新疆不同地区蛋鸡场鸡粪源与环境源大肠杆菌耐药性比较分析

Comparison of resistance analysis of Escherichia coli from chicken fecal source and environmental source in layer farms in different regions of Xinjiang

摘要

为了解在减抗政策背景下新疆规模化蛋鸡场鸡粪源与环境源大肠杆菌的耐药性差异及耐药基因分布特征，解析其与减抗政策实施的关联性，并根据耐药表型指导临床合理用药，本研究用灭菌拭子采集新疆五家渠、玛纳斯、塔城、焉耆、喀什5个规模化减抗/禁抗蛋鸡场鸡粪便（500份）和环境样品（141份），进行大肠杆菌的分离鉴定，采用琼脂稀释法测定10种抗菌药物的最小抑菌浓度，并通过PCR方法检测7种耐药基因。结果表明：1）共分离得到大肠杆菌496株，分离率为77.3%（496/641）。不同地区蛋鸡场大肠杆菌的分离率从高到低依次为塔城鸡场（88.6%，117/132）、焉耆鸡场（79.8%，99/124）、喀什鸡场（79.2%，99/125）、玛纳斯鸡场（71.8%，102/142）、五家渠鸡场（66.7%，79/118）。2）环境源大肠杆菌总体耐药性高于鸡粪源：环境源菌株中高耐药率（≥60.0%）药物占比达70.0%（7/10），显著高于鸡粪源菌株的40.0%（4/10）。具体表现为：环境源菌株对氨苄西林、氟苯尼考、四环素及恩诺沙星的耐药率均显著高于鸡粪源。3）鸡粪源菌和环境源菌中tet（A）基因的检出率在70.0%以上，bla_TEM和floR基因在环境源菌株中的检出率显著高于鸡粪源菌，bla_NDM与mcr-1基因仅在鸡粪源菌株中检出。综上，在减抗政策背景下，新疆5个地区蛋鸡场鸡粪源和环境源大肠杆菌的流行情况存在差异，环境源大肠杆菌耐药性显著高于鸡粪源，表明养殖环境中抗生素残留持续驱动着耐药基因富集和扩散。建议基于区域耐药谱差异优化抗生素使用方案，强化粪污资源化处理及环境消毒，阻断“粪便-水源-土壤”传播链以遏制耐药性传播。

Abstract

The study was to investigate the differences in antimicrobial resistance （AMR） and the distribution of resistance genes between Escherichia coli isolates from chicken fecal samples and the environment samples in large-scale layer farms in Xinjiang under China's antimicrobial reduction policy， and to elucidate the association with the implementation of this policy， and to guide rational clinical antimicrobial use based on resistance phenotypes. In this study， a total of 500 chicken fecal samples and 141 environmental samples were collected using sterile swabs from five large-scale layer farms in Wujiaqu， Manas， Tacheng， Yanqi， and Kashi. Escherichia coli was isolated and identified from these samples， and the minimum inhibitory concentrations （MICs） of 10 antibiotics were determined using the agar dilution method， and 7 antimicrobial resistance genes were detected by PCR. The results showed as follows： 1） 496 strains of Escherichia coli were isolated， with an isolation rate of 77.3% （496/641）. The isolation rates in each region， from highest to lowest， were as follows： Tacheng （88.6%， 117/132）， Yanqi （79.8%， 99/124）， Kashi （79.2%， 99/125）， Manas （71.8%， 102/142）， and Wujiaqu （66.7%， 79/118）. 2） Environmental-source Escherichia coli isolates exhibited significantly higher overall AMR than fecal-source isolates. Among the ten antibiotics tested， high resistance rates （≥60.0%） were observed for seven antibiotics （70.0%） in environmental isolates， which was significantly higher than that for four antibiotics （40.0%） in fecal isolates. Specifically， environmental isolates exhibited significantly higher resistance rates to ampicillin， florfenicol， tetracycline， and enrofloxacin compared to fecal-source isolates. 3） The detection rates of the tet（A） gene exceeded 70.0% in both fecal-source and environmental-source isolates. The detection rates of the bla_TEM and floR genes were significantly higher in environmental-source isolates. In contrast， the bla_NDM and mcr-1 genes were detected only in the fecal-source strains. In conclusion， under the antimicrobial reduction policy framework， variations in the prevalence of Escherichia coli among isolates from chicken fecal sources and environmental sources were observed across layer farms in 5 regions of Xinjiang， China. Environmental-source Escherichia coli isolates exhibited significantly higher antimicrobial resistance than fecal isolates， indicating that residual antibiotics in farm environments may drive the enrichment and dissemination of resistance genes. It is recommended to optimize antimicrobial usage based on regional resistance profiles， strengthening manure management and environmental disinfection and disrupting the “feces-water-soil” transmission chain to curb the spread of antimicrobial resistance.

Graphical abstract

关键词

规模化蛋鸡场 / 大肠杆菌 / 鸡粪源 / 环境源 / 耐药性

Key words

large-scale layer farm / Escherichia coli / chicken fecal source / environmental source / drug resistance

抗微生物药物耐药性（Antimicrobial resistance，AMR）作为21世纪全球公共卫生的核心挑战之一，已被世界卫生组织（WHO）列入“全球十大健康威胁”^［1］。减抗政策实施前，抗生素的长期滥用与亚治疗剂量的使用加速了耐药菌株的进化与传播，多重耐药（Multidrug resistant，MDR）菌株的出现不仅削弱了临床治疗效果，还可能通过食物链或环境媒介威胁人类公共卫生安全^［2］。我国自2016年起逐步构建系统性治理框架，通过《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020年）》率先实施跨部门防控策略，并在2017年由农业农村部正式推行兽用抗菌药使用减量化行动，但长期使用抗菌药物带来的细菌耐药性危害短期内难以消除。

近年来，随着“减抗/禁抗”政策的持续推进，多项研究对不同地区养殖场中大肠杆菌的耐药性变化进行了评估，结果呈现出一定的区域性差异。作为动物源及食品源样本中最常见的革兰氏阴性菌，大肠杆菌（Escherichia coli， E.coli）凭借其基因组的高度可塑性及耐药基因的富集能力，已成为人类医学和兽医学领域革兰氏阴性菌耐药性监测的核心指示菌^［3-4］。从已有研究来看，区域性差异随着政策的推进表现得更加明显，唐标等^［5］在湖南省（2019年）发现减抗与非减抗养殖场的猪、鸭、鸡源大肠杆菌耐药性无显著差异；张海龙^［6］对河北省（2018—2020年）鸡源大肠杆菌的耐药性研究表明，部分抗菌药物耐药性随着政策推进呈逐年下降趋势；周杰等^［7］在重庆市跨十年耐药性研究（2007—2008年和2020年）证实猪、鸡源大肠杆菌对多类抗菌药物耐药性显著降低。现有研究不仅反映了“减抗”政策在特定区域内的实施成效，也提示耐药性演变可能受养殖模式、用药习惯及生态背景等多重因素的影响，因此亟需在更多区域开展系统性研究，以全面评估政策实施效果。

然而，新疆作为我国西北重要的畜牧业生产基地，蛋鸡养殖规模化程度逐年提升，但其对大肠杆菌耐药性的系统性研究仍较为薄弱，尤其在跨区域耐药性比较、耐药基因传播特征及其与“减抗”政策关联性等方面缺乏深入解析。需特别关注的是，畜禽养殖环境作为耐药基因及耐药菌的重要储存库，其携带的耐药菌株可通过水源渗透、饲料污染及产品流通等途径传播至人类，并通过食物链生物放大效应形成连锁式公共卫生风险^［8-10］。

基于此，本研究通过采集位于新疆五家渠、玛纳斯、塔城、焉耆、喀什地区的规模化减抗/禁抗蛋鸡养殖场中的鸡粪源和环境源样品，对从中分离的大肠杆菌进行药敏试验与耐药基因检测，系统解析其耐药谱特征、多药耐药水平及区域分布规律，探讨“减抗”政策对耐药性演变的潜在影响，旨在为新疆蛋鸡养殖业制定差异化用药方案、优化细菌病综合防控策略提供科学依据，同时为我国“减抗”政策的精准实施与评估提供区域性数据支撑。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　菌株来源

2024年4—7月期间，在新疆五家渠、玛纳斯、塔城、焉耆、喀什5个地区减抗或禁抗蛋鸡养殖场（根据我国农业农村部第194号、250号公告及GB 31650—2019标准，蛋鸡养殖已全面禁用促生长抗生素，仅限育雏阶段治疗使用，产蛋期限制使用抗菌药物）。用灭菌拭子采集鸡粪便样品500份，环境（包括饲料、饮水、食槽、风机、土壤、鸡蛋传送带）样品141份，将样品放入1 mL 灭菌BHI的2 mL EP 管中，4 ℃冰箱保存。样品总数见表1。

1.1.2　主要试剂和培养基

MH培养基（Mueller-Hinton）、脑心浸液培养基（Brain heart infusion medium，BHI）、麦康凯琼脂（MacConkey Agar，MAC）、伊红美蓝琼脂（Eosin-Methylene Blue Agar，EMB）购自青岛海博生物技术有限公司；1×TE 缓冲液、50×TAE 购自上海生工生物有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2000 DNA Marker 购自北京天根生化科技有限公司；质控大肠杆菌ATCC 25922 购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2　方法

1.2.1　菌株的分离与鉴定

参考Wang等^［11］的方法进行E.coli分离鉴定。将采样管中的样品摇匀后，从中吸取10 μL至含有1 mL灭菌BHI的2 mL EP管中，于37 ℃摇床中培养4~6 h，将培养好的菌液分别划线于MAC和EMB平板进行双筛，并纯化，将疑似E.coli通过PCR方法检测E.coli持家基因uidA^［12］，对目的片段的产物回收并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。用BLAST软件比对测序结果，若相似性>96.0%则判定菌株为大肠杆菌。

1.2.2　菌株的保存

将分离鉴定出的菌株与60.0%灭菌甘油按2∶1（体积比）混合后保存至-80 ℃备用。

1.2.3　药物敏感性试验

采用2018年欧盟药敏试验标准（EUCAST）^［13］，并参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南VET01-S2（2013年）^［14］和M100-S29（2019年）^［15］，通过琼脂稀释法对分离得到的E.coli进行6大类10种抗菌药物的药物敏感性试验。药物包括氨基糖苷类（阿米卡星 AMK、庆大霉素 GEN）、四环素类（四环素 TET、替加环素 TIG）、喹诺酮类（恩诺沙星 ENR）、酰胺醇类（氟苯尼考 FFC）、β-内酰胺类（氨苄西林 AMP、头孢噻呋 CFF、亚胺培南 IPM）、多肽类（多黏菌素E，PE）6大类10种抗菌药物的药敏试验，ATCC 25922作为标准质控菌株，结果判定以EUCAST和CLSI动物源细菌抗菌药物敏感性试验执行标准为准。

1.2.4　耐药基因检测

根据药敏试验结果，在分离的大肠杆菌中进行氨基糖苷类（ant（3′′）-Ia）、四环素类（tet（A））、喹诺酮类（qnrS）、酰胺醇类（floR）、β-内酰胺类（bla_TEM、bla_NDM）和多肽类（mcr-1）常见的6类7种耐药基因检测，参考文献［16-20］。上述所用耐药基因引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.5　数据分析

采用SPSS 26.0软件的交叉表分析：1）通过卡方检验（Chi-square test）和费希尔精确检验（Fisher）比较不同地区蛋鸡场E.coli分离率、耐药率及耐药基因检出率（P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著）；2）分析每株细菌其耐药基因携带与耐药表型的关联性，采用卡方检验（期望频数≥5）或费希尔精确检验（期望频数<5），计算比值比（OR）及95%置信区间（95%CI），当P<0.05且OR≠1为显著关联。

2　结果与分析

2.1　不同地区蛋鸡场E.coli分离鉴定

从表2可知，641份样品分离得到大肠杆菌496株，总分离率为77.3%（496/641）。其中鸡粪源样品中大肠杆菌的分离率为86.4%（432/500），环境源样品中大肠杆菌的分离率为45.4%（64/141）。

5个地区蛋鸡场E.coli分离率呈地域差异，塔城地区E.coli以88.6%（117/132）的分离率显著高于其他地区（P<0.05）；焉耆地区（79.8%，99/124）和喀什地区（79.2%，99/125）的E.coli分离率差异不显著（P>0.05），但显著高于玛纳斯地区（71.8%，102/142）和五家渠地区（66.7%，79/118）（P<0.05）。各地区大肠杆菌分离率详见表2中总计部分。

塔城（98.0%，98/100）、焉耆（97.0%，97/100）和喀什（99.0%，99/100）地区鸡粪源E.coli分离率显著高于五家渠（61.0%，61/100）和玛纳斯（77.0%，77/100）地区鸡粪源（P<0.05）。五家渠环境源E.coli分离率达100.0%，而喀什环境源E.coli分离率为0，显示出极大的地区差异（P<0.05）。结果表明塔城地区E.coli流行率最高，且不同地区鸡粪源与环境源E.coli流行率存在极大差异。

2.2　不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药及多药耐药情况

不同地区蛋鸡场分离的E.coli对抗菌药物的耐药程度存在明显的地域差异。塔城地区蛋鸡场来源的E.coli对庆大霉素（80.3%）、氟苯尼考（91.5%）和头孢噻呋（74.4%）的耐药率均显著高于五家渠、玛纳斯和焉耆地区（P<0.05）；玛纳斯地区蛋鸡场来源的E.coli对氨苄西林（88.2%）和四环素（97.1%）的耐药率亦显著高于五家渠、焉耆和喀什地区（P<0.05）；喀什地区蛋鸡场来源的E.coli对多黏菌素E（88.9%）的耐药率显著高于其他地区（P<0.05），其对头孢噻呋（11.1%）耐药率为5个地区最低；所有地区蛋鸡场来源的E.coli对替加环素的耐药率均较低（3.0%~8.8%），且地区间差异不显著（P>0.05）；塔城地区蛋鸡场来源的E.coli对亚胺培南的耐药率（14.5%）显著高于五家渠和喀什蛋鸡场（均为0）（P<0.05）。

蛋鸡场来源的E.coli共有91种耐药谱，且耐药表型在0~9耐均有分布（表4）。其中塔城蛋鸡场来源E.coli的耐药问题最为复杂，7耐（27.4%，32/117）、8耐（17.9%，21/117）、9耐（6.0%，7/117）比例均为5个地区的峰值，也是唯一检出对9种抗菌药物同时耐药的地区，其菌株耐药谱均为AMK-AMP-GEN-ENR-FFC-TET-CFF-PE-TIG；喀什地区蛋鸡场来源的E.coli以4耐为主（49.5%，49/99），耐药谱型以AMP-FFC-TET-PE占比最多，为85.7%（42/49），其次为5耐（21.2%）；玛纳斯地区蛋鸡场来源的E.coli耐药谱型以4耐（23.5%，24/102）和6耐（22.5%，23/102）为主；五家渠地区蛋鸡场来源的E.coli以3耐为主，占比为21.5%（17/79）；焉耆地区蛋鸡场来源的E.coli则以1耐为主，占比为25.3%（25/99）。结果表明，塔城地区蛋鸡场来源的E.coli耐药问题最为突出，耐药严重程度远超于其他地区（表3和表4）。

2.2.1　不同地区鸡粪源E.coli耐药及多药耐药分析

从表5可见塔城地区鸡粪源E.coli对阿米卡星（26.5%）的耐药率显著高于五家渠、玛纳斯和喀什地区（均为0）（P<0.05）；对氨苄西林的耐药率（100.0%）显著高于玛纳斯（88.3%）、五家渠（63.9%）和焉耆地区（53.6%）（P<0.05）；对庆大霉素（81.6%）和恩诺沙星（74.5%）的耐药率均显著高于其他地区（P<0.05）；对氟苯尼考（90.8%）的耐药率显著高于玛纳斯（50.6%）、五家渠（39.3%）和焉耆地区（32.0%）（P<0.05），与喀什地区（78.8%）差异不显著（P>0.05）；对头孢噻呋的耐药率（77.6%）显著高于喀什地区（11.1%）（P<0.05），与五家渠（36.1%）、玛纳斯（35.1%）和焉耆地区（34.0%）无显著差异（P>0.05）；对替加环素的耐药率（10.2%）显著高于喀什（3.0%）、五家渠（1.6%）及玛纳斯地区（1.3%）（P<0.05）；对亚胺培南的耐药率（17.3%）显著高于五家渠（0）及喀什地区（0）（P<0.05）。喀什地区鸡粪源E.coli对多黏菌素E的耐药率（88.9%）显著高于焉耆（57.7%）、玛纳斯（39.0%）和五家渠地区（37.7%）（P<0.05）。

五家渠地区鸡粪源E.coli中1~3耐占61.0%（37/61），6耐和8耐各1株，各占1.6%（1/61）；玛纳斯地区鸡粪源E.coli中0~7耐均有分布，以4耐为主，占比29.9%（23/77）；塔城地区鸡粪源E.coli耐药谱主要集中在7耐和8耐，占比为52.0%（51/98），同时9耐菌株占比7.1%（7/98）；焉耆地区鸡粪源E.coli以1耐为主，占比25.8%（25/97），有3株8耐菌株，占3.1%；喀什地区鸡粪源E.coli耐药谱集中在4耐和5耐，占71.0%（70/99）。上述结果表明，塔城地区鸡粪源E.coli耐药程度最严重，7耐以上菌株占59.2%，且为唯一检出9耐菌株地区。

2.2.2　不同地区环境源E.coli耐药及多药耐药分析

从表6可知不同地区环境源E.coli对氨苄西林、恩诺沙星的耐药率差异不显著（P>0.05）。五家渠地区环境源E.coli对四环素的耐药率（94.4%）显著高于塔城地区（84.2%）（P<0.05），与玛纳斯（96.0%）及焉耆地区（100.0%）差异不显著（P>0.05）。玛纳斯地区环境源E.coli对头孢噻呋（92.0%）和替加环素（32.0%）的耐药率显著高于塔城（57.9%、0）和焉耆地区（50.0%、0）（P<0.05）。塔城地区环境源E.coli对氟苯尼考的耐药率（94.7%）显著高于焉耆地区（50.0%）（P<0.05），与五家渠（94.4%）及玛纳斯地区（92.0%）差异不显著（P>0.05）；焉耆地区环境源E.coli对阿米卡星（50.0%）的耐药率显著高于其他地区（P<0.05）；对庆大霉素的耐药率（100.0%）显著高于玛纳斯地区（48.0%）（P<0.05），与五家渠（61.1%）和塔城地区（73.7%）差异不显著（P>0.05）；对多黏菌素E的耐药率（50.0%）与其他地区差异不显著（P>0.05）。所有地区环境源E.coli对亚胺培南的耐药率均为0，无显著差异（P>0.05）。五家渠地区环境源E.coli耐药谱型以6耐和7耐为主，各占33.3%（6/18），有1株为8耐，占5.6%（1/18）。玛纳斯地区环境源E.coli耐药谱主要集中在5~7耐，占84.0%（21/25）。塔城地区环境源E.coli在3~7耐均有分布，以6耐为主，占47.4%（9/19）。焉耆地区环境源E.coli耐药谱型以4耐和8耐为主，各占50.0%（1/2）。结果表明，环境源E.coli除对亚胺培南完全敏感外，对其他抗菌药物的耐药性呈现出明显的地域差异。

2.3　不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药基因检出

由表7可知5个地区蛋鸡场分离的E.coli耐药基因检出率呈地域差异。塔城地区鸡粪源E.coli中ant（3′′）-Ia（89.8%）、floR（79.6%）及bla_NDM（20.4%）基因的检出率显著高于其他地区（P<0.05），其环境源E.coli中ant（3′′）-Ia（68.4%）和floR（78.9%）携带率高于其他4个地区，凸显其耐药基因的多样性和复杂性。玛纳斯地区鸡粪源E.coli中tet（A）的检出率（93.5%）显著高于塔城（82.7%）和喀什地区（80.8%）（P<0.05），该基因在五家渠（52.5%）和焉耆地区（42.3%）的检出率明显偏低，环境源E.coli中耐药基因tet（A）（88.0%）检出率高于其他4个地区，反映上述耐药基因同时在宿主和环境之间传播。喀什地区鸡粪源E.coli中耐药基因bla_TEM（61.6%）检出率显著高于塔城（33.7%）和焉耆（26.8%）地区（P<0.05），bla_NDM在1株鸡粪源E.coli中检出，检出率为1.0%。玛纳斯、塔城、喀什地区鸡粪源E.coli中qnrS的检出率均超过70.0%，显著高于焉耆（27.8%）和五家渠地区（47.5%）（P<0.05）。mcr-1在鸡粪源E.coli中整体检出率较低，仅在塔城（3.1%）和焉耆（2.1%）地区检出，mcr-1和bla_NDM在所有地区环境源中均未检出，表明此类基因尚未广泛传播。基因检测结果表明：塔城地区成为ant（3′′）-Ia、floR、bla_NDM多重耐药基因富集区；玛纳斯地区tet（A）呈现跨宿主-环境同步传播特征；塔城地区、喀什地区和焉耆地区鸡粪源E.coli中检出bla_NDM和/或mcr-1高风险基因，推测其尚未在环境中扩散。

2.4　不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药表型和检出耐药基因的相关性分析

用卡方检验和费希尔精确检验分析496株不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药表型和检出耐药基因的相关性（表8），结果显示，496株不同地区蛋鸡场来源E.coli对阿米卡星、庆大霉素、四环素、恩诺沙星、氟苯尼考、氨苄西林和亚胺培南7种药物的耐药表型和检出的耐药基因呈极显著相关（OR＞1，P＜0.001）；对替加环素的耐药表型与其耐药基因tet（A）呈显著相关（OR＞1， P＜0.05）；头孢噻呋、多黏菌素E耐药表型与其检出的耐药基因不相关（OR=0.70，95%CI=0.49~1.00，P=0.058）和（P=0.084）。

桑基图进一步揭示不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药表型和耐药基因的关联特征（图1）。塔城地区蛋鸡场来源E.coli对四环素、氟苯尼考、庆大霉素的耐药表型分别与tet（A）、floR、ant（3′′）-Ia基因强关联。玛纳斯地区蛋鸡场来源E.coli四环素耐药表型突出与tet（A）基因强关联，同时氨苄西林与bla_TEM、恩诺沙星与qnrS基因呈强关联。喀什地区氨苄西林耐药由bla_TEM主导，四环素与tet（A）、氟苯尼考与floR基因均呈强关联。五家渠地区以四环素耐药为核心表型，与tet（A）强关联。焉耆地区耐药不突出，以四环素耐药为主要表型。此外，多黏菌素E耐药表型未检出主要关联耐药基因，与表8中多黏菌素E耐药表型与其耐药基因mcr-1无显著相关性（P=0.084）相互印证。结果表明，不同地区蛋鸡场来源E.coli耐药表型-基因关联存在显著地域差异。

3　讨 论

3.1　不同地区减抗或禁抗蛋鸡场来源的鸡粪源、环境源E.coli的流行情况分析

养殖场中鸡粪源E.coli的分离率（86.4%，432/500）远高于环境源E.coli（45.4%，64/141），表明蛋鸡是养殖场中大肠杆菌的主要携带宿主。从地区分布来看，五家渠（66.7%）和玛纳斯（71.8%）地区蛋鸡场来源E.coli的分离率低于其他3个地区，推测其差异可能与采样季节及地理环境因素相关。五家渠（61.0%）和玛纳斯（77.0%）地区鸡粪源E.coli的分离率低于塔城（98.0%）、焉耆（97.0%）和喀什（99.0%）地区，推测这种差异可能与采样季节的温度有关，前者在温度较低的4—5月采样，后者在温度较高的6—7月采样。不同地区环境源E.coli的分离率差异较大，其中五家渠地区最高（100.0%），玛纳斯（59.5%）与塔城（59.4%）地区次之，焉耆（8.3%）和喀什（0）地区最低，推测这种巨大差异可能与养殖场环境消杀措施的执行力度和效果有关。通过与既往研究对比可见：本研究中鸡粪源E.coli分离率（86.4%）略高于乔海英^［21］报道的吉林省6家鸡养殖场粪便样品分离率（81.9%），但低于刘挺等^［22］在江苏省8个养鸡场的研究结果（99.4%）。环境源E.coli分离率（45.4%）与Mandal等^［23］对肉鸡场环境（农场污水）中E.coli的研究结果（71.0%）相差较大，推测其差异可能与环境样本来源不同有关，本研究中的环境源样品包括饲料、饮水、风机、土壤等。综上所述，不同地区E.coli分离率的差异可能受地域养殖条件、检测方法的影响。

3.2　不同地区减抗或禁抗蛋鸡场来源的鸡粪源、环境源E.coli的耐药表型分析

不同地区蛋鸡场来源E.coli的耐药性结果显示四环素呈现全域高水平耐药（64.6%~97.4%），但耐药模式存在显著地域差异。塔城地区对氨苄西林（100.0%）完全耐药，对氟苯尼考（91.5%）与庆大霉素（80.3%）的耐药问题尤为突出，同时对恩诺沙星（76.9%）高耐；玛纳斯地区对氨苄西林（88.2%）耐药严重；喀什地区对多黏菌素E（88.9%）耐药率为各地区之首，同时对氨苄西林（77.8%）和氟苯尼考（78.8%）高耐；五家渠地区以氨苄西林（69.6%）耐药为主，整体耐药水平中等，对阿米卡星、亚胺培南完全敏感（0）；焉耆地区整体耐药水平为5个地区最低（对7种抗菌药物的耐药率≤34.3%），主要对四环素（79.8%）耐药。研究发现，菌株来源显著影响耐药谱：鸡粪源E.coli对四环素（85.2%）、氨苄西林（77.3%）和多黏菌素E（63.7%）的耐药率高，在63.0%以上；而环境源E.coli对氨苄西林、氟苯尼考和四环素耐药率均高达92.2%，对庆大霉素（60.9%）和恩诺沙星（87.5%）的耐药水平亦高于鸡粪源菌株。本研究中，鸡粪源E.coli对四环素的耐药率（85.2%）高于李亚菲等^［24］2019年在广东省3个蛋鸡场分离出的鸡源大肠杆菌对四环素的耐药率（78.6%），但低于高笑等^［25］2017—2021年在河南、江西两省鸡源大肠杆菌对四环素的耐药率（93.7%），与唐标等^［5］2019年湖南省14个鸡场的研究结果（87.7%）相近；对氨苄西林的耐药率（77.3%）高于李丹^［26］2020年在辽宁省3个养鸡场的研究结果（55.6%），与陈月月等^［27］2016年新疆伊犁地区霍城县分离出的鸡源大肠杆菌耐药率相近（74.4%），而对氟苯尼考（60.4%）、恩诺沙星（36.8%）的耐药率低于其研究结果（71.1%、65.9%），提示区域间耐药率差异可能与不同地区抗生素历史使用强度不均衡有关，在减抗限抗大背景下，不同地区耐药性演变仍存在差异。需高度警示的是，多黏菌素E作为治疗碳青霉烯类耐药菌感染的“最后一道防线”^［28］，在鸡粪源和环境源E.coli中已出现较高耐药率（63.7%、31.3%）。

不同地区蛋鸡场来源E.coli的多药耐药情况严峻，3耐及3耐以上菌株占78.0%，环境源E.coli（95.3%）多药耐药率高于鸡粪源E.coli（75.5%），这一差异表明，环境源菌株可能面临更强的抗生素选择压力，可能介导耐药基因扩散。基于5个地区耐药梯度分布（塔城/喀什＞玛纳斯＞五家渠＞焉耆）与菌株来源差异，减抗政策需实施区域化精准调控：1）多重耐药区域（塔城和喀什地区）须对氟苯尼考、恩诺沙星、庆大霉素执行严格管控，将多黏菌素E纳入特殊管控药品清单；2）全域性防控四环素和氨苄西林，将四环素纳入“高风险抗生素限用清单”，实行区域差异化总量控制；氨苄西林在中低耐药区（五家渠、焉耆地区）作为限制预防性用药，在高耐药区（塔城、玛纳斯、喀什地区）作为非治疗性禁用药。

3.3　不同地区减抗/禁抗蛋鸡场来源的鸡粪源、环境源E.coli的耐药基因分析

在新疆五家渠、玛纳斯、塔城、焉耆和喀什地区蛋鸡场分离出的E.coli中，四环素类tet（A）、喹诺酮类qnrS、酰胺醇类floR和β-内酰胺酶类bla_TEM耐药基因检出率普遍较高（均＞45.0%），表明这四类耐药基因在5个地区蛋鸡养殖场中广泛传播，而不同地区耐药基因的流行特征存在显著差异：塔城地区氨基糖苷类（ant（3′′）-Ia，86.3%）和酰胺醇类（floR，79.5%）耐药基因检出率显著高于其他地区，也是唯一同时检出碳青霉烯类耐药基因bla_NDM（17.1%）和多黏菌素类耐药基因mcr-1（2.6%）的地区，提示存在特殊的耐药风险；玛纳斯地区四环素类耐药基因tet（A）的检出率（92.2%）为5个地区最高，同时氨基糖苷类（ant（3′′）-Ia，73.5%）和喹诺酮类（qnrS，74.5%）耐药基因流行率高；喀什地区β-内酰胺酶类bla_TEM检出率（61.6%）高于其他地区，四环素类（tet（A），80.8%）和喹诺酮类（qnrS，70.7%）耐药基因流行率也较高，且检出碳青霉烯类耐药基因bla_NDM，检出率为1.0%；五家渠地区四环素类耐药基因tet（A）检出率（59.5%）为该地区最高，未检出碳青霉烯类耐药基因bla_NDM和多黏菌素类耐药基因mcr-1；焉耆地区ant（3′′）-Ia（19.2%）、tet（A）（42.4%）、qnrS（29.3%）、floR（18.2%）、bla_TEM（28.3%）多类耐药基因检出率为5个地区最低，且未检出碳青霉烯类耐药基因bla_NDM，但需要注意的是，该地区多黏菌素类耐药基因mcr-1检出率为2.0%，高于五家渠、玛纳斯和喀什地区（均为0），仅次于塔城地区（2.6%）。这种区域性差异可能与我国减抗政策的实施存在潜在关联：环境源中qnrS、bla_TEM、ant（3′′）-Ia、floR等耐药基因检出率高于鸡粪源，提示在减抗政策下，蛋鸡体内用药减少可能降低其携带耐药基因的选择压力，而环境中残留的抗生素（通过粪便与废水排放）仍在持续施加选择压力，导致耐药基因在环境中富集，需特别关注碳青霉烯类耐药基因bla_NDM（检出率4.2%，仅在塔城和喀什地区鸡粪源中检出）及多黏菌素类耐药基因mcr-1（检出率1.0%，仅在塔城和焉耆地区鸡粪源中检出），高于李宏博等^［29］2020年在新疆3个村落中mcr-1的检出率（0.3%），虽然环境样菌株中未检出上述基因，但动物-环境界面的传播风险依然存在，因此减抗政策需协同环境治理。要严格规范养殖场废水处理，阻断耐药基因向环境扩散，从源头遏制耐药性在“动物-环境-人”链条中传播。此外，部分菌株存在耐药基因阳性却未表现相应耐药表型，或呈现耐药表型却未检出相关耐药基因的现象，提示可能存在未检测的耐药基因或其他耐药机制介导的耐药，或者存在耐药基因通过不表达降低菌株适应性代价，故无耐药表型。

4　结 论

在减抗政策持续推进下，新疆5个地区减抗或禁抗蛋鸡养殖场虽通过限制用药降低了蛋鸡体内药物选择压力，但耐药性问题依然严峻且耐药基因普遍存在，尤其对四环素类及β-内酰胺类药物耐药率偏高，环境源和鸡粪源大肠杆菌普遍呈现多药耐药性，且环境源耐药程度较鸡粪源更严重，凸显耐药性治理的长期性与复杂性，建议养殖场可以采用中药替代抗菌药物，避免药物滥用，同时强化养殖场环境综合治理（如粪污资源化处理和废水消毒），阻断耐药基因通过水源、土壤、粪便等途径传播，降低交叉污染风险。

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基金资助

国家自然科学基金-地区基金项目(32360910)

自治区“天山英才”培养计划-“三农”骨干人才培养项目(2023SNGGGCC008)