomato straw generated pyrolysis biochar and hydrothermal biochar with significant differences in properties and functional groups， both of which can immobilize Ralstonia cells to prepare Ralstonia-inoculated biochar. Tomato straw biochar+Ralstonia treatment effectively improved bacterial richness and increased the relative abundance of dominant bacteria Proteobacteria （Phylum level， 47.92%-72.44%） and Rhodobacter （Genus level， 24.11%-51.18%）； Moreover， it increased the number of differential bacterias by 8 to 12 and maintained the long-term survival of exogenous Ralstonia （0.32%-1.23%）. The Ralstonia-inoculated biochar treatment increased the alkaline hydrolyzed nitrogen （7.53%-35.44%）， nitrate nitrogen （1.57%-22.24%）， available phosphorus （1.46%-50.04%）， available potassium （1.03%-6.57%）， and organic carbon （129.20%-239.45%） and reduced ammonium nitrogen residue （19.69%-49.45%） in vegetable soil. Compared with the application of tomato straw biochar （Pyrolysis biochar and hydrothermal biochar） or Ralstonia alone， the Ralstonia-inoculated biochar effectively improved bacterial community structure and increased the content of nitrogen， phosphorus， potassium， and carbon in the vegetable soil and the vegetable soil polluted by compound heavy metals. It alleviated the inhibition of tomato straw biochar or Ralstonia on the growth of bacterial communities in vegetable soil. In conclusion， Ralstonia-inoculated tomato straw biochar combines the advantages of different types of tomato straw biochar and exogenous Ralstonia effectively improving bacterial richness， dominant bacteria abundance， differential bacterial number， and the contents of nitrogen， phosphorus， potassium， and carbon in vegetable soil and soil polluted by compound heavy metals. It has considerable application potential for promoting the resource utilization of tomato straw and improving the soil fertility in vegetable plantations.

Graphical abstract

关键词

罗尔斯通氏菌 / 外源菌固定化 / 西红柿秸秆生物炭 / 重金属复合污染 / 细菌群落结构 / 菜地土壤养分

Key words

Ralstonia / exogenous bacteria inoculation / tomato straw biochar / heavy metal compound pollution / bacterial community structure / vegetable soil nutrients

2018年我国西红柿种植面积已突破101.17万hm^2［1］。然而，西红柿规模化种植产生大量废弃秸秆，直接焚烧易造成空气污染和浪费秸秆有机质^［2-3］，因此探索西红柿秸秆资源化利用十分必要。含纤维素、半纤维素和木质素的秸秆，是碳化制备生物炭的重要材料^［4］。生物炭的制备方法主要有2种：1）高温碳化法制备热解生物炭。高温（>500 ℃）缺氧条件下将农业有机物碳化为碱性（pH>7）、理化性质稳定和多孔富炭的固态物质^［5］；2）水热裂解法制备水热生物炭。以水为反应介质（温度200~320 ℃），在密封压力容器内将有机高聚物热解断裂为富含香环、羟基和羧基等官能团的黑色固体物质^［6］。将秸秆制备成生物炭，具有制备方法多样、技术成熟和无污染输出等优点，但由于制备方式不同，热解生物炭和水热生物炭的理化性质、pH和官能团存在显著差异^［5-6］。将西红柿秸秆碳化制备成热解生物炭和水热生物炭，并改良菜地土壤，对研究不同类型的秸秆生物炭改善蔬菜种植园土壤和推动西红柿秸秆资源化利用具有重要意义。

设施菜地土壤中，Cu、Zn和Cd的总量和有效态含量呈现不断累积趋势，重金属含量是露天栽培土壤的1.57~3.28倍，影响蔬菜长期种植^［7］。此外，已有研究表明设施菜地土壤重金属Cd、Cr、Pb、Cu和As等的复合污染问题日益突出^［8］；全国部分省市蔬菜种植区土壤的Pb、Cd和Cu含量超标^［9］，破坏了土壤微生物群落多样性和引起土壤肥力下降^［10］。秸秆碳化制备的生物炭在改善土壤理化性质、增加土壤肥力和修复重金属污染等发挥着重要作用^［11］。因此，探索以西红柿秸秆为原材料制备不同类型的生物炭的途径，有助于拓宽改善重金属复合污染土壤的思路。

生物炭作为土壤改良剂有效改善土壤理化性质、提高养分含量和固持重金属^［12］，其丰富的孔隙结构、稳定的理化性质和富含微量元素，为外源菌长期存活提供良好的土壤微环境和养分来源^［13］。生物炭促使土壤特定微生物种群生长^［14］，改善土壤菌群的活性和多样性^［15］。此外，生物炭固定化外源细菌，具有菌种类型丰富、技术资料齐全和易于就地实施等优势^［16］。从重金属污染土壤分离出的Ralstonia sp.能耐受高浓度的Cu和Zn^［17］。Ralstonia对Cd、Cr、Pb、Cu和Zn等重金属具有较高的耐受浓度和吸附效率，且生物炭可以维持Ralstonia存活在养分匮乏的土壤里^［18-19］，能显著提高施肥土壤中脲酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶等氧化酶活性和促进土壤氮磷转化^［20］。

虽然生物炭广泛用于吸附重金属、促进细菌菌群生长和改善土壤肥力，且生物炭制备技术较为完备，然而不同类型秸秆生物炭和土壤高丰度菌共同作用于重金属复合污染菜地土壤细菌群落结构和养分供给量的相关研究尚少。因此，为明确西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、重金属抗性菌Ralstonia和重金属复合污染对菜地土壤细菌群落结构及氮碳组分的作用机制，本研究拟以轮作西红柿和芥菜的菜地土壤为研究对象，设置热解生物炭、水热生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂（Ralstonia-inoculated biochar）治理重金属复合污染菜地土壤的盆栽试验，探究西红柿秸秆生物炭及Ralstonia生物炭菌剂作用于重金属复合污染菜地土壤及其细菌群落结构、优势菌相对丰度和氮碳转化的有效性，以期为西红柿秸秆资源化利用、秸秆生物炭固定重金属抗性菌和改良重金属复合污染菜地土壤提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料及供试土壤理化性质

西红柿秸秆收集自福建省泉州市某蔬菜种植园，自然条件下晒干。Ralstonia菌现保存在福建省农业科学院资源环境与土壤肥料研究所和中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 17565）。盆栽土壤取自福建省三明市大田县，在轮作西红柿和芥菜的菜园（面积＞500 m²）选取8个点位，每个位点周围随机确定10~12个取样点，去除表层土壤（5 cm）后挖取5~6 kg土壤，最终土壤取样量>400 kg。土壤在避光条件下自然风干，碾磨成细小颗粒后过100目筛子。土壤的pH、电导率（Electrical conductivity，EC）和氧化还原电位（Oxidation-reduction potential，Eh）为5.68、127.21 µS/cm和162.37 mV；有机碳、总磷、总氮和总钾的含量为7.16 g/kg、2 237.42 mg/kg、0.69%和1.26%；重金属Cd、Cr、As、Pb和Cu的含量为0.02、5.53、0.81、6.24和27.43 mg/kg（根据GB 15618—2018《土壤环境质量—农用地土壤污染风险管控标准（试行）》^［22］与袁国军等研究^［23］，此土壤重金属含量低于土壤污染风险管控标准）。选生长周期为60~90 d的芥菜品种（Brassica juncea （L.） Czern），在福州市资源环境与土壤肥料研究所的蔬菜大棚种植芥菜苗，盆栽试验时间为3—7月。

1.2　制备生物炭及Ralstonia生物炭菌剂

高温缺氧碳化法制备西红柿秸秆热解生物炭：裂解温度900 ℃，维持时间2 h（马弗炉Box resistance furnace，BSX2-5-12TP，中国上海一恒科学仪器有限公司），生物炭粉末过50目筛子。水热密闭裂解法制备西红柿秸秆水热生物炭：将西红柿秸秆放入反应釜（HTLAB HT Reactor，HT-1000FJ，中国上海霍桐实验仪器有限公司），并加入ddH₂O（Double distilled water，双重去离子水）淹没秸秆，热解温度300 ℃，裂解时间6 h；反应结束后，用定性滤纸（Q5775-600 mm-100EA）去除反应液，生物炭用ddH₂O洗涤3次后，75 ℃烘干至恒重。1 mL Ralstonia新鲜菌液（OD_{600 nm}=0.65，含2.15×10⁸个菌^［20］，OD（Optical density，光密度））和999 mL无菌ddH₂O充分混匀。5 g生物炭分批加入到250 mL稀释菌液（持续搅拌），确保生物炭悬浮于菌液；150 r/min（25 ℃）培养2 h，培养液离心5 min（25 ℃，4 000 r/min），得到Ralstonia生物炭菌剂^［15］。为便于和Ralstonia生物炭菌剂作为对照，5 g生物炭和250 mL ddH₂O混匀，获得含水生物炭。

1.3　盆栽试验设计及土壤样品收集

根据GB 15618—2018《土壤环境质量：农用地土壤污染风险管控标准（试行）》^［22］与袁国军等研究^［23］，土壤Cd、Cr、Pb、Ni和Cu的风险筛选值分别为0.30、150、90、70和50 mg/kg （5.50<pH≤6.50）。据此设计处理组，详见表1。低浓度重金属处理包括：添加Cd²⁺、Cr³⁺ 、Pb²⁺、Ni²⁺和Cu²⁺，使土壤重金属含量处于风险筛选值。高浓度重金属处理：添加Cd²⁺、Cr³⁺ 、Pb²⁺、Ni²⁺和Cu²⁺，使土壤重金属含量明显超标，其含量分别是风险筛选值的5.00、2.40、3.00、4.37和3.33倍。使用的重金属盐为CdCl₂.5/2H₂O、Cr（CH₃COO）₃、PbC₄H₆O₄.3H₂O、NiCl₂.6H₂O和CuSO₄.5H₂O。

试验共设13个处理（含初始菜地土壤），每一个处理重复3次。每个花盆装土5 kg，有机肥2 g，复合肥（m（N）∶m（P₂O₅）∶m（K₂O）=15∶17∶13）1 g，Ralstonia生物炭菌剂或含水生物炭 5 g。如表1所示，将初始菜地土壤、肥料、重金属盐和Ralstonia生物炭菌剂（或含水生物炭）充分混合后，置于蔬菜大棚陈化2周以上。选株高约10 cm的芥菜幼苗，每个花盆移栽2株。在芥菜花蕾期，收集花盆全部土壤，磨碎后保存于‒20 ℃冰箱。新鲜土样（10~20 g）送生物公司进行土壤细菌高通量测序分析^［21］。

1.4　测定土壤碳氮磷及生物炭官能团

新鲜土壤加入0.50 mol/L KCl溶液（m（KCl）∶V（ddH₂O）=1∶10），室温振荡1 h（180 r/min）；普通定性滤纸过滤后，用微孔滤膜（MCE Menbrane Filter，孔径：0.45 μm，上海新亚）抽滤一次；流动分析仪（Skalar Analytlcal B.V.P.O BOX 3237，Netherlands）测定滤液的硝态氮和铵态氮，岛津TOC仪（SHIMADZU TOC-V CPH，OCT-1，Japan）测定滤液总有机碳（Total organic carbon，TOC）。土壤样品风干后碾磨成粉末状，并过200目筛子；土壤加入0.50 mol/L NaHCO₃溶液（m（NaHCO₃）∶V（ddH₂O）=1∶20），室温振荡30 min；用定性无磷滤纸和微孔滤膜抽真空过滤；流动分析仪测定滤液可溶性磷总量。参考李晓菲^［24］和鲁如坤^［25］提供的土壤农化分析方法测定土壤的碱解氮和速效钾。充分碾磨生物炭和溴化钾（m（生物炭）∶m（溴化钾）=1∶100），压成薄饼后置于FTIR（Fourier transform infrared spectroscopy，Nicolet iS 50 FT-IR，USA）光谱仪测定波长4 000~500 cm^-1 的红外光谱图，用Omnic 8.20软件分析官能团的类型和数量。

1.5　数据分析及图表绘制

数据统计分析使用R语言（https：//www.r-project.org/）。图表绘制使用R语言和Microsoft Excel 2021。采用单因素方差分析和Duncan法进行差异显著性分析，* P<0.05；** P<0.01。基于上海美吉生物云平台（https：//www.majorbio.com/）提供的数据分析软件和可视化分析方法分析土壤细菌群落多样性，主要分析软件和方法如下：聚类分析、主成分分析和Heatmap热图聚类采用R-3.3.1（vegan软件包）的UPGMA算法和加权UniFrac距离分析法。Alpha多样性指数、群落组成、多组比较分析和LEfSe分析分别用Mothur 1.30.2软件、python-2.7、R-3.3.1（stat软件包）和R-3.3.1（LDA>3.50）。线性判别分析（Linear discriminant analysis（LDA）Effect Size，LEfSe）用于分析对土壤可能产生重要作用的差异菌群（Biomarker）^［20］。高通量测序的原始序列已提交到美国国家生物技术信息中心的SRA公共数据库（NCBI SRA，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），登录号为SRR13069618和SAMN16796015（BioSample）。

2　结果与分析

2.1　西红柿秸秆生物炭的理化性质及官能团分析

不同制备方式下，比较西红柿秸秆热解生物炭和水热生物炭的官能团特征，详见图1。可见西红柿秸秆热解生物炭和西红柿秸秆水热生物炭的官能团类型及数量存在明显差异，且官能团主要集中在2个吸收峰区域（绿色和紫色的虚线框所示）。其中：热解生物炭吸收峰数量高达18个，主要官能团为C-O（饱和酯）、C-O-C（脂肪醚）、R-O（醚）、C=O（羧酸）、C=C（芳环）、C-N（酰胺）和N-H（胺）；水热生物炭吸收峰数量有9个，主要官能团为C-H（烯烃）、C=O（羧酸）、O-H（醇酚）和N-H（胺）。此外，热解生物炭的pH、EC和总碳分别为10.26、1 491 μS/cm和56.18%；水热生物炭的pH、EC（生物炭未用ddH₂O清洗）和总碳分别为5.93、7 632 μS/cm和27.51%。结果表明，不同碳化条件制备的西红柿秸秆生物炭，其官能团、pH、EC和总碳有明显差异，且水热生物炭的官能团数量多于热解生物炭。

2.2　菜地土壤的细菌群落组成及优势菌相对丰度变化

对比西红柿秸秆生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤细菌群落结构的差异性影响，详见图2（a）和（b）。可见热解生物炭、水热生物炭、Ralstonia及其制备的Ralstonia生物炭菌剂明显改变土壤细菌群落多样性和优势菌相对丰度（丰度>0.20%）。其中，优势菌Proteobacteria（门水平，30.78%）和Rhodanobacter（属水平，4.76%）受低浓度和高浓度的复合重金属胁迫时，其相对丰度增加到30.90%~45.32%和11.40%~19.76%；西红柿秸秆生物炭+Ralstonia处理后，其相对丰度进一步增加到24.11%~51.18%和24.11%~51.18%。此外，重金属复合污染和西红柿秸秆生物炭+Ralstonia也改变土壤优势菌Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria和Bacteroidetes（门水平，合计31.56%）的相对丰度，优势菌Arthrobacter（属水平）的相对丰度增加到2.16%~22.66%。低浓度重金属和高浓度重金属处理时，Rhodanobacter、Arthrobacter、Gaiellales和Micropepsaceae等优势菌仍保持较高的相对丰度，且部分优势菌的相对丰度在低浓度重金属和高浓度重金属胁迫下基本相同。外源菌Ralstonia在对照组土壤（CK_O、CK_L和CK_H）和生物炭处理组（L1、L3、H1和H3）无法检出；在Ralstonia处理组（L5和H5）和Ralstonia生物炭菌剂处理组（L2、L4、H2和H4），Ralstonia相对丰度为0.32%~1.23%，成为菜地土壤主要优势菌之一。结果表明，复合重金属污染、西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂作用于菜地土壤细菌群落结构，且热解生物炭和水热生物炭剂明显增加土壤优势菌相对丰度和维持外源菌Ralstonia长期存活。

据此，进一步比较热解生物炭、水热生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤细菌多样性及丰富度的影响，详见表2。Shannon指数（数值越大，多样性越高）和Simpson指数（数值越小，多样性越高）反映土壤细菌群落多样性，ACE和Chao1指数（数值越大，丰富度越高）反映土壤细菌群落丰富度。可见西红柿秸秆生物炭和Ralstonia及其制备的Ralstonia生物炭菌剂显著降低重金属复合污染菜地土壤细菌的多样性和丰富度（P<0.05）。其中：Shannon减少15.37%~24.87%，Simpson增加687.10%~1 393.55%；ACE减少15.58%~25.63%；Chao1减少15.77%~28.98%（CK_O为对照组）。与此同时，重金属复合污染同样降低菜地土壤细菌的多样性和丰富度，且高浓度重金属处理的土壤细菌丰富度下降幅度高于低浓度重金属处理，但西红柿秸秆生物炭+Ralstonia增加重金属复合污染菜地土壤细菌丰富度（ACE和Chao1分别增加2.18%~28.02%和2.83%~22.29%），恢复土壤部分细菌的生长活性。结果表明，重金属复合污染、西红柿秸秆生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂显著降低菜地土壤细菌的多样性和丰富度，但西红柿秸秆生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂增加重金属复合污染土壤细菌丰富度。综上，西红柿秸秆生物炭及Ralstonia生物炭菌剂作用于重金属复合污染菜地土壤的细菌群落多样性、优势菌生长和外源菌存活。

2.3　西红柿秸秆生物炭+Ralstonia作用下土壤细菌群落的差异性分析

施用热解生物炭、水热生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂时，比较土壤细菌群落的差异性，见图3（a）和（b）。可见：综合层级聚类分析和主成分分析（主成分解释83.40%），菜地土壤细菌群落可分为5大类（属水平）：Ⅰ（L5和H5，黑色虚线框），Ⅱ（L1、L3、H1和H3，红色虚线框），Ⅲ（L2、L4、H2和H4，蓝色虚线框），Ⅳ（CK_L和CK_H，绿色虚线框）和Ⅴ（CK_O）。研究结果表明，依据土壤细菌群落分布距离，重金属复合污染（CK_L和CK_H）改变菜地土壤（CK_O）细菌种群组成；热解生物炭（L1和H1）和水热生物炭（L3和H3）处理时，土壤细菌种群组成保持相似；Ralstonia热解生物炭菌剂（L2和H2）和Ralstonia水热生物炭菌剂（L4和H4）处理时，其土壤细菌种群组成也相似，但不同于Ralstonia处理（L5和H5）和西红柿生物炭处理（L1、H1、L3和H3）。综上，重金属复合污染改变菜地土壤细菌种群组成，且添加西红柿生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂，其相互之间的细菌种群组成也存在差异性。

2.4　西红柿秸秆生物炭+Ralstonia对土壤高丰度菌相对丰度及差异菌群的影响

比较西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤高丰度菌相对丰度的影响，见图4和图5。由图4（a）和（b）可见，在低浓度和高浓度的重金属（Cd、Cr、Pb、Ni和Cu）复合污染菜地土壤，热解生物炭、水热生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂改变Rhodanobacter、Gaiellales和Micropepsaceae等土壤主要高丰度菌的相对丰度，其中Ralstonia生物炭菌剂促进高丰度菌Rhodanobacter生长，同时外源菌Ralstonia（红色字体标示）相对丰度在不同处理组差别明显。结果表明，西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂作用于菜地土壤及重金属复合污染土壤的高丰度菌相对丰度。此外，由图5可见，Rhodanobacter、Arthrobacter和Gaiellales等高丰度菌（Top 50，合计75.94%）的相对丰度在西红柿秸秆生物炭+Ralstonia的处理组保持相似性（红色），Ralstonia相对丰度在Ralstonia处理组（L2、H2、L4、H4、L5和H5）的变化趋势相同（蓝色转为红色），并且32%高丰度菌和外源菌Ralstonia的相对丰度变化与Ralstonia生物炭菌剂密切相关。结果表明，菜地土壤及重金属复合污染土壤的高丰度细菌生长与西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂存在相关性。

比较不同处理组对菜地土壤产生重要作用的差异菌群数量，见表3。可见，西红柿秸秆生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂明显减少菜地土壤差异菌群数量。菜地土壤（CK_O）差异菌群数量高达26个，低浓度或者高浓度的复合重金属污染，其差异菌群数量剧减到4~10个，明显抑制菜地土壤差异菌群生长；单施西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）（L1、H1、L3和H3）或Ralstonia（L5和H5）时，差异菌群数量进一步减少到1~7个，对菜地土壤及重金属复合污染土壤的差异菌群具有强烈抑制效应；然而，添加Ralstonia生物炭菌剂（L2、H2、L4和H4），差异菌群数量恢复性增加到8~12个。此外，外源菌Ralstonia在Ralstonia水热生物炭菌剂处理组（L4和H4）成为土壤差异菌株（红色字体标示）。研究结果表明，重金属复合污染、西红柿秸秆生物炭和Ralstonia抑制菜地土壤及重金属复合污染土壤的差异菌生长，但Ralstonia生物炭菌剂能增加菜地土壤差异菌的生长活性。综上，Ralstonia生物炭菌剂促使重金属复合污染菜地土壤高丰度菌和外源菌Ralstonia持续生长，并缓解西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和Ralstonia对菜地土壤差异菌群的抑制作用。

2.5　 Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤氮磷钾碳含量的影响

比较西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤氮组分的影响，见图6。可见，西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂显著作用于菜地土壤的碱解氮、硝态氮和铵态氮含量（P<0.05）。菜地土壤（CK_O）的碱解氮、硝态氮和铵态氮为24.76、65.22和29.47 mg/kg。其中，添加西红柿秸秆生物炭（L1、H1、L3和H3）、Ralstonia（L5和H5）和Ralstonia生物炭菌剂（L2、L4、H2和H4），菜地土壤的碱解氮显著增加7.53%~15.51%、3.18%~6.67%和18.35%~35.44%（含量29.88~34.36 mg/kg），同时硝态氮增加1.57%~4.10%、7.89%~8.86%和18.42%~22.24%（P<0.05）；添加西红柿秸秆水热生物炭（L3和H3），土壤铵态氮增加1.90%~5.89%，但添加Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂，土壤铵态氮显著减少19.69%~25.62%和35.27%~49.45%（P<0.05）。此外，在低浓度或者高浓度的复合重金属污染土壤，碱解氮和硝态氮的增加幅度以及铵态氮的减少幅度基本相同。研究结果表明，相对于单施西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）或Ralstonia，Ralstonia生物炭菌剂更有效增加菜地土壤（CK_O）及其重金属复合污染土壤（CK_L或CK_H）的碱解氮和硝态氮含量，并减少铵态氮残留量（P<0.05）。

比较西红柿秸秆生物炭、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂对菜地土壤磷钾碳的影响，见图7。可见，西红柿秸秆生物炭显著增加土壤有机碳含量，西红柿秸秆水热生物炭+Ralstonia作用于土壤有效性磷钾。菜地土壤（CK_O）的有效磷和速效钾为19.67、37.81 和376.98 mg/kg。其中，添加西红柿秸秆生物炭（L1、H1、L3和H3）、Ralstonia（L5和H5）和Ralstonia生物炭菌剂（L2、L4、H2和H4），菜地土壤的有效磷显著增加1.46%~7.25%、16.16%~16.46%和35.15%~50.04%，速效钾增加1.03%~5.36%、5.80%~6.57%和14.17%~21.56%。菜地土壤有机碳含量为376.98 mg/kg（CK_O），添加西红柿秸秆热解生物炭（L1和H1）和Ralstonia热解生物炭菌剂（L2和H2），有机碳增加227.75%~239.45%（含量1 207.26~1 267.72 mg/kg）；添加西红柿秸秆水热生物炭（L3和H3）和Ralstonia水热生物炭菌剂（L4和H4），土壤有机碳增加129.20%~132.76%（含量855.98~878.25 mg/kg）。此外，在低浓度或者高浓度的重金属复合污染土壤，有效磷、速效钾和有机碳的增加趋势基本一致。研究结果表明，与添加西红柿秸秆生物炭或Ralstonia相比，Ralstonia生物炭菌剂更有效增加菜地土壤及重金属复合污染土壤的有效磷和速效钾；菜地土壤有机碳主要源于西红柿秸秆生物炭，但Ralstonia生物炭菌剂与西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）等效增加土壤有机碳含量。综上，Ralstonia生物炭菌剂综合了西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和外源重金属抗性菌Ralstonia作用于菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌群落活性和优势菌相对丰度，实现其共同改善土壤碱解氮、硝态氮、有效磷、速效钾和有机碳的持续供肥能力，并降低菜地土壤铵态氮残留可能产生的副作用。

3　讨 论

3.1　西红柿秸秆生物炭及Ralstonia菌体制备生物炭固定化菌剂

农业有机废弃物不同裂解方式得到理化性质、pH和官能团等差异显著的生物炭^［5-6］，西红柿秸秆不同碳化方式，得到pH、EC、总碳和官能团等明显差异的热解生物炭和水热生物炭，并且水热生物炭官能团的类型和数量多于热解生物炭，这与高温缺氧碳化法和水热密闭裂解法制备的生物炭，其有机碳含量和官能团类型存在较大差异的研究结果基本一致^［26-27］。养分组成、有机碳含量和多孔径结构等差异较大的秸秆生物炭，分别与外源菌固定化制备成生物炭菌剂，为细菌长期存活提供良好的土壤微环境和养分供给^［12］，面临着生物炭固持能力和维持功能菌活性的双重挑战。西红柿秸秆的热解生物炭和水热生物炭均能固定化Ralstonia菌体制备成Ralstonia生物炭菌剂，并增强土壤优势菌（Proteobacteria（门水平，47.92%~72.44%），Rhodanobacter（属水平，24.11%~51.18%））和外源菌Ralstonia的生长活性，有效维持生物炭长期固定外源菌Ralstonia和促进土壤高丰度菌生长。生物炭的盐离子能降低土壤氢离子和交换性铝离子水平，缓解土壤重金属毒性^［28］，有利于外源菌在重金属污染的土壤存活，但单施生物炭治理高浓度重金属和重金属复合污染的农田土壤，受限于生物炭施用量和制备高活性生物炭^［21］。低浓度和高浓度的重金属复合污染菜地土壤，施用Ralstonia生物炭菌剂能提高细菌群落活性和增加高丰度菌相对丰度，实现西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和重金属抗性菌Ralstonia共同改善重金属（Cd、Cr、Pb、Ni和Cu）复合污染土壤。本研究结果表明，西红柿秸秆通过不同碳化方式制备的热解生物炭和水热生物炭，均能增强菜地土壤细菌群落活性和固定外源功能菌，为西红柿秸秆碳化制备成不同类型的秸秆生物炭及生物炭固定化菌剂，治理重金属复合污染土壤提供重要支撑。

3.2　西红柿秸秆生物炭+Ralstonia改善重金属复合污染土壤的优势菌群结构

西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）、Ralstonia和Ralstonia生物炭菌剂显著增加菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌丰富度（增加2.18%~28.02%）和优势菌相对丰度，其中Proteobacteria（门水平，30.78%）^［29］和Rhodanobacter（属水平，4.76%）^［30］的相对丰度增加至47.92%~72.44%和24.11%~51.18%，外源菌Ralstonia^［18］成长为高丰度菌（0.32%~1.23%）。土壤部分优势菌Proteobacteria（门水平）丰度变化与重金属（Cd、Pb和Mn等）密切相关^{［29，31］}，土壤天然存在的优势菌Rhodanobacter（属水平）耐受Cd、Cu和Zn等重金属^{［30， 32-33］}，存活于重金属（Cd、Cr和Cu等）污染土壤的Ralstonia吸附土壤重金属和改善土壤微生物群落结构^{［18-19， 34］}，这说明部分Proteobacteria（门水平）以及Rhodanobacter和Ralstonia（属水平）为土壤重金属细菌，西红柿秸秆生物炭和Ralstonia生物炭菌剂显著增强其生长活性；此外，Ralstonia生物炭菌剂吸附土壤重金属^［18-19］和改善细菌栖息地^［35］，且生物炭的养分组成和孔隙结构可刺激土壤特定细菌激发生长活力和增加相对丰度^［36-37］，有效促进土壤部分重金属抗性菌（Proteobacteria（门水平）、Rhodanobacter（属水平）和外源菌Ralstonia）持续生长^［38］和提高优势菌群生长活性，从而改善重金属复合污染土壤的优势细菌群落结构^［39］。与此同时，优势菌（Rhodanobacter、Arthrobacter和Gaiellales等）和外源菌Ralstonia增加相对丰度造成菜地土壤细菌多样性下降，但Ralstonia生物炭菌剂增加菜地土壤差异菌群数量^［20］，并缓解单施西红柿秸秆生物炭或Ralstonia对土壤细菌菌群生长的抑制作用。此外，Rhodanobacter相对丰度变化在低浓度和高浓度的重金属复合污染土壤仍保持基本相同，表现出较强的生长活性。本研究表明，西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和Ralstonia生物炭菌剂能增强土壤细菌群落活性、促进土壤高丰度菌生长和维持外源菌长期存活，为西红柿秸秆生物炭和土壤高丰度重金属细菌共同改善菜地土壤及重金属复合污染土壤的优势菌群结构提供重要依据。

3.3　 Ralstonia生物炭菌剂维持菜地土壤及重金属复合污染土壤的供肥能力

西红柿秸秆碳化制备的热解生物炭和水热生物炭均能增加菜地土壤的氮碳磷钾且改善重金属复合污染菜地土壤的肥力，具备秸秆生物炭富含碳、氮和磷等营养元素^［5］，并吸附土壤氮磷钾、固持土壤铵态氮和减少硝态氮淋溶流失的特征^［40-41］，对富含重金属的农田土壤具有修复潜力。菜地土壤及重金属复合污染土壤单施Ralstonia，有效促进土壤硝态氮和铵态氮的转化，同时增加土壤有效磷，这与Ralstonia增强施肥土壤氧化酶活性、高效转化土壤无机氮和增加磷酸盐含量的研究结果一致^［20］，明确Ralstonia能提高重金属复合污染土壤氮磷的有效态含量。然而，单施生物炭或功能菌促进土壤氮形态转化和可溶性磷钾溶出，存在着增加生物炭施用量高和菌株衰老解体的难题^{［17， 21］}，结合生物炭和功能菌是维持土壤养分转化和改善土壤供肥能力的重要途径。与菌株制成的固体菌肥^［42-43］和微生物菌肥^［44］提高土壤肥力指标相比，西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和重金属抗性菌Ralstonia固定化制备的Ralstonia生物炭菌剂，同样显著增加菜地土壤及重金属复合污染土壤的碱解氮、硝态氮、有效磷、速效钾、有机质和有机碳，并提高土壤可溶性盐含量^［45］，有效改善菜地土壤的氮磷钾供给量和有机碳储备量。土壤施用生物炭和外源功能菌，有利于生物炭阳离子与土壤铵根离子的交换反应，提高土壤氮素的形态转化和利用效率^［46］；与单施Ralstonia相比，西红柿秸秆的热解生物炭和水热生物炭与Ralstonia制备的Ralstonia生物炭菌剂均促进铵态氮转化和磷酸盐溶出，显著增加土壤硝态氮和有效磷的含量，避免不同类型的生物炭菌剂显著影响土壤的碳氮转化和氮含量^［47］，从而有效提高土壤肥力。本研究结果表明，Ralstonia生物炭菌剂兼备生物炭固持土壤氮磷钾化合物和氧化型菌Ralstonia促进土壤磷钾化合物溶出的特征，并提高菜地土壤的供肥能力和有机碳储量，为开展西红柿秸秆生物炭固定化重金属抗性菌改善菜地土壤及重金属复合污染土壤的肥力提供保障。

4　结 论

为研究西红柿秸秆生物炭和重金属抗性菌Ralstonia对菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌群落结构、优势菌相对丰度和氮磷钾含量的影响，本研究以轮作西红柿和芥菜的菜地土壤为研究对象，利用西红柿秸秆碳化制备热解生物炭和水热生物炭，并与Ralstonia固定化制备成Ralstonia生物炭菌剂，探究西红柿秸秆生物炭和重金属抗性菌Ralstonia对重金属复合污染菜地土壤优势菌群落结构、外源菌Ralstonia存活和供肥能力的影响。主要结论如下：

1）西红柿秸秆制备的热解生物炭和水热生物炭，其pH、EC、总碳和官能团差异较大，但均能与重金属抗性菌固定化制备成Ralstonia生物炭菌剂，并降低不同类型西红柿秸秆生物炭对菜地土壤细菌群落结构的差异性影响；2）Ralstonia生物炭菌剂改善菜地土壤及重金属复合污染土壤的细菌群落结构、增强部分高丰度抗性菌活性（Proteobacteria（门水平），Rhodanobacter（属水平））、维持外源菌Ralstonia存活，并缓解西红柿秸秆生物炭或Ralstonia对土壤差异菌群的抑制作用；3）Ralstonia生物炭菌剂增加菜地土壤的碱解氮、硝态氮、有效磷、速效钾和有机碳，并减少铵态氮残留，实现生物炭固持土壤氮磷钾化合物和Ralstonia促进土壤磷钾化合物溶出，有效改善重金属复合污染土壤的供肥能力和有机碳储量。

综上，Ralstonia生物炭菌剂实现西红柿秸秆生物炭（热解生物炭和水热生物炭）和Ralstonia共同改善土壤优势菌群落结构、增强重金属抗性菌活性和提高土壤氮磷钾含量，并缓解单施西红柿秸秆生物炭或Ralstonia抑制菜地土壤细菌菌群生长的缺点，为西红柿秸秆资源化利用和改善菜地土壤及其重金属复合污染土壤的肥力提供参考。

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基金资助

福建省自然科学基金面上项目(2024J01329)

农业高质量发展超越“5511”协同创新工程(XTCXGC2021010)