大白菜抗TuMV近等基因系的分子标记辅助选育

Marker-assisted selection of TuMV resistant near-isogenic lines in Chinese cabbage

摘要

为探究大白菜芜菁花叶病毒病（Turnip mosaic virus，TuMV）基因TuRBCS01的功能，丰富大白菜种质资源，以大白菜感TuMV的骨干亲本材料‘冠291’为轮回亲本，TuMV抗源材料‘8407’为供体亲本，利用BrID10723和mBr4055为前景选择标记，49对在两亲本间多态性好、染色体分布相对均匀的InDel或SSR共显性标记为背景标记，构建抗TuMV的‘冠291’近等基因系。结果表明：1）BC₂代背景恢复率最高达94.44%，BC₃F₁代背景恢复率最高为97.96%；2）在BC₃F₂代获得全部恢复‘冠291’基因组的单株，再经过一代自交筛选，可获得纯合抗TuMV‘冠291’近等基因系；3）部分近等基因系的结球相关性状与‘冠291’无显著差异。这些近等基因系的获得为TuRBCS01基因的克隆及功能研究奠定了基础，同时为大白菜抗TuMV新品种的培育提供了优良种质材料。

Abstract

To explore the function of Turnip mosaic virus gene TuRBCS01 in Chinese cabbage， and to enrich the germplasm resources， the TuMV resistant ‘Guan 291’ near-isogenic line was constructed using 49 pairs of InDel or SSR codominant markers as the background makers which with good polymorphism and relatively uniform distribution on chromosomes， BrID10723 and mBr4055 as the foreground selection markers， Chinese cabbage TuMV susceptible backbone parental material ‘Guan 291’ as the reincarnation parent，TuMV-resistant source material ‘8407’ as the donor parent. The results showed that 1） the highest background recovery rate of BC₂ generation reached 94.44%， the highest background recovery rate of BC₃F₁ generation was 97.96%； 2） In the BC₃F₂ generation， individuals could be obtained that fully recover the ‘Guan 291’ genome.After one more generation of self-pollination selection， a homozygous TuMV-resistant ‘Guan 291’ near-isogenic line could be obtained；3） No significant difference in bolting-related traits existed compared ‘Guan 291’ to some near-isogenic lines.The acquisition of these near-isogenic lines has laid the foundation for the cloning and functional study of the gene TuRBCS01.At the same time， it provides excellent germplasm materials for breeding of new TuMV resistant varieties in Chinese cabbage.

Graphical abstract

关键词

大白菜 / TuMV / TuRBCS01基因 / 分子标记辅助选择 / 近等基因系

Key words

Chinese cabbage / TuMV / TuRBCS01 gene / marker-assisted selection / near-isogenic line

病毒病是危害我国大白菜生产的重要病害，常年发病率为10%~30%，个别地块可高达80%~90%，严重影响我国大白菜的产量和品质。该病防治困难，培育抗病品种是最有效且可持续的防治措施^［1］。我国大白菜病毒病主要是由3种病毒单独或复合浸染所致，即芜菁花叶病毒病（Turnip mosaic virus， TuMV）、黄瓜花叶病毒病（Cucumber mosaic virus，CMV）和烟草花叶病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV），其中，TuMV是主要毒源^［2］。因此，建立高效大白菜TuMV抗性基因转育和鉴定技术体系，对大白菜种质创新和抗病育种具有重要意义。

‘冠291’是骨干的大白菜自交不亲和系，具有广义配合力好、杂种优势强、制种纯度高等优点，利用其先后育成了‘鲁白一号’‘山东四号’‘山东六号’‘鲁白六号’和‘丰抗70’等多个在全国各地大面积推广的优良品种，其中一些品种目前仍在大面积种植。但该系易感病毒病，应用受到了较大限制，急需通过遗传改良，提高其抗病毒能力。常规的改良方法周期长、效率低、准确性差。利用分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS），可实现对育种材料的快速、精准改良。

分子标记辅助选择是在DNA标记基础上的育种策略，利用与目标性状紧密连锁的DNA标记对研究对象进行选择，包括对目标基因跟踪的前景选择（Foreground selection）和对非目标基因的遗传背景选择（Background selection）^［3］。到目前为止，芸薹属中发现的TuMV抗性基因主要集中在白菜类作物的A基因组中^［4］。已经鉴定到的抗性基因有retr01和ConTR01^［5］、TuRBCH01^［6］、retr02^［7］、trs^［8］、TuRB01b^［9］、TuRB07^［10］、TuMV‑R^［11］、retrcs03^［12］、TuRBCS01^［13-14］和BcTFIIIA^［15］。Li等^［13］以国家级大白菜TuMV抗源材料‘8407’和大白菜核心种质材料‘冠291’为亲本构建分离群体，将大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01定位于A04染色体上的2个标记BrID10723（3.3 cM）和mBr4055（2.6 cM）之间1.98 Mb的区域。李巧云等^［16］的研究表明，利用上述2个标记对纯合抗病单株的鉴定准确率可达90%以上。此外，芸薹属数据库（BRAD，http：//brassicadb.cn/）中丰富的SSR与InDel标记，为白菜的基因组背景选择提供了重要基础。

近等基因系（Near-isogenic lines，NIL）是指除了特定性状之外，其他遗传背景均相同或相近的一组品系。近年来，近等基因系在蔬菜育种中的应用越来越广泛，主要用于基因定位、基因功能分析和品种改良等方面^［17］。王丽丽等^［18］以含不育基因Ms的大白菜细胞核复等位基因型雄性不育两用系‘AB01’的可育株（MsfMs）为供体亲本，以高代自交系‘a20’（msms）为轮回亲本，利用与不育基因Ms连锁的SCAR标记syau_scr01（0.8 cM）辅助不育基因Ms选择，成功将不育基因转育到可育品系‘a20’中，育成了不育度和不育株率均为100%、植物学性状与自交系‘a20’相近的新核不育系‘GMS4’。朴钟云等^［19］以具有抗根肿病基因CRb的大白菜‘CR Shinkii DH’系为抗源，通过CRb基因侧翼标记TCR01（1.97 cM）和TCR09（0.43 cM）的前景选择，以及51个SSR标记的基因组背景选择，选育出大白菜优良自交系‘BJN3’的9份抗根肿病近等基因系，且这些近等基因系的结球相关性状与‘BJN3’无显著差异。张腾等^［20］以具有抗根肿病基因CRb的大白菜‘CR Shinki DH’系为供体亲本，大白菜自交系‘91-12B’为轮回亲本，通过回交和4个阶段的分子标记辅助选择，选育出7个携带 CRb 基因的抗根肿病近等基因系。刘港运等^［21］以甜瓜自交系‘TopMark’为轮回亲本，矮化自交系‘M406’为供体亲本，利用 Cmerecta-dCAPS2 为前景选择标记，102对在亲本间多态性好、染色体上分布相对均匀的 SSR 标记为背景选择标记，选育出矮化的‘TopMark’近等基因系。上述研究充分证明了利用分子标记辅助选择快速选育大白菜近等基因系是可行的。

本研究通过目标基因的前景选择和轮回亲本基因组的背景选择，选育出抗TuMV的大白菜‘冠291’的优良近等基因系，旨在为培育大白菜抗病毒病新品种或改良现有品种奠定基础。

1　材料与方法

1.1　供试材料

供体亲本‘8407’和轮回亲本‘冠291’均由山东省农业科学院蔬菜研究所大白菜课题组提供。‘8407’是直筒型，开黄花，对绝大部分TuMV株系表现免疫的广谱抗源材料。‘冠291’是叠抱型，开白花，对TuMV表现感病的高代自交不亲和系。

接种所用TuMV毒源为C4株系，引自中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室，接种前一个月，在感病材料上繁毒培养。

1.2　近等基因系选育方法

试验在山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地进行。以感病亲本‘冠291’为母本，抗病亲本‘8407’为父本配制杂交组合，获取杂交种F₁的种子。以‘冠291’为轮回亲本连续回交，获得回交后代群体。在以上各世代群体中，根据基因TuRBCS01两侧标记BrID10723和mBr4055的前景选择及‘冠291’的开白花性状，选择开白花且具有基因TuRBCS01的单株，用于与轮回亲本回交。从BC₂起进行基因组背景选择，筛选‘冠291’背景恢复率高且在两前景标记位点均扩增为杂合抗病条带的单株用于回交。对BC₃F₁代群体，继续进行上述筛选后，获得的单株自交构建BC₃F₂群体。继续对BC₃F₂群体进行前景和背景选择，筛选背景标记全部恢复‘冠291’基因组，但前景标记仍为杂合抗病或前景选择为纯合抗病，个别背景标记仍未恢复‘冠291’基因型的单株，自交构建BC₃F₃群体。利用两前景标记或杂合背景标记对BC₃F₃群体进行筛选，获得前景选择为纯合抗病，背景选择全部恢复‘冠291’基因组的单株，进一步自交获得‘冠291’近等基因系。

1.3　基因组DNA的提取

大白菜基因组DNA的提取采用天根（TIANGEN）生化科技（北京）有限公司的快捷型植物基因组DNA提取试剂盒。使用1%的琼脂糖凝胶对所提取的基因组DNA进行电泳检测。

1.4　前景选择

利用基因TuRBCS01的两侧标记BrID10723和mBr4055作为前景标记，选择开白花且在两标记位点均扩增为杂合抗病条带的单株，用于回交。BrID10723和mBr4055的PCR反应体系采用Li等^［13］的方法。PCR扩增产物采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（29∶1）进行检测，每个胶孔的上样量是2 µL。使用美国Labnet International公司Power Station200型电泳仪，DYCZ-24B型电泳槽，175~190 V恒压条件下，电泳1.5~3 h，银染显色。

1.5　背景选择

从芸薹属基因组网站上均匀选择白菜10条染色体上的SSR或InDel标记204个，以两亲本基因组DNA为模板进行扩增，筛选在两亲本间扩增共显多态性的49对标记用于背景选择。结合前景选择的结果，从每个世代的杂合抗病单株中选择‘冠291’背景恢复率高且开白花的单株用于回交或自交，直至筛选出抗性基因纯合且背景标记与‘冠291’完全一致的株系，即为抗TuMV的‘冠291’近等基因系。

BCg世代轮回亲本背景恢复率（Proportion of recurrent parent genome，PRPG）的计算根据Hospital等^［22］的公式进行：

\mathrm{P}\mathrm{R}\mathrm{P}{\mathrm{G}}_g=\frac{L+X_g}{\mathrm{2}L}×100%（1）

式中：\mathrm{P}\mathrm{R}\mathrm{P}{\mathrm{G}}_g为BC _g 世代的轮回亲本背景恢复率；g为回交次数；X_g 为BC _g 世代中背景选择标记带型与轮回亲本一致的标记数量；L为全部背景选择标记。回交g次的理论背景恢复率计算公式如下：

G_g=\mathrm{1}-\frac{\mathrm{1}}{{\mathrm{2}}^{(\mathit{g}+\mathrm{1})}}（2）

式中：G_g 为BC _g 世代的理论背景恢复率，假定各标记位点间相互独立。

1.6　TuMV抗性接种鉴定

对‘冠291’及入选的BC₃F₂家系各25株以上，采用摩擦接种法^［23］进行TuMV接种，每克鲜病叶加4 mL磷酸盐缓冲液，研磨成汁液后进行接种，接种后置于人工气候室中培养，温度25 ℃，湿度50%，3周后采用生物学观察法进行抗病性鉴定，连续鉴定3次，间隔1周，鉴定标准参照GB/T 19557.5—2017^［24］。

1.7　主要农艺性状调查

将‘冠291’及其近等基因系进行育苗，待植株长至4~5片叶子时定植于山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地，各家系及‘冠291’分别定植25株，正常栽培与管理。收获期随机选取6株，调查毛重、球重、外叶数、内叶数、球高、球粗、短缩茎长和短缩茎宽等结球相关性状。利用DPS软件分析差异显著性。

2　结果与分析

2.1　亲本间背景标记的筛选

从分布于白菜10条染色体上的SSR或InDel标记中选择204个，以两亲本基因组DNA为模板进行扩增，有49个标记在两亲本间扩增多态性，多态性比率为24%。用于背景分析的49对多态性引物详细信息见表1，其中，位于白菜1~10号染色体上的多态性标记数量依次为5、2、7、4、5、6、7、1、8和4个。

2.2　BC₁群体分析

利用基因TuRBCS01的两端标记BrID10723和mBr4055对157株BC₁群体单株进行PCR扩增检测，部分扩增结果如图2所示。在BrID10723位点扩增为杂合抗病条带的有69株（χ²=2.30， χ_0.05²=3.84），在mBr4055位点扩增为杂合抗病条带的有70株（χ²=1.84， χ_0.05²=3.84），在两标记位点均扩增为杂合抗病条带的有68株。进一步分析这68株的开花颜色，其中有60株开白花，从中选择10株进行回交，获得BC₂。

2.3　BC₂群体分析

对来自于10株BC₁回交后代的128个单株，利用标记BrID10723和mBr4055进行扩增，其中有50株在两标记位点均扩增为杂合抗病条带，继续利用白花性状选择，有40株开白花。从上述49个多态性标记中，均匀选择36个，对上述40个单株进行背景分析，结果见表2。其中1株（编号为 BC₂-35）背景恢复率最高，达94.44%，只有4个杂合位点；其次是BC₂-9和BC₂-12，背景恢复率均为93.06%，均存在5个杂合位点。选择BC₂-35用于回交，构建BC₃F₁。

2.4　BC₃F₁群体分析

对BC₂-35的回交后代BC₃群体的102个单株进行前景选择，有40株在两标记位点均扩增为杂合抗病条带（表2）。选择植株形态与‘冠291’相近的38株进行基因组背景分析。利用在BC₂表现杂合的4个标记进行背景选择，筛选出标记位点达到纯合的BC₃个体9株。再选用剩余的13个标记对这9株进行背景分析，有3个单株（BC₃F₁-1、BC₃F₁-2、BC₃F₁-3）只在2个位点（BrID10321和BrID90277）表现杂合，背景恢复率最高，达97.96%，其余单株的杂合位点均在≥3个。选择性状与‘冠291’最接近的单株BC₃F₁-2自交构建BC₃F₂群体。

2.5　BC₃F₂群体分析

对含有99个单株的BC₃F₂群体进行前景选择，其中78株扩增为纯合或杂合抗病条带，继续利用2个杂合位点标记BrID10321和BrID90277对这78个单株进行背景选择，有3株（BC₃F₂-55，BC₃F₂-58，BC₃F₂-77）全部恢复‘冠291’基因组，但前景选择的结果是杂合抗病；有4株（BC₃F₂-12，BC₃F₂-33，BC₃F₂-44，BC₃F₂-59）前景选择为纯合抗病类型，背景选择在2个位点BrID10321和BrID90277仍扩增为杂合条带，将上述7个单株自交构建BC₃F₃群体。

2.6　BC₃F₃群体分析

利用2个杂合位点标记分别对BC₃F₃-12、BC₃F₃-33、BC₃F₃-44和BC₃F₃-59群体的90、108、72和105个单株基因组DNA进行背景分析，分别有0、22、68和22个全部恢复‘冠291’基因组；利用前景标记BrID10723和mBr4055分别对BC₃F₃-55、BC₃F₃58和BC₃F₃-77株系的78、90和58个单株基因组DNA进行分析，分别有9、17和7个单株全部扩增为纯合抗病条带。对上述145个背景选择全部恢复、抗病位点纯合的单株自交获得‘冠291’的抗TuMV近等基因系（表2），编号为GTR-1~GTR-145。

2.7　近等基因系的主要农艺性状鉴定

以‘冠291’为对照，随机选取18份近等基因系进行TuMV抗性鉴定及结球性状分析，结果表明，接种单株数在27~32株的18份近等基因系均表现抗病，且呈现免疫级别，病级均为0级（图3）；有7份材料的结球性状与‘冠291’没有明显差异（表3，图4），表明这些近等基因系恢复了‘冠291’主要农艺性状。

3　讨 论

近等基因系因其具有遗传背景简单的特点，在作物种质改良、基因定位、基因效应和生理机制研究以及农艺性状鉴别等方面具有重要作用，是理想的研究材料。传统的近等基因系构建方法周期长、效率低，通常需要回交5代以上^［25］，对于纯合隐性基因的近等基因系构建则需要回交和自交8~10代^［26］。利用分子标记辅助选择，则可以大大缩短近等基因系构建时间，提高构建效率。Tanksley等^［27］研究表明，通过分子标记辅助选择进行3次回交后可获得较高的背景恢复率。朴钟云等^［19］采用分子标记辅助选择的方法，经过3次回交和2次自交获得了9个携带CRb基因的大白菜优良自交系‘BJN3’的抗根肿病近等基因系。张腾等^［20］同样采用分子标记辅助选择的方法，经过3次回交和1次自交即获得了7个携带CRb基因的大白菜优良自交系‘91-12B’的抗根肿病近等基因系。刘港运等^［21］通过分子标记前景和背景辅助选择相结合的方法，经过2次回交和1次自交构建了甜瓜矮化基因Cmerecta近等基因系。本研究通过利用前景和背景分子标记辅助选择，结合白花性状的筛选，经过3次回交和2次自交获得了携带抗病基因TuRBCS01的大白菜骨干种质材料‘冠291’的抗TuMV近等基因系，为研究该基因提供了理想材料，同时也为大白菜抗病毒病新品种的培育提供了新的种质材料。进一步证明利用分子标记辅助选择构建近等基因系可大大提高选择效率，加快转育进程。

本研究中所用的轮回亲本‘冠291’开白花，而供体亲本‘8407’开黄花。张宁^［28］研究表明，大白菜控制花色的基因位于A01和A09上。因此，定位于A04上的TuRBCS01基因与控制花色的基因不存在连锁关系，证明本研究中利用白花性状进行单株选择是可行的，是分子标记辅助选择的一个较好的补充。本研究在BC₁、BC₂和BC₃F₁代前景选择之后又进行了白花性状的选择，然后再进行背景选择，理论上提高了选择效率，但是否把轮回亲本基因组含量较高的黄花植株漏选，还有待进一步验证。

本研究在BC₂代，经过前景选择、背景选择以及白花性状的选择，即可筛选出‘冠291’背景恢复率为94.44%的个体，高于回交2代的期望值（87.5%）；在BC₃F₁代，经过上述筛选，即可获得‘冠291’背景恢复率为97.96%的个体，同样高于回交3代的期望值（93.75%）。Ellur等^［29］和Sagar等^［30］的研究表明，通过严格的表型选择与分子标记辅助背景选择相结合，经过3次回交可获得背景恢复率高的PB1121和PB6近等基因系。因此，如果没有合适的前景标记，只进行背景选择，再配合严格的表型选择，也是高效获得近等基因系的一种途径。此外，各世代背景恢复率高于理论值的其他原因也不能完全排除，如基因组中并不均匀的重组率、单倍型区块结构的存在，以及对重要农艺性状的过度关注等。

本研究所获得的抗TuMV的‘冠291’近等基因系与‘冠291’相比，除TuMV抗性外，其他性状并未完全相同，还存在一些差异，原因可能有以下3个方面：一是背景选择的局限性。本研究虽已对204对引物进行筛选，但相对于整个基因组来说，标记密度和覆盖度仍不足以完全排除轮回亲本基因组中未被标记追踪的区域，可能残留有供体亲本‘8407’的遗传片段。二是重组事件的随机性。回交过程中染色体重组是随机的，即使标记附近区域重组，远离标记的基因组区域可能因连锁不平衡保留供体基因，导致背景差异。三是供体片段的导入。由于本研究中目标性状基因与分子标记还存在一定距离，回交时目标区段附近的供体染色体片段会随标记一同导入，引入供体额外基因。但本研究所获得的近等基因系在重要结球性状方面与‘冠291’无显著性差异，表明仍具有较大的理论和应用价值。

4　结 论

本研究以感TuMV的骨干亲本材料‘冠291’为轮回亲本，TuMV抗源材料‘8407’为供体亲本，利用大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01两侧紧密连锁标记BrID10723和mBr4055为前景标记，49对在两亲本间多态性好、染色体分布相对均匀的InDel或SSR共显性标记为背景标记，通过3代回交和2代自交，获得了7份抗TuMV的‘冠291’近等基因系。这些近等基因系在49个多态性背景标记位点上已全部恢复‘冠291’基因组，且在全株质量、叶球质量、外叶数、内叶数、叶球高度、叶球直径、短缩茎长和短缩茎宽等结球性状方面与‘冠291’无显著差异，说明近等基因系基本保持了‘冠291’的优良农艺性状。

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基金资助

山东省农业良种工程项目(2022LZGCQY005)

山东省农业良种工程项目(2022LZGC008)

济南市“新高校20条”资助项目(202228092)

山东省农业科学院创新工程项目(CXGC2025B20)