43份蝴蝶兰原生种质的遗传多样性分析和分子身份证构建

Analysis on genetic diversity and construction of molecular identities for 43 samples of Phalaenopsis original species

摘要

为解析蝴蝶兰属原生种质的遗传多样性并构建其分子身份证，本研究选用43份蝴蝶兰原生种质为试验材料，采用TP-M13-SSR分子标记技术对其遗传多样性进行分析，并基于SSR指纹图谱为每份种质构建分子身份证。结果表明：1）基于简化基因组测序数据开发的SSR引物中筛选出的26对引物适用于本试验材料的扩增，其中24对扩增结果呈高多态性；26对引物的平均观测等位基因数（Na）为2.681，平均有效等位基因数（Ne）为1.894，平均期望杂合度（He）为0.323，平均观测杂合度（Ho）为0.279，所有位点均为He>Ho，Shannon指数（I）均值为0.581，说明43份蝴蝶兰原生种质的杂合程度极低，遗传多样性不高，这可能与所用实验材料均为原生种或其变型和变种相关。2）本试验筛选出的引物适用于对蝴蝶兰属原生种质进行分类鉴评，43份种质的聚类结果和PCoA分析结果均与目前最新的植物学分类结果基本一致。3）根据扩增结果筛选出6对核心引物，可构建每份种质特有的分子身份证。综上，本研究实现了蝴蝶兰原生种质资源的快速分子鉴定，为后续蝴蝶兰属种质资源的收集保存、鉴评和开发利用奠定了基础。

Abstract

To analyze the genetic diversity of original Phalaenopsis germplasms and construct molecular identities， 43 samples were selected as test materials. TP-M13-SSR technology was employed to analyze their genetic diversity and construct molecular identities based on SSR fingerprinting. The results showed that：1）Among the 26 pairs of SSR polymorphic universal primers screened from those developed SSR primers based on simplified genome sequencing data， 24 pairs showed high polymorphism in the amplification of the experimental materials. The average number of observed alleles （Na） for the 26 primers was 2.681， the average number of effective alleles （Ne） was 1.894， the average expected heterozygosity （He） was 0.323， and the average observed heterozygosity （Ho） was 0.279. All loci showed He>Ho， and the average Shannon index （I） was 0.581. The results indicate that the level of heterozygosity in the test materials is extremely low， and genetic diversity is not high， which may be related to the fact that all experimental materials were original species， their forms， or varieties. 2）The primers screened in this experiment are suitable for the classification and evaluation of original Phalaenopsis germplasms. The clustering results and PCoA analysis of the 43 germplasm samples were consistent with the latest botanical classification of Phalaenopsis germplasms. 3） Based on the amplification results， six pairs of core primers were selected to construct unique molecular ID for each germplasm. This study achieved rapid molecular identification of Phalaenopsis germplasm resources， laying a foundation for the subsequent collection， preservation， evaluation， and utilization of Phalaenopsis germplasm resources.

Graphical abstract

关键词

蝴蝶兰属 / TP-M13-SSR / 遗传多样性 / 分子身份证

Key words

Phalaenopsis / genetic diversity / TP-M13-SSR / molecular identities

作为兰科植物中产业化程度最高、最具园艺价值的“洋兰皇后”，蝴蝶兰因其种质资源多样、颜色艳丽、花型奇特、花期长而闻名于世。1704年首次在菲律宾被发掘制成标本并记录于册，1825年正式建立蝴蝶兰属（Phalaenopsis Blume， Phal.）。目前，发现和鉴定的原生种已多达75个，划分为蝴蝶兰亚属、柏氏蝴蝶兰亚属、湿唇兰亚属和羽唇兰亚属，蝴蝶兰亚属又可细分为蝴蝶兰组和裂唇蝴蝶兰组，柏氏蝴蝶兰亚属可细分为柏氏蝴蝶兰组、五唇兰组、落叶蝴蝶兰组和尖囊兰组。蝴蝶兰属植物广泛分布于东南亚地区，以加里曼丹岛和菲律宾群岛为中心，北至中国大陆南部、台湾岛及琉球群岛，南至澳大利亚北部昆士兰州，西至斯里兰卡和印度南部，东至新几内亚。我国境内以云南为中心分布有22个蝴蝶兰原生种，其中麻栗坡蝴蝶兰（Phal. malipoensis）、短茎萼脊兰（Phal. subparishii）、吉氏蝴蝶兰（Phal. tsii）、象鼻兰（Phal. zhejiangensis）、盈江羽唇兰（Phal. yingjiangensis）和腾冲蝴蝶兰（Phal. tengchongensis）共6个原生种为我国特有种^［1］。

分子标记技术是从基因层面对物种进行分析的一类技术，摒除了传统评价体系基于表型性状易受环境及人为因素等影响的缺陷，能够更精准地对种质资源进行分类鉴评^［2］。目前，基于分子标记技术的DNA指纹图谱和分子身份证构建是种质资源规范化、数字化、精准化管理的常用手段，已广泛运用于动植物种质资源保护和新品种鉴评^［3-6］。SSR（Simple sequence repeats）分子标记是国际植物新品种保护联盟指定的植物DNA指纹图谱构建首选方法^［7］，结合荧光测序技术开发出的TP-M13-SSR（Simple sequence repeat with tailed primer M13）技术，具有重复性好、通量高的优点，可快速准确地进行检测，在兰科植物中已成功应用于蝴蝶兰的突变体鉴定^［8］、建兰的核心种质构建^［9-10］及石斛兰原生种的鉴评和分子身份证构建^［11］等方面。

本研究拟利用通过简化基因组测序技术开发的蝴蝶兰属内和属间通用SSR引物对43份原生种质资源进行TP-M13-SSR扩增检测，分析其遗传多样性，进行分类鉴评，并筛选核心引物构建分子身份证，旨在为蝴蝶兰属种质资源的分类鉴评、科学保存及深度开发和利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料

本研究材料为蝴蝶兰属28个种的43份种质，多为杂交育种的高利用率原生种亲本，涵盖了蝴蝶兰属主要3个亚属每个组的代表种质，其中蝴蝶兰组种质11份，裂唇蝴蝶兰组种质22份，柏氏蝴蝶兰组种质2份，五唇兰组种质1份，落叶蝴蝶兰组种质5份，尖囊兰组种质1份，湿唇兰亚属种质1份。43份种质中，麻栗坡蝴蝶兰为我国特有种，仅分布于云南省文山州麻栗坡县，其他种质多分布于东南亚各国，具体种质基本信息见表1，具体花部形态特征见图1。所有种质资源均保存于广东省农业科学院环境园艺研究所国家蝴蝶兰种质资源圃内，于2020年5月采集样品幼嫩健壮的根尖液氮速冻后，保存于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2　方法

1.2.1　DNA提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒，使用供试蝴蝶兰样品幼嫩健壮的根尖进行基因组DNA提取。提取的DNA样本分别采用NanoDrop分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

1.2.2　TP-M13-SSR扩增

筛选出26对引物^［12］在不同样品中分别采用FAM和HEX 2种不同颜色的荧光标记合成的引物进行单重PCR扩增。PCR反应体系为10 µL，包括1.2 µL DNA模板（50 ng/µL），0.1 µL TAKARA Taq^TM HS酶（5 U/µL），1.0 µL 10×Buffer Ι缓冲液，上下游引物各0.3 µL（5 µM），0.8 µL的dNTP（2.5 mM），0.5 µL的TP-M13（5 µM），去离子水5.8 µL。反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行10个循环；60 ℃ 30 min。扩增后，取产物1.0 μL加入9 μL的ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液（V（ROX-500分子量内标）∶V（甲酰胺混合液）=0.5∶8.5），95 ℃变性3 min后，使用ABI3730XL检测仪进行毛细管电泳检测，1 kV电压进样10 s后，15 kV电压电泳30 min。利用Data Colletion软件收集原始峰值数据后导入GeneMapper 3.2软件，通过与泳道中分子量内标的对比分析计算目标DNA片段大小。各荧光标记位点上独立进行3次重复毛细管电泳检测，取3次重复的平均值并四舍五入取整，作为试验材料在该位点上的扩增结果。

1.2.3　数据统计和分析

将整理好的扩增结果数据导入GenAlEx 6.503和PowerMarker V3.25软件中，分别计算26对引物的遗传参数。使用NTSYSpc 2.11进行个体遗传相似系数计算，UPGMA法进行聚类分析并绘制三维PCoA分析图，采用Ai软件进行图形处理。引物有效扩增率计算方法为：有效扩增率=（有扩增结果的样品数/总样品数）×100%。

2　结果与分析

2.1　SSR标记多态性分析

基于简化基因组测序技术开发出的引物中筛选出在本试验样品中扩增结果较好的26对引物，包括19对蝴蝶兰属内通用引物和7对蝴蝶兰属与钻喙兰属间通用引物^［12］。由图2和表2可知，26对引物中7对引物的有效扩增率达100%，其余引物的有效扩增率均超过75%，平均有效扩增率达92.665%。且26对引物中有24对引物位点呈高多态性（PIC>0.5），剩余2对引物呈中等多态性^［13］，说明筛选出的26对引物在蝴蝶兰属原生种质中的通用性和多态性较高，适用于蝴蝶兰属原生种质的鉴评。26对引物的平均观测等位基因数（Na）为2.681，平均有效等位基因数（Ne）为1.894，平均期望杂合度（He）为0.323，平均观测杂合度（Ho）为0.279，所有位点均为He>Ho，Shannon指数（I）均值为0.581。遗传多样性分析结果表明，本研究采用的试验材料杂合程度极低，遗传多样性不高，这与所用试验材料均为原生种或其变型和变种相关。

2.2　遗传相似系数、聚类及PCoA分析

根据遗传相似性系数构建UPGMA遗传关系聚类图见图3。43份种质在遗传相似系数为0.61处可分为三大类群。第一类群包含了试验材料中的蝴蝶兰亚属所有种质、柏氏蝴蝶兰亚属五唇兰组和尖囊兰组种质及湿唇兰亚属种质。第一类群又可分为3个小类群：湿唇兰亚属与其他种质的遗传相似性最低，单独为一个小类群；五唇兰组的种质与蝴蝶兰组的种质遗传相似性更高，聚为一个小类群；尖囊兰组的种质与裂唇兰组的种质遗传相似性更高，聚为一个小类群。第二类群包含了柏氏蝴蝶兰亚属落叶蝴蝶兰组的所有5份种质。第三类群包含了柏氏蝴蝶兰亚属柏氏蝴蝶兰组的所有2份种质。

43份蝴蝶兰属种质的三维PCoA分析结果见图4。PC1、PC2和PC3分别占所有种质总遗传变异的11.18%、6.28%和4.91%。PCoA分析中同一个组的种质均聚为一类，除柏氏蝴蝶兰亚属五唇兰组的种质聚类圈和柏氏蝴蝶兰亚属柏氏蝴蝶兰组的种质聚类圈与蝴蝶兰亚属蝴蝶兰组种质的聚类圈有交叠，其他组的种质聚类圈均独立无交叠。

聚类结果和PCoA分析结果均与目前最新的蝴蝶兰属种质植物学分类^［1］结果基本一致，说明本研究结果符合蝴蝶兰属原生种的分类，筛选出的引物适用于蝴蝶兰属原种种质的亲缘关系鉴定、分类鉴定和分子身份证构建。

2.3　分子身份证构建

根据引物多态性信息含量（PIC）的高低，从1对引物开始逐步增加引物数量筛选可将43份蝴蝶兰属种质全部区分的引物组合，考虑到后续样品的适用性，保证每个种质最少有3个位点的有效扩增信息，最终确定引物组合94-CB033577+90-CB034920+28-N1001301+106-CB035168+43-N5725511+98-CB034003用于构建分子身份证。引物的扩增片段按分子量大小排列，从小到大以1~9标注，9个以上的等位基因以大写英文字母标注，若该位点在某个种质中无扩增则记为0，每个引物占两位。例如P01白花蝴蝶兰（Phal. amabilis）的分子身份证为33597C332268，所有种质的分子身份证编码如表3所示。

3　讨 论

蝴蝶兰属是兰科最具园艺价值的类群，稳居全球盆花销售榜前3位。我国国内20世纪80年代开始试种蝴蝶兰，近年来蝴蝶兰产业发展迅猛，《2024全国花卉产销形势分析报告》显示，2023年全国蝴蝶兰成品花上市量超过1.6亿株。目前我国市场占有率较高的蝴蝶兰品种主要还是来自中国台湾地区以及欧美国家，但近年来我国国内自主选育的蝴蝶兰新品种也逐渐增多。蝴蝶兰商品品种基本为杂交选育而来，丰富多样的种质资源造就了蝴蝶兰商品品种的多样化，是产业兴旺发达和持续发展的基石，而针对原始育种亲本——原生种质的收集、保存和鉴评则是育种工作的基石。截至2025年6月，除11个原生种暂未有杂交育种利用记录外，蝴蝶兰属其余的原生种均已被杂交利用。其中，蝴蝶兰亚属蝴蝶兰组的原生种是目前杂交利用率最高的一类，而蝴蝶兰亚属裂唇蝴蝶兰组的路德曼蝴蝶兰、安汶蝴蝶兰和横纹蝴蝶兰是斑纹类品种的重要亲本来源，柏氏蝴蝶兰亚属五唇兰组的五唇兰则是紫红色系蝴蝶兰品种的主要亲本之一。本研究采用的43份蝴蝶兰属原生种质，涵盖了蝴蝶兰属主要3个亚属每个组的代表种质，多为高利用率的杂交育种亲本，材料代表性强。通过TP-M13-SSR检测技术，利用通过简化基因组测序技术开发的26对SSR引物对这43份种质进行遗传多样性分析、分类鉴定及分子身份证构建。26对引物的平均有效扩增率超过90%，且90%以上的引物为高多态性引物，平均PIC达0.684，多态性超过Ko等^［14］通过磁珠富集法开发的针对蝴蝶兰属21个种的28对通用Genomic-SSR引物（PIC为0.63）、Fatimah等^［15］利用NCBI数据库开发筛选出的针对17个蝴蝶兰不同原生种的16对EST-SSR引物（PIC为0.507）及Tsai等^［16］利用蝴蝶兰转录组测序数据开发的用于22个蝴蝶兰原生种分类鉴定的10对通用EST-SSR引物（PIC为0.588）。聚类结果和PCoA分析结果均与目前最新的蝴蝶兰属种质植物学分类结果^［1］基本一致，说明本研究采用的26对引物更适用于蝴蝶兰属原生种质的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子身份证构建等，也适用于采用这些高利用率的杂交育种亲本选育而来的商品品种的鉴评。

本研究材料均为蝴蝶兰属原生种或其变型和变种，遗传多样性分析结果表明整体杂合程度极低，遗传多样性不丰富。蝴蝶兰属75个原生种，每个种除其原变种或变型外，大多还存在其他变种或变型，与原变种或变型相比多为花色不同。如本研究中采用的P08为小兰屿蝴蝶兰（原变型），花色为粉红色至紫罗兰色，而P09白花小兰屿蝴蝶兰（变型）为黄唇白花，P10蓝唇小兰屿蝴蝶兰（变型）则为蓝紫唇白花。Frankham^［17］研究表明，小种群或孤立分布的野生种通常具有较低的遗传多样性，针对蝴蝶兰属原生种遗传多样性分析结果与本研究结果类似，遗传多样性同样较低^［15-16］。聚类分析发现，本研究的分类结果与最新的蝴蝶兰属种质植物学分类结果基本一致，但柏氏蝴蝶兰亚属五唇兰组的五唇兰和尖囊兰组的大尖囊蝴蝶兰2份种质与蝴蝶兰亚属聚为一大支，并未与柏氏蝴蝶兰亚属其他组的种质聚为一支，这可能与蝴蝶兰属植物学分类的不断变化和发展有关。自1825年Blume建立蝴蝶兰属以来，分类学的争议未曾停止，五唇兰和大尖囊蝴蝶兰早期一直被分为独立的五唇兰属和尖囊兰属，随着分类学和分子系统学研究的不断深入，五唇兰和大尖囊蝴蝶兰被归到蝴蝶兰属中作为柏氏蝴蝶兰亚属中的2个种，但蝴蝶兰属的分类系统仍在根据不同的研究成果进行不断修订^［1］。

种质资源对现代种业的发展起到支撑保障作用，随着市场不断追求新、奇、特的发展需求，对兰花新品种的培育提出更高要求，而种质资源储备是新商品开发和产业持续发展的重要基础。目前，全球蝴蝶兰产业兴旺发达，但种质资源的相关研究却相对匮乏，尤其我国大陆地区产业和研究均起步较晚。分子身份证是将扩增图谱运用不同的编码方式数字化，使得种质资源获得唯一的条码，便于资源的分类管理和快速检索。本研究中采用毛细管电泳检测技术建立了一个蝴蝶兰属种质SSR标记分析系统，并采用以片段分子量大小为基础的核心引物组合法构建了43份蝴蝶兰属主要原生种质的分子身份证。针对其他物种^［4-6］和蝴蝶兰属种质^{［15-16，18］}的指纹图谱和分子身份证构建主要集中于栽培品种或少部分原生种，材料代表性较弱。基于蝴蝶兰属原生种资源丰富，商品品种均为原生种杂交选育，目前在英国皇家园艺学会登录的杂交组合超过40 000个，市场常见商品品种均来自这些杂交组合中的优选单株，品种极为繁多，所以针对少数原生种或栽培品种开发的引物和构建的分子身份证体系普适性较低。本研究选用的43份蝴蝶兰属原生种质涵盖了蝴蝶兰属目前杂交育种利用的主要亲本材料，筛选出的引物在这些原生种质中通用性高，也将适用于绝大部分基于这些原生种质杂交选育而来的商品品种，对于蝴蝶兰属原生种质分类保存、品种鉴定、亲缘关系分析以及后续的新品种产权保护等方面具有重要作用。后续将利用本研究筛选出的引物对蝴蝶兰商品品种进行检测，为商品品种的分类鉴定和新品种鉴别提供分子检测证据。

4　结 论

本研究采用TP-M13-SSR分子标记技术，基于简化基因组测序技术开发的蝴蝶兰属内和属间通用SSR引物中筛选出26对引物对43份蝴蝶兰属原生种质资源进行扩增检测。26对引物中有24对引物在本试验材料的扩增中呈高多态性，且43份种质基于扩增结果的聚类分析和PCoA分析结果均与目前最新的植物学分类结果基本一致，说明本研究筛选出的引物适用于对蝴蝶兰属原生种质的分类鉴评。根据扩增结果筛选出6对核心引物可以构建每份种质特有的分子身份证。本研究构建了蝴蝶兰原生种质的快速分子鉴定和分子身份证构建体系，为后续蝴蝶兰属种质资源的收集保存、鉴评和开发利用奠定了基础。

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基金资助

广东省科技计划项目(2024B1212060012)

国家重点研发计划(2023YFD230090402)

广州市科技计划项目(2024E04J1267)