基于差热分析技术的112份梨种质资源抗寒性鉴定与评价

Identification and evaluation of 112 pear germplasm resources for cold resistance based on differential thermal analysis

摘要

为建立可靠高效的梨种质资源抗寒性评价方法，鉴定梨种质资源抗寒性，筛选高抗寒种质，以112 份梨种质资源一年生枝条为试材，采用差热分析（DTA）系统测定枝条组织低温放热（LTE）温度，建立温度-伤害度回归方程（LT-I），利用LTE相关指标分析112份梨种质资源抗寒性，并综合隶属函数分析和聚类分析进行抗寒性评价及筛选。结果表明：1）112份梨种质资源枝条的LTE指标显著相关且差异明显，砧木和秋子梨的起始结冰平均温度和终止结冰平均温度最低，西洋梨最高。2）不同类型梨种质枝条关键伤害度（LT20、LT50、LT100）的温度范围存在差异，砧木和秋子梨3个关键伤害度的温度范围均明显低于西洋梨。3）利用隶属函数和聚类分析将梨种质资源划分为5类，其中，极抗寒种质2份，高抗寒种质17份，中抗寒种质19份，低抗寒种质46份，低温敏感种质28份；筛选出‘河北杜梨’‘寒香’‘南果梨’‘小花盖’‘寒露’‘寒酥’‘早酥’为梨抗寒优异种质。综上，本研究可为梨抗寒育种及抗寒机制解析提供技术支撑和理论依据。

Abstract

The study was to establish a reliable and efficient method for evaluating cold hardiness of pear germplasm resources， identify the cold hardiness of pear germplasm resources， and screen highly cold-hardy germplasm. In this study，112 annual branches of pear germplasm resources were used as test materials. The low-temperature exothermic （LTE） temperatures of the branch tissues were determined using differential thermal analysis （DTA） system and the temperature-injury regression equations （LT-I）， established.The cold resistance of the 112 pear germplasm resources was analyzed using the LTE indexes， and comprehensive cold hardiness evaluation and screening were conductedthrough comprehensive membership function analysis andcluster analysis. The results showed that：1） The LTE indicators of branches from 112 pear germplasm resources were significantly correlated and showed obvious differences. The average initial freezing temperature and average final freezing temperature of rootstocks and P. ussuriensis were the lowest， while those of P. communis were the highest. 2）There were differences in the temperature ranges of key injury degrees （LT20， LT50， LT100） among different types of pear germplasm branches， and the temperature ranges where the three key injury degrees occurred in rootstocks and P. ussuriensis were significantly lower than those in P. communis. 3） Cluster analysis based on membership functions categorized the germplasm into five groups， including 2 extremely cold-hardy gerplasm resources，17 highly cold-hardy gerplasm resources， 19 moderately cold-hardy gerplasm resources，46 low cold-hardy gerplasm resources， and 28 cold-sensitive gerplasm. Additionally， P. betulifolia （Hebei）， ‘Hanxiang’， ‘Nanguo’， ‘Xiaohuagai’， ‘Hanlu’， ‘Hansu’， and ‘Zaosu’ were screened as superior cold-resistant pear germplasms. In conclusion， this study provided technical support and theoretical basis for cold-hardy pear breeding and cold resistance mechanism analysis.

Graphical abstract

关键词

梨 / 种质资源 / 抗寒性 / 低温放热 / 评价

Key words

pear / germplasm resources / cold resistance / low-temperature exothermic / evaluation

梨树作为全球重要的温带经济果树，其栽培面积和产量均占全球总量的60%以上^［1-2］，在我国农业中占据核心地位。然而，梨树常遭受非生物胁迫，低温胁迫作为重要的非生物胁迫之一，不仅严重影响梨树的生长发育和地理分布^［3-5］，还会降低果实品质及产量^［6-7］。因此，建立可靠且高效的梨抗寒性评价方法，全面评价梨种质资源抗寒性并筛选高抗寒种质，对寒冷地区梨育种和种质创新至关重要。目前，国内外对植物抗寒性的鉴定已有许多报道，如电导率法（EL）、氯化三苯基四氮唑染色法（TTC）、恢复生长法（RG）和生理指标评价法等。其中，有关梨抗寒性的研究多采用电导法，另有部分研究采用生理生化法。王玮等^［8］利用电导法评价了7个梨品种抗寒性，郭伟珍等^［9］以电导法评价了10个梨品种（系）的抗寒性，王睿哲等^［10］和李今普^［11］采用电导法结合生理生化指标评价了梨种质资源抗寒性。前人研究表明，EL作为最常使用的传统方法，虽准确度高，但耗时久且需试材多^［12-13］；TTC法虽可检测到组织的死亡，但染色判定主观性强、误差大，对实验操作技能要求高^［14-15］；RG法虽可直观评估果树抗寒性，但也存在周期长、耗材大的问题^［16］。与传统分析法不同，低温放热（LTE）法是基于植物组织结冰放热温度的差异来评价其抗寒性^［17］，最早始于国外^［18］。已有学者采用该方法鉴定了榛子^［17］、葡萄 ^［19-20］、板栗 ^［21］、桃^［22］和核桃^［23］等植物的抗寒性，表明LTE法具有简便、快速、准确、样品无损且用量少等优点，但LTE法应用于梨抗寒性的研究鲜有报道。此外，有关梨抗寒性评价方面，已有研究者对部分梨品种开展了抗寒性鉴定。孙梦颖等^［24］评价了4个梨品种抗寒性，秦倩等^［25］对25份新疆地方梨种质枝条抗寒性进行了评价，李清亚等^［26］和王文举等^［27］仅分别对豆梨和西洋梨品种进行抗寒性评价。可见，现有研究多局限于少数地方梨品种，且类型单一，对梨种质资源进行大量综合性的抗寒性评价尚未见报道。针对目前研究存在的传统方法局限性，以及研究样本少量、类型单一的问题，本研究拟以国家环渤海地区特色果树种质资源圃的4个梨系统（白梨、砂梨、秋子梨和西洋梨）、种间杂交种和主要砧木资源（杜梨、豆梨）的112份梨种质一年生枝条为试材，采用LTE法分析枝条组织结冰放热温度，通过隶属函数和聚类分析法综合评价梨枝条抗寒性，旨在建立一种可靠准确的梨枝条抗寒性鉴定方法，筛选高抗寒梨种质，以期为我国梨种质抗寒性鉴定提供技术支撑，并为梨抗寒育种及抗寒机理研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

供试材料来源于国家环渤海地区特色果树种质资源圃（39°42′ N，119°25′ E）。该地区属大陆性季风气候，年平均气温10 ℃，年日照时数2 809 h，年有效积温394 ℃，无霜期约186 d，年平均降水量640 mm。试验区为沙壤土，南北行向，株行距2 m×4 m，树体长势健壮，无病虫害。112份梨种质资源包括白梨（P.bretschneideri）25份，砂梨（P.pyrifolia）13份，秋子梨（P.ussuriensis）15份，西洋梨（P.communis）30份，种间杂交品种（Interspecific hybridization）27份，砧木（Stock species）2份，详见表1。试验于2024年1月进行，每个品种选取5株长势相近、无病虫害的树木，每株树冠外围采集10根一年生枝条，枝条直径为0.8~1.0 cm，长度在40~50 cm。每个品种枝条混合后选取10根置于4 ℃冰箱保存以备LTE分析。

1.2　试验仪器

差热分析（DTA）系统分为数据采集系统（山东农业大学机械与电子工程学院制作）和人工模拟自然降温气候室两部分（GDTS-2252，无锡精创科技有限公司）。工作室尺寸：600 mm×750 mm×500 mm，工作范围：-70~150 ℃。数据采集系统包括27个Peltier热电模块（40 mm×40 mm×15 mm），可感应枝条组织受冻结冰放热并将其转换为电压输出。此外，还可通过pt100传感器记录放热过程中的温度变化，精度可达到0.1%。

1.3　试验方法

LTE测定参考Küpe等^［28］、Wang等^［20］和高振等^［29］的方法。每个品种枝条选取节间部位，截取2 cm长度，两头封蜡后置于热电模块中，并用塑料泡沫板压在上部使其与热电模块充分接触，每个品种做3次重复。随后，开启程序降温：室温下1 h降至4 ˚C，4 ˚C降至0 ˚C用时1 h，0 ˚C保持1 h，0 ˚C降至-44 ˚C用时11 h，程序降温结束。

1.4　数据分析

采用Excel 2011进行数据整理和计算。使用Origin 2024软件进行相关性分析、聚类分析并绘图。采用变异系数对LTE指标进行描述性统计，计算公式如下：

CV=S/U×100%（1）

式中：S代表标准差，U为指标平均值。

利用隶属函数法综合各LTE指标对梨不同品种抗寒性进行综合评价。计算公式如下：

如指标与抗寒性呈正相关：

U_ij=（X_ij-X_jmin）/（X_jmax-X_jmin）（2）

如指标与抗寒性呈负相关：

U_ij=1-（X_ij-X_jmin）/（X_jmax-X_jmin）（3）

式中：U_ij为第i个品种的j指标隶属函数值；X_ij第i个品种的j指标测定值；X_jmin为j指标的最小值，X_jmax为j指标的最大值。

2　结果与分析

2.1　梨枝条LTE分析方法的建立

利用DTA系统测定丰水梨一年生枝条所得的高温放热（HTE）和LTE曲线如图1所示。低温胁迫下，枝条组织结冰形成冰晶并伴随放热。由于枝条组织细胞存在过冷却现象，在冰点（0 ℃）时并未发生结冰放热。温度降至A点（-11.2 ℃）时，枝条组织出现显著的放热过程。依据放热特征判断，该过程为细胞外组织结冰引起的HTE过程，此过程不具致命性^［29］。随着温度降低至B点（-16.63 ℃）时，枝条组织结冰放热，再次出现放热峰；当温度降至C点（-40.32 ℃）时，结冰放热过程结束，此过程为LTE过程，可导致枝条冻害发生。

图1中B点为开始结冰点，即枝条组织伤害度为0，记为LT0；C点为结冰放热完全点，即枝条伤害度为100%，记为LT100。通过对初始冰点和结冰放热完全点进行回归分析，建立丰水枝条LT-I方程（y=-4.22x-70.20）。丰水枝条在-16.63 ℃开始受冻结冰，温度降至-28.48 ℃时枝条组织呈半致死状态，在-40.32 ℃时枝条组织全部冻死。

2.2　LTE法分析不同梨种质资源抗寒性

2.2.1　不同梨种质资源LTE指标分析

通过差热分析测定112个梨种质资源枝条在低温胁迫下的放热过程，得到了植物组织的胞外结冰温度、起始结冰放热温度和结冰完全放热温度。由于胞外结冰伴随的高温放热对枝条组织具有非致命性和可恢复性^［29］，本研究未对其比较分析。梨枝条的抗寒性主要由其枝条组织的受冻程度决定。因此，枝条组织LTE指标的差异，可作为评价和鉴定梨枝条组织抗寒性的关键指标。由于单一LTE指标评价作为抗寒性评价标准不够全面，本研究对LTE关键指标低温放热温度差值（LT0-LT100）、斜率绝对值（|Qlt|）、LT0、LT50、LT100进行相关性分析（图2）。结果显示，5个指标之间均存在相关性，其中|Qlt|与LT0、LT50、LT100、LT0-LT100呈极显著负相关（P<0.01）。表明LT-I方程|Qlt|越大，枝条组织从开始结冰到结冰完全的温度跨度越小，且随温度下降，枝条组织细胞开始结冰现象出现较晚，达到半致死和完全致死状态也越晚，越不易受冻。由于传统方法多采用LT50评价枝条抗寒性，因此，本研究进一步分析了LT50与其他LTE指标的相关性，以全面评估梨种质资源枝条抗寒能力。由图2可知，LT50与LT0、LT100和LT0-LT100呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.98、0.95和0.80。

由表2可知，112份梨种质资源中不同类型的梨种质枝条LTE各指标呈现差异性。比较各类型梨种质LT0和LT100平均值发现，LT0平均值由高到低依次为西洋梨>砂梨>白梨>种间杂交>秋子梨>砧木，LT100平均值由高到低依次为西洋梨>砂梨>白梨>种间杂交>砧木>秋子梨。结果表明，砧木和秋子梨的起始结冰放热温度和结冰完全放热温度较低，而西洋梨在较高温度时开始结冰，并结冰完全。LT-I方程斜率代表温度每降低1 ℃，梨枝条组织伤害增加的程度，由0%~100%枝条伤害度和对应温度回归分析所得，反映了在0%~100%伤害度下不同品种枝条组织对低温环境的敏感度。如表2所示，各类型梨种质的Qlt也存在差异，其中砧木最低，西洋梨最高。

2.2.2　不同梨种质资源程序降温下伤害程度比较

通过LT-I回归方程，确定不同低温下枝条的伤害度。本研究选取3个伤害度点（LT20、LT50和LT100）分析112份梨种质资源的低温放热过程，进一步评价不同类型梨种质资源枝条的抗寒性。Li 等^［22］研究表明，枝条伤害度达20%时，可对生产造成直接影响。因此，本研究选取LT20做为关键指标之一。如图3所示，砧木枝条伤害度达20%时的温度范围为-31~-25 ℃，秋子梨为-29~-25 ℃，可见，砧木和秋子梨2种类型枝条受损20%的温度较低。比较而言，砂梨和西洋梨分别于-23 ℃和-21 ℃时表现出枝条损伤率达20%的现象，且在低温-25 ℃时，92.3%的砂梨种质和全部西洋梨种质枝条伤害度均达到20%。表明非极端低温即可导致西洋梨和砂梨枝条发生冻害，其中73.3%的西洋梨枝条在-21 ℃时冻害达20%，抗寒性最弱。种间杂交种和白梨均在-29~-23 ℃范围内枝条伤害度达20%，LT20温度范围介于西洋梨和砂梨与秋子梨和砧木之间，表明此2种类型梨种质抗寒性大于西洋梨和砂梨，但小于秋子梨和砧木。

结果表明，112份梨种质枝条LT50范围为-37~-27 ℃（图4（a）），且不同类型梨种质间LT50存在差异。具体表现为：砧木和秋子梨枝条的半致死临界温度为-31 ℃；其中，河北杜梨枝条在极端低温-37 ℃时才达到半致死状态；白梨及种间杂交类型的半致死温度主要集中在-35~-31 ℃；西洋梨与砂梨种质的半致死温度多分布于-31~-29 ℃，其中西洋梨种质在-31 ℃时全部达到半致死状态，抗寒能力较差，与砧木及秋子梨的抗寒表现存在明显差异。如图4（b）所示，秋子梨、砧木和种间杂交类型枝条伤害度100%时的温度范围较低（-45~-41 ℃），其中秋子梨的LT100最低；西洋梨枝条伤害度100%时的温度范围最高（-43~-39 ℃），且93%的西洋梨种质在-41 ℃时伤害度达到100%，进一步验证了西洋梨抗寒能力较差。

2.2.3　梨种质资源枝条LTE指标的描述性统计

本研究对112份梨种质资源LTE各指标进行统计分析（表3），结果表明，低温胁迫下不同种质间LTE参数呈现明显差异，变异系数介于3.77%~14.69%。其中，LT100变异系数最低（3.77%），而LT0变异系数最高（14.69%），大于10%，变异度丰富，表明不同梨种质资源枝条冷害起始临界温度差异较大。

2.3　梨种质资源枝条 LTE 综合评价

2.3.1　隶属函数分析

为全面客观评价112份梨种质资源的抗寒性，本研究采用隶属函数法对LTE过程中不同放热温度点LT0、LT50、LT100及Qlt进行隶属函数分析，计算平均隶属函数值（SV）。根据平均隶属函数值大小进行抗寒能力排序，隶属函数值越大，表明抗寒性越强。结果显示，112份供试材料的平均隶属函数值范围为0.37~0.95，平均值为0.37（表4）。

2.3.2　聚类分析

采用聚类分析法对112份梨种质资源平均隶属函数值进行聚类分析（图5）。聚类分析将112份梨种质划分为5类，第Ⅰ类包含2份种质，0.86≤SV≤0.95，为极抗寒类型（HH）；第Ⅱ类包含17份种质，0.63≤SV≤0.80，为高抗寒类型（H）；第Ⅲ类包含19份种质，0.42≤SV≤0.52，为中抗寒类型（MH）；第Ⅳ类包含46份种质，0.25≤SV≤0.41，为低抗寒类型（LH）；第Ⅴ类包含28份种质，0.05≤SV≤0.22，为低温敏感类型（WH）。其中，HH类型和H类型中共7份种质SV≥0.75，包含‘河北杜梨’‘寒香’‘南果梨’‘小花盖’‘寒露’‘寒酥’‘早酥’。

2.3.3　不同类型梨种质抗寒性分布

基于112份梨种质的LTE隶属函数值（表4）和聚类分析结果（图5），分析不同类型梨种质的抗寒性分布（表5）。结果表明，砧木类型中HH和LH类型种质各占50%，无WH类型种质。种间杂交种质包含5个抗寒类型，以H和LH类型为主，占比81.4%；而HH和WH类型种质占比较少，呈中等抗寒水平。秋子梨主要包含H和MH类型种质，占比86.7%，且无WH类型种质。白梨主要为MH和LH类型，无极端抗寒类型。砂梨主要包含LH和低WH类型，占比92.3%；而西洋梨LH和WH占比100%，均不包含H和MH类型种质。综上所述，秋子梨以中高抗寒等级为主，白梨和种间杂交无极端抗寒类型，西洋梨为低抗寒等级类型。

3　讨 论

3.1　梨枝条LTE分析方法的建立

本研究发现，梨枝条在低温胁迫初期出现一次高温放热；随温度下降，又出现一次低温放热，与Küpe等^［28］研究结果一致。大量研究表明，枝条组织的HTE过程是不致命的，但LTE过程可对枝条组织造成不可逆转的损害^［30］。目前，LTE法应用于梨枝条抗寒性的研究鲜有报道，本研究借鉴前人采用LTE分析枝条抗寒性的研究方法^［31］，基于DTA系统检测结果，根据枝条组织起始结冰和终止结冰的温度点建立了梨枝条LTE法，用于梨枝条抗寒性鉴定，较传统的EI法更简洁、高效。

3.2　LTE法评价梨种质资源枝条抗寒性

传统方法多采用LT50做抗寒性评价依据。但Gu^［32］研究表明LT50不能全面反映植物整个越冬期的抗寒性，综合分析LT50和斜率Qlt才更全面准确；付晓^［33］发现以单一温度评价葡萄枝条抗寒性是不全面的，应采用多放热温度点综合评价。本研究对LTE各指标进行相关分析表明Qlt绝对值与LT0、LT50、LT100和LT0-LT100呈极显著负相关（P<0.01），Qlt绝对值越大，枝条组织达到半致死和完全致死状态越晚，越耐寒。LT50与LT0、LT100和LT0-LT100呈极显著正相关（P<0.01），进一步验证了LT50与LTE关键指标间紧密相关，可用于全面评估梨枝条抗寒能力。本研究采用LTE法对包含6个类型的112份梨种质资源进行了全面系统的抗寒性评价。本研究发现，不同梨种质的LT0和LT100存在差异，砧木和秋子梨的LT0和LT100较低，表明其在较低的温度下开始结冰并结冰完全，进而表现出较高抗寒性；西洋梨LT0和LT100最高，表明其在较高温度时开始结冰，并结冰完全，表现出较低的抗寒性；种间杂交类型中不同种质的抗寒性存在差异，这可能由于其亲本遗传背景不同，且抗寒等级与亲本抗寒性的强弱密切相关。本研究中，耐寒种质的放热起始温度明显低于低温敏感种质的放热起始温度，这与Ferguson等^［30］的研究结果一致。此外，本研究明确了枝条关键伤害度（LT20、LT50、LT100）的温度范围，不仅进一步评价了不同类型梨种质的抗寒性差异，还对梨种质的适应环境提供理论依据。其中，西洋梨在非极端低温时即出现20%冻害现象，且西洋梨的LT50和LT100最低，均明显高于秋子梨和砧木。充分验证了砧木和秋子梨种质资源抗寒性较高，而西洋梨种质抗寒性较低。王晓祥等^［34］研究表明秋子梨抗寒性极高；李清亚等^［26］发现砧木杜梨和几个豆梨品种可在寒冷地区可安全越冬；王文举等^［27］研究表明西洋梨抗寒性较弱，低温环境易发生冻害。在本研究中，秋子梨和砧木抗寒性较高，而西洋梨抗寒性最弱，与前人研究结果一致。

3.3　梨种质资源抗寒性综合评价

由于LTE法为综合评价方法，为准确客观地评价梨种质抗寒性，本研究对LTE各关键指标进行隶属函数分析，隶属函数值越大，表明抗寒性越强。根据平均隶属函数值进一步对112份梨种质资源进行聚类分析，共分为5类，极抗寒种质2份，高抗寒种质17份，中抗寒种质19份，低抗寒种质46份，低温敏感种质28份。筛选出的7个抗寒核心种质的隶属函数值由大到小为‘河北杜梨’>‘寒香’>‘南果梨’>‘寒酥’>‘早酥’>‘寒露’>‘小花盖’。‘河北杜梨’隶属函数值最大，抗寒等级为极抗寒类型，因此，抗寒性最强，在北方寒冷地区常选用‘河北杜梨’为砧木。本研究中，‘南果梨、‘早酥’、‘苹果梨’的抗寒性依次减弱，这与曲柏宏等^［35］的研究结果一致。李今普^［11］研究表明‘苹果梨’抗寒性大于‘寒香’，而本研究中‘苹果梨’抗寒性小于‘寒香’，这可能是由于同一品种的耐寒性在不同地区之间存在差异所致。Farrar等^［36］研究表明，关键物候期的变化会影响糖和淀粉的储存量，破坏树木的渗透平衡，从而影响树木的抗寒能力。此外，有效积温和降水量等关键气象因子通过调控新梢生长及养分积累，可保障寒地梨树安全越冬^［37］。可见，不同地区梨品种的耐寒性表现不仅与该地区冬季的绝对低温有关，还受所在地区的物候期和气象因素影响。不同类型梨种质资源中，砧木和秋子梨均无低温敏感类种质，且以极抗寒和高抗寒为主，表明抗寒能力强。白梨和砂梨虽然均以低抗寒类型为主，但白梨无低温敏感种质，且中抗寒类型较高，因此，白梨抗寒能力略高于砂梨。西洋梨以低温敏感种质为主，抗寒性较弱，这与LTE各指标评价梨种质抗寒性结果一致。综合评价发现梨种质资源中极抗寒和高抗寒种质较少，而中抗寒和低抗寒占比较大。因此，未来应加强极端抗寒种质的挖掘与利用，为梨抗寒育种及分子机制研究奠定基础。

4　结 论

本研究基于DTA系统建立了梨枝条LTE分析方法，该方法能快速确定梨枝条组织冻害发生的临界温度，全面、准确地评价不同梨种质资源抗寒性。112份梨种质资源中，砧木和秋子梨起始结冰与终止结冰点温度较低，抗寒性强；西洋梨则相反，抗寒性弱。通过隶属函数和聚类分析将供试资源划分为5个抗寒等级，明确各类型梨种质抗寒性分布特征，并筛选出7个抗寒优异种质（‘河北杜梨’‘寒香’‘南果梨’‘小花盖’‘寒露’‘寒酥’‘早酥’），为梨抗寒育种及抗寒机理研究提供理论依据。

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基金资助

河北省农林科学院基本科研业务费项目(2024020202)

河北省高层次人才资助项目(C20231157)

河北省农林科学院科技创新专项资助项目(2022KJCXZX-CGS-7)

河北省现代农业产业技术体系资助项目(HBCT2024170406)

国家梨产业技术体系资助项目(CARS-29)