玉米种子耐低温萌发QTL位点的初定位

Quantitative trait locus mapping for low‑temperature germination ability in maize

摘要

早春低温胁迫严重制约我国北方及高海拔地区玉米生产，挖掘耐低温萌发遗传位点是培育抗逆品种的重要基础。本研究以我国河北省承德地区特有的耐低温萌发自交系‘C181’和骨干系‘PH6WC’为亲本，构建了包含209个家系的F₄分离群体。对群体进行冷浸发芽试验，选取冷浸发芽率、苗长和根长作为玉米种子耐低温萌发能力的评价指标。利用3.5K液相芯片进行全基因组基因分型检测，构建遗传连锁图谱，利用完备区间作图法（ICIM）检测低温萌发相关QTL位点。结果表明：利用耐低温萌发自交系‘C181’和骨干系‘PH6WC’的911个多态性SNP标记构建的遗传连锁图谱总长为3 772.25 cM，标记间的平均遗传距离约为4.14 cM。共检测到调控冷浸发芽率的QTL位点11个、调控苗长的QTL位点1个和调控根长的QTL位点2个，各QTL表型贡献率在2.33%至8.27%之间。在表型贡献率最高的2个QTL区间内，初步筛选出与苗长相关的候选基因Zm00001d007153（编码缺氧响应蛋白）和与发芽率相关的候选基因Zm00001d049926（编码赤霉素代谢相关酶）。综上，冷浸发芽法是鉴定玉米种子耐低温萌发QTL位点的有效方法，利用我国特有的耐低温种质‘C181’能够发掘新的遗传位点，为后续基因克隆与耐低温遗传改良提供了重要位点信息。

Abstract

Low-temperature stress during early spring poses a major constraint on maize production in northern China and other high-altitude regions. Mining genetic loci associated with low-temperature germination （LTG） tolerance is therefore essential for developing resilient cultivars. In this study， an F₄ segregating population consisting of 209 families was developed from a cross between ‘C181’，a cold-tolerant inbred line unique to Chengde， Hebei Province， China，and the elite but cold-sensitive line ‘PH6WC’. The population was subjected to cold-soaking germination tests， with germination rate， seedling length， and root length under low temperature used as indicators of LTG tolerance. Genome-wide genotyping was performed using a 3.5K liquid SNP array， followed by construction of a genetic linkage map and detection of LTG-related quantitative trait loci （QTL） via inclusive composite interval mapping （ICIM）. A linkage map spanning 3 772.25 cM was constructed with 911 polymorphic SNP markers， yielding an average marker interval of 4.14 cM. A total of 14 QTLs were identified， including 11 for cold-soaking germination rate， one for seedling length， and two for root length. These QTLs individually explained 2.33% to 8.27% of the phenotypic variance. Within the two QTL intervals with the highest contributions， Zm00001d007153 （encoding a hypoxia-responsive protein） and Zm00001d049926 （encoding an enzyme involved in gibberellin metabolism） were prioritized as candidate genes associated with seedling length and germination rate， respectively. Our results demonstrate that the cold-soaking germination assay is an effective method for mapping QTLs underlying LTG tolerance in maize， and that the unique Chinese cold-tolerant germplasm ‘C181’ can serve as a valuable resource for uncovering novel genetic loci. This study provides critical information for subsequent gene cloning and genetic improvement of low-temperature tolerance in maize.

Graphical abstract

关键词

玉米 / 种子萌发 / 耐低温 / QTL定位

Key words

maize / seed germination / cold tolerance / QTL mapping

玉米起源于热带和亚热带区域，属于典型的喜温作物，对于低温冷害的耐受能力相对薄弱，极易受到冷害的不良影响^［1］。早春低温冷害是影响玉米生产的主要气象灾害之一，特别是在北方地区和高海拔地区^［2］。低温胁迫可引起一系列生理反应，如渗透调节物质含量改变、活性氧异常积累、激素稳态破坏等，导致膜系统损伤、细胞脱水、蛋白质变性^［3-5］。玉米种子萌发期遭受低温冷害不仅容易造成缺苗断垄，还会延缓生长发育，最终影响玉米产量。挖掘玉米耐低温萌发相关的遗传位点和调控基因对保障我国春玉米高产稳产具有重要意义。解析玉米耐低温萌发的遗传基础，是培育抗逆品种、保障高产稳产的关键。

玉米耐低温萌发属于复杂的数量性状，且易受到外界环境的影响^［6］。近年来，随着分子标记技术的快速发展，利用连锁分析和关联分析定位QTL位点已成为研究热点^［7］。Rodriguez等^［8］利用B73和Mo17组配的遗传群体定位到了2个与耐冷性状相关的QTL；Hu等^［9］利用IBM Syn4 重组自交系（RIL），检测到12个与低温发芽率和主根长度相关的QTL。全基因组关联分析（GWAS）则在自然群体中检测到更多与萌发期耐冷性显著关联的位点，Huang等^［10］利用125个玉米自交系对玉米种子萌发和幼苗耐低温特性进行测定，GWAS共检测到43个显著关联的SNP位点；Hu等^［11］利用282份玉米自交系对种子萌发耐低温特性进行测定，GWAS获得了17个显著关联的SNP位点。这些研究定位了多个玉米耐低温相关的QTL位点，但从中克隆功能基因的报道十分缺乏，而且仍需利用更多种质资源克隆相关位点及基因^［12］。

筛选我国特有的地方耐低温种质资源、挖掘耐低温相关QTL和功能基因，可以为耐低温新品种培育提供基础材料和基因资源，为我国玉米生产提供保障^［13］。冷浸发芽法利用低温水浴处理种子来模拟种子吸胀时期遭受低温胁迫，是鉴定玉米种子耐低温萌发能力的有效方法，与田间出苗率相关性较高，为表型精准鉴定提供了可靠方法^［14］。本研究选取来源于河北省承德高纬度地区强耐低温自交系‘C181’与广适但对低温敏感的骨干系‘PH6WC’为亲本，构建遗传分离群体，旨在通过冷浸发芽试验结合SNP芯片基因分型技术，初步定位调控玉米种子耐低温萌发的QTL位点，并挖掘潜在的候选基因，以期为玉米种子耐低温萌发遗传机制解析提供新的遗传位点和理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

本试验玉米材料是以对低温敏感程度存在显著差异的2个自交系‘PH6WC’和‘C181’为亲本，杂交后连续自交，得到F₄群体，共计209份。‘C181’来源于河北承德农科院，‘PH6WC’是杂交种‘先玉 335’的母本。

田间材料分别种植于海南省三亚市中国农科院作物科学研究所试验基地和河北省涿州市中国农业大学教学试验场，播种时5 m行长，20 cm株距，在所有雌穗抽丝前套袋以防花粉污染，吐丝后进行人工授粉。收获材料时按整行收取，剔除病变、劣变和杂株的果穗。

1.2　试验方法

1.2.1　亲本和定位群体的表型鉴定

标准发芽：采用国际种子检验协会的标准发芽方法进行^［15］，每份材料挑选50粒完好种子，使用1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min后，去离子水清洗直至完全无味。发芽纸用去离子水完全浸湿，确保纸张充分吸水。酒精喷洒桌面，铺两层发芽纸，利用置种板将50粒种子均匀平整地摆在发芽纸上，种胚朝下，覆盖一张发芽纸。将三层发芽纸轻轻卷起，竖直放入12号自封袋中，记录材料名称以及日期，放入25 ℃的人工气候箱恒温培养7 d后，调查种子的发芽率（GP），并随机测量10株幼苗的苗长（SL）和根长（RL）。

冷浸发芽：按照农业农村部行业标准《玉米种子活力测定 冷浸发芽法》（NY/T 3766—2020）^［15］进行。每份材料中挑选50粒完好的种子，1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min以上，去离子水洗净，放入提前预冷的4 ℃去离子水中浸泡3 d后，取出回干，再进行上述标准发芽试验，记录冷浸条件下GP、SL、RL。

1.2.2　电导率测定

亲本材料各挑选出25粒种子，利用精度为0.01 g的秤称重，记录下重量W。种子用去离子水冲洗3次，定性滤纸轻轻吸去种子表面水分。将种子和100 mL去离子水加入150 mL的烧杯中，种子完全浸没后立即测定溶液电导率，记为d₁。用铝箔密封烧杯，并将其置于4 ℃的环境中浸种3 d。浸种结束后，立刻移除铝箔或薄膜盖，轻轻摇晃烧杯使种子与溶液充分混合。将电极放入溶液中，测定此时浸出液电导率，记为d₂。将装有种子和浸出液的烧杯放入水浴锅中，100 ℃加热30 min。取出烧杯冷却至室温，测定绝对电导率，记为d₃。按式（1）和（2）分别计算浸出液电导率与相对电导率。

\mathrm{浸出}\mathrm{液电}\mathrm{导率}=\frac{d_{\mathrm{2}}-d_{\mathrm{1}}}{W}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(\mathrm{1})

\mathrm{相对}\mathrm{电导}\mathrm{率}=\frac{d_{\mathrm{2}}-d_{\mathrm{1}}}{d_{\mathrm{3}}-d_{\mathrm{1}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(\mathrm{2})

式中：W为测定种子重量，g；d₁ 为初始电导率，μS/cm；d₂ 为种子冷浸后电导率，μS/cm；d₃ 为种子完全失活后的绝对电导率，μS/cm。

1.2.3　定位群体遗传连锁图谱构建和QTL定位

取定位亲本和群体幼嫩叶片，送至河北省石家庄市博瑞迪生物技术有限公司，利用3.5K液相芯片进行基因型检测，并利用R包CMplot绘制SNP密度分布图。利用QTL IciMapping SNP转换时去除亲本和后代间没有多态性的标记，并在QTL IciMapping 4.2软件BIN中设置50%的缺失率阈值和0.05的偏分率阈值过滤掉低质量的SNP，再根据亲本基因型筛选出在群体中符合1∶2∶1分离比的标记构建遗传连锁图谱。利用QTL IciMapping 4.2软件对群体进行QTL位点初定位，采用完备区间作图法（ICIM），以LOD值≥2.5作为存在QTL的阈值，同时计算筛选到的QTL的加性和显性效应，按照“q＋性状缩写＋染色体编号”的命名方法对QTL位点进行命名。

1.3　统计分析

利用SPSS 28.0软件对发芽试验的表型数据进行皮尔逊（Pearson）和斯皮尔曼（Spearman）相关性分析。利用Origin 2021软件对发芽试验的表型数据进行频数分布统计。

2　结果与分析

2.1　亲本耐低温萌发能力及细胞膜稳定性差异

2.1.1　亲本‘C181’和‘PH6WC’标准和低温萌发表型比较

标准萌发条件下，两个亲本的发芽率、苗长和根长均无显著差异（图1（a）和图2）。冷浸处理后，‘C181’的发芽率保持96%的高水平，与标准发芽相比几乎无变化，但‘PH6WC’的发芽率降到80%（图1（b）和图2（a）），同时冷浸处理后‘PH6WC’的根长也显著低于‘C181’（图2（c））。表明双亲对低温的敏感程度具有显著差异，‘C181’自交系在萌发期具有显著的耐低温特性。

2.1.2　亲本‘C181’和‘PH6WC’低温萌发电导率测定

将亲本‘C181’与‘PH6WC’的种子冷浸处理3 d，测量浸出液电导率，结果表明‘C181’的浸出液电导率为5.51 μS/cm，‘PH6WC’的浸出液电导率为7.86 μS/cm，显著性分析结果表明，亲本‘PH6WC’冷浸处理后电导率显著高于‘C181’（图3（a））。将装有种子和浸出液的烧杯彻底煮沸后，测定绝对电导率，结果表明‘PH6WC’的相对电导率也显著高于‘C181’（图3（b））。这证实低温胁迫对‘PH6WC’种子细胞膜造成的损伤更为严重，导致更多胞内溶质外渗，而‘C181’自交系膜系统损伤较轻，更耐低温。

2.2　定位群体不同萌发条件下的表型分析

2.2.1　定位群体标准发芽条件下的表型变异和相关性

F₄群体在标准发芽条件下，发芽率、苗长以及根长均呈现连续变异，其中苗长与根长（r=0.87，P<0.01），发芽率与苗长（r=0.23，P<0.01）、发芽率与根长（r=0.19，P<0.01）均呈极显著正相关性（表1）。发现不同果穗的发芽率位于36%~100%之间，发芽率均值为88%，变异系数为12%，偏度和峰度分别为-1.31和2.36（表2）。苗长分布于1.61~15.54 cm之间，均值为6.25 cm，变异系数为43%，偏度和峰度分别为0.63和0.00（表2）。定位群体的根长在4.11~25.84 cm之间，均值为11.46 cm，变异系数为37%，偏度和峰度为0.52和-0.52（表2）。

2.2.2　定位群体冷浸发芽条件下的表型变异和相关性

标准发芽率80%及以上的种子原始活力较高，可以用于后续冷浸发芽试验。从中随机选取209份材料进行冷浸发芽试验，统计每份材料的冷浸发芽率、苗长和根长。F₄群体在冷浸发芽条件下，发芽率、苗长以及根长均呈现连续变异，其中苗长与根长（r=0.80，P<0.01），发芽率与苗长（r=0.24，P<0.01）、发芽率与根长（r=0.25，P<0.01）均呈极显著正相关性（表3）。发现不同果穗的发芽率位于17%~100%之间，发芽率均值为75%，变异系数为25%，偏度和峰度分别为-1.22和0.97（表4）。冷浸后苗长分布于1.16~10.48 cm之间，均值为4.77 cm，变异系数为39%，偏度和峰度分别为0.36和-0.17（表4）。冷浸后根长在3.36~17.26 cm之间，均值为8.99 cm，变异系数为30%，偏度和峰度为0.66和0.23（表4）。与标准发芽试验的表型数据进行对比，发现冷浸发芽率平均降低了13%，苗长平均减少了1.48 cm，根长平均减少了2.47 cm，说明低温后种子活力显著降低。

2.2.3　定位群体冷浸发芽表型频数分布图

对定位群体冷浸发芽表型数据绘制频数分布直方图，发现冷浸发芽率呈现偏态分布，根长和苗

长呈现正态分布，可以用作后续的耐低温QTL位点的定位（图4）。

2.3　玉米耐低温萌发QTL的初定位

2.3.1　遗传连锁图谱构建

利用3.5K液相芯片-靶向测序基因型分型（GBTS）技术对双亲和定位群体进行基因型鉴定，总共获得3 617个初始SNP标记，使用R包CMplot绘制SNP标记分布图，发现它们1号、2号和3号染色体上的标记分布密度较高（图5）。利用QTL IciMapping SNP转换功能去掉亲本与后代间没有多态性的标记，过滤低质量的SNP位点后得到了1 766个SNP标记，多态率达到了49%，说明这两个亲本有较大的遗传背景差异。

从多态性标记中筛选出在群体中分离比符合1∶2∶1的标记，共计911个。使用QTL IciMapping 4.2软件对筛选的标记进行遗传连锁作图。遗传连锁图谱总长为3 772.25 cM，覆盖10条染色体，1~10号染色体分别有159、82、22、161、84、95、124、40、79和65个标记，标记间的平均遗传距离约为4.14 cM（图6）。其中1号染色体，4号染色体，7号染色体上的标记较多，标记间平均距离为3.95、3.22和3.01 cM，3号染色体标记较少，标记间平均距离为10.50 cM（表5）。

2.3.2　耐低温萌发性状的QTL初定位

使用QTL Icimapping 4.2软件的完备区间作图法（ICIM）对群体种子冷浸发芽率、苗长，根长三种性状进行QTL定位，将LOD阈值设置为2.5，共检测到了14个与3种低温萌发性状相关的QTL位点（图7，表6）。其中与冷浸发芽率相关的QTL位点最多，共检测到11个，分别位于1号、2号、4号、6号、8号和10号染色体上，LOD值介于3.69~11.67，表型贡献率2.33%~7.55%（图7，表6）。调控冷浸发芽苗长的QTL1个（qSL2⁃1），位于2号染色体上的342 cM处，LOD值为2.67，表型贡献率为8.27%（图7，表6）。调控冷浸发芽根长的QTL 2个（qRL1⁃1，qRL1⁃2），分别位于1号染色体上的64 cM处和546 cM处，LOD值分别为2.67和2.78，表型贡献率分别为6.03%和3.95%（图7，表6）。

3　讨 论

3.1　冷浸发芽法在耐低温QTL定位中的适用性

玉米耐低温萌发能力属于数量性状，遗传机制复杂，并且受环境因素影响较大，需要稳定可靠的表型鉴定方法。目前采用的研究方法主要分为田间鉴定法和室内鉴定法^［16］。虽然田间试验可以真实模拟早春的低温环境，但田间各种环境因素波动较大，对研究结果有一定影响，所以目前多采用人工气候培养箱进行室内鉴定^［17］。已有研究利用不同方法鉴定玉米耐低温萌发能力，如Yan等^［18］将温度设置在5.5 ℃到6.5 ℃之间，对338份材料组成的定位群体进行7天的低温处理，共检测到32个SNP位点和7个QTL区间；Han等^［19］利用176个IBM Syn10群体的种子在10 ℃的条件下处理21 d，通过全基因组关联分析和转录组测序的方法共检测到7个QTL。

冷浸发芽法利用低温水浴处理种子来模拟种子吸胀时期遭受低温胁迫，近年来被用于种子耐低温萌发能力检测。高婷婷^［20］等在不同冷浸温度下对种子发芽率进行了测定，发现4 ℃条件下的测量值标准差和变异系数均显著高于其他温度条件，该温度下种子活力差异最为明显。本实验室前期对不同品种的冷浸发芽率与田间出苗率进行相关性分析，发现该方法的预测准确度最高，并颁布了农业农村部行业标准^［14］。本研究利用该方法，在F₄群体中成功检测到与低温萌发率和幼苗健壮度有关的14个QTL位点，进一步说明该方法是进行耐低温萌发QTL定位的有效方法。

3.2　新定位QTL的遗传价值及候选基因分析

本研究共定位到14个耐低温萌发性状相关QTL位点，与已发表的低温萌发相关的QTL位点进行比较，发现2个与前人的研究结果重叠。本试验定位到的qGP6⁃1与qGP6⁃2在6号染色体上的物理位置相邻，位于118.3~125.5 Mb之间。Allam等^［21］在该区段的121.8 Mb处检测到了1个与低温环境下穗位高相关的SNP位点；贺韵涵^［22］利用247份玉米骨干自交系也在此次区间内检测到了1个与低温胁迫发芽指数相关的SNP位点，位于119.6 Mb，说明这个区域可能是调控玉米低温响应的热点区域，值得深入解析。此外，本研究定位9个的QTL位点与前人的研究结果位置接近。如qGP1⁃3定位于1号染色体254.5~255.2 Mb之间，Revilla等^［23］利用1 928个DH系检测到了1个与叶绿素荧光参数相关的QTL位点（245.3~253.6 Mb）；qGP1⁃2定位于1号染色体114.8~116.0 Mb之间，董潇潇等^［24］利用527 份玉米关联群体自交系在1号染色体117.6~117.8 Mb曾检测到5个与苗期耐冷性状显著相关的SNP，与该QTL位点相近；qGP2⁃1定位于2号染色体33.2~35.0 Mb之间，Yi等^［25］在2号染色体32.7 Mb处曾检测到2个与低温条件下发芽天数相关的SNP位点，与该QTL位点相近。

本研究定位到的贡献率高于5%的QTL位点共5个，其中4个位点的物理区间小于2 Mb（表6）。qSL2⁃1位点的表型贡献率最高，为8.27%，其基因组位置位于2号染色体217 215 707-217 302 341，该区间内包含9个蛋白编码基因，其中Zm00001d007153是拟南芥AtHIGD2和水稻OsHIGD2的同源基因，编码定位于线粒体的缺氧响应蛋白，在水稻和拟南芥中被报道与电子传递链复合物细胞色素氧化酶的组装密切相关^{［26， 27］}。线粒体功能与能量代谢在种子萌发及逆境响应中起核心作用^［28］，该基因可能是连接低温胁迫与能量代谢从而影响幼苗生长的关键节点。qGP4⁃1位定位于4号染色体499 450 32-513 251 84区域，表型贡献率7.55%，该区间大小1.38 Mb，包含12个蛋白编码基因。该区间内的Zm00001d049926编码依赖铁离子的2-氧代戊二酸双加氧酶，是拟南芥AtGIM2的同源基因，在拟南芥中AtGIM2蛋白可催化赤霉素GA12发生水合反应生成脱氢GA12，在种子萌发、光形态建成及幼苗发育过程中负调控脱落酸（ABA）敏感性，突变后导致ABA超敏，种子萌发率降低，子叶发育受阻^［29-30］。ABA是调控种子萌发和逆境胁迫的最主要激素^［31］，暗示该基因可能通过激素途径调控玉米种子在低温下萌发。此外，低温萌发率相关的QTL位点qGP2⁃1候选区间内的Zm00001d003186的拟南芥同源基因也曾被报道参与种子萌发过程^［32］，qGP2⁃2区间内的Zm00001d007936的拟南芥同源基因曾被报道参与植物逆境胁迫响应^［33］。这些基于同源性和功能注释筛选出的候选基因，为后续的图位克隆与功能验证提供了明确靶标。

本研究证实冷浸发芽法是挖掘耐低温萌发QTL的有效手段，而利用‘C181’这类具有地方适应特色的种质，能够发掘新的、有育种价值的遗传变异。本研究结果为深入解析玉米耐低温萌发的分子机制提供了新的遗传位点，也为利用分子标记辅助选择技术改良玉米萌发期耐冷性奠定了基础。

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基金资助

国家重点研发计划(2023YFD1200502)

国家自然科学基金项目(32201843)

国家自然科学基金项目(32372161)

国家玉米产业技术体系项目(CARS-02-13)