垂穗披碱草近壳多胞叶斑病快速检测技术的建立与应用

Establishment and application of molecular detection for Parastagonospora nodorum-induced leaf spot disease in Elymus nutans

摘要

为建立一种由颖枯近壳多胞病菌（Parastagonospora nodorum）引发垂穗披碱草（Elymus nutans）叶斑病的快速检测体系，利用病原菌的RPB2（RNA polymerase Ⅱ subunit 2）保守序列设计了具有高度特异性的引物Pr-F/Pr-R，建立了一种高效、快速、稳定的PCR检测垂穗披碱草近壳多胞叶斑病的分子检测技术。结果表明：1）检测体系可以特异地从颖枯近壳多胞菌中扩增出一条127 bp的条带，Pr-F/Pr-R对颖枯近壳多胞菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/μL。2）引物Pr-F/Pr-R可对发病垂穗披碱草叶片组织中颖枯近壳多胞病菌进行特异性检测，还可用于对田间疑似带病垂穗披碱草植株的快速检测。本研究结果为垂穗披碱草叶斑病的早期发现和针对性防治提供了技术支持。

Abstract

To establish a rapid detection system for leaf spot disease of Elymus nutans caused by Parastagonospora nodorum， highly specific primers Pr-F/Pr-R targeting the conserved RPB2 （RNA polymerase Ⅱ subunit 2） gene sequence of the pathogen was designed. An efficient， rapid， and stable PCR molecular detection technique was developed to identify Parastagonospora leaf spot in E. nutans. The results indicated： 1） The detection system specifically amplified a 127 bp band from P. nodorum， and the sensitivity of Pr-F/Pr-R for detecting genomic DNA of P. nodorum was 100 pg/μL. 2） The Pr-F/Pr-R primers can specifically detect P. nodorum in infected E. nutans leaf tissues， as well as in suspected diseased field-collected E. nutans plants. These results provide a technical basis for the early detection and targeted control of leaf spot disease in E. nutans.

Graphical abstract

关键词

垂穗披碱草 / 颖枯近壳多胞菌 / 叶斑病 / 分子检测

Key words

Elymus nutans / Parastagonospora nodorum / leaf spot disease / molecular detection

垂穗披碱草（Elymus nutans）植物作为青藏高原高寒草地的主要草种和优势牧草，在我国高寒地区广泛分布，具有重要的生态利用和经济开发价值^［1］。然而，病害是限制披碱草品质和产量的重要因素之一^［2］，由近壳多胞菌属（Parastagonospora sp.）引起的禾本科叶斑病普遍发生^［3-6］，其中包括颖枯近壳多胞菌（Parastagonospora nodorum）。颖枯近壳多胞菌对垂穗披碱草有较强的致病性^［5］，该病原菌在全球主要小麦产区（如中国、美国和北欧等）广泛分布^［7-8］，还可侵染多种谷物及野生禾草^［9-10］。它作为一种死体营养型病原真菌，通过产生坏死性效应子（NEs）和相关酶来诱导寄主叶片组织形成叶斑病病斑^［6，11］。寄主组织坏死后，病原菌仍可长期存活，使病原体持续增殖，造成病害循环^［12］。因此，如何及时有效、快速准确地对感染近壳多胞叶斑病的垂穗披碱草进行诊断和鉴定，对牧草叶斑病的防治至关重要。目前还未有颖枯近壳多胞菌分子检测等方面的研究。

传统鉴定依赖病原分离培养、形态学观察及多基因（如ITS/SSU/TEF）联合分析等方法鉴定出颖枯近壳多胞菌^［9，13］，过程耗时费力且难以满足快速检测的需求。近年来迅速发展的分子技术显著提升了鉴定效率，PCR技术是植物病原体分子诊断的基础，包括常规PCR、多重PCR（Multiplex PCR）、巢式PCR（Nested PCR）、实时荧光定量qPCR（Quantitative real-time PCR）等技术^［14］，可根据试验需求选择不同类型的PCR技术。如采用多重PCR技术以tub2基因作为靶区，建立一种可以定量检测小麦4种真菌病原体的方法，可以同时扩增不同大小的PCR产物，检测多个基因或病原体^［15］。而巢式PCR主要用于鉴定病症不明显或隐症病害，需要2套引物和2轮PCR对靶向DNA进行扩增，具有较高的灵敏度和特异性，但过程较为繁琐，耗时耗材，并且分2次进行扩增，期间容易产生污染，造成假阳性^［16］。随着分子生物学发展，牧草病害的诊断和鉴定方法从传统耗时费力的形态学鉴定方法发展到快速分子诊断水平。其中，内转录间隔区（ITS）序列、RPB2序列（DNA-directed RNA polymerase Ⅱ subunit 2）、β-微管蛋白基因（β‑tubulin，tub2）等被广泛应用于病原菌的分子鉴定中。研究表明，在同一植物个体中ITS的变异程度高，可能影响分子鉴定的准确性^［17］。本研究前期在进行披碱草叶斑病病原鉴定时发现，颖枯近壳多胞菌与同样危害披碱草^［18］的亚隔孢壳属（Didymella）、细小球壳属（Leptosphaerulina sp.）、新壳二孢属（Neoascochyta sp.）的ITS序列相似性较高，较难通过ITS序列将其区分开，因此有必要选择其他的基因片段进行该病菌的检测。在真菌系统学研究中，RPB2基因片段常用于分子鉴定和系统发育分析。因RPB2覆盖度高、扩增结果更稳定且在个体内的变异程度较低的特点，使其在对近壳多胞菌属的鉴定检测中更具优势^{［17，19］}。有学者利用病原菌（如小麦矮腥黑粉菌^［20］和长枝木霉^［21］）的RPB2基因片段设计特异性引物，通过PCR检测方法建立快速检测体系，可提高病原菌检测的准确性。此外，谢晓梅^［22］利用子囊菌类盘菌属RPB2序列设计了特异性引物，并进行了引物特异性验证、适用性和灵敏度分析，检出浓度低至1 fg/μL，建立了一种准确、快速和低成本的毒蘑菇物种检测方法。目前有关披碱草叶斑病病原菌的分子快速鉴定方法的研究较少，且利用RPB2建立颖枯近壳多胞病菌检测方法的研究并不多见。

本研究在颖枯近壳多胞病菌新的分类进展基础上，拟以垂穗披碱草叶斑病作为研究对象，采用RPB2序列对比分析方法，通过寻找新的分子靶标RPB2特殊序列实现对颖枯近壳多胞菌的特异性检测，最终建立准确和快速的分子检测技术，为垂穗披碱草叶斑病的早期鉴定和针对性防治提供技术支持；同时，基于RPB2序列建立的检测体系为发掘其他病原菌检测新靶标提供新思路。

1　材料与方法

1.1　试验材料

供试菌株见表1。所有菌株均为本课题组从甘肃、青海、四川、贵州和云南等天然草地和人工草地中分离鉴定所得，目前保存于草地微生物菌种保藏库（Grassland microbiome culture collection，GMCC）。其中包含7种在披碱草上分离鉴定所得的亚隔孢壳科病原菌^［23］，14种在天然草原植物上分离出的常见病原菌。

1.2　病原菌DNA及发病垂穗披碱草组织DNA提取

供试菌株在PDA平板上生长4~7 d后，小心刮取病原菌菌丝，采用E.Z.N.A.^® Fungal DNA Mini Kit（OMEGA真菌基因组DNA提取试剂盒）进行病原菌DNA的提取。提取完成后测定其浓度与纯度，放置-20 ℃保存备用。

收集由颖枯近壳多胞菌引起的垂穗披碱草叶斑病发病组织，消毒叶片表面后置于液氮预冷的研钵中；研磨成粉状后，采用E.Z.N.A.^® Plant DNA Kit（OMEGA植物组织基因组DNA提取试剂盒）提取植物发病组织的DNA。用同样的方法提取健康垂穗披碱草植株组织DNA作为健康对照组，以接种亚隔孢壳属、异壳二孢属、小光壳属（Leptosphaerulina miscanthi）、拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）、壳多胞属（Stagonospora bicolor）、根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）、交链格孢属（Alternaria alternata）和癣囊腔菌（Plectosphaerella cucumerina）引起的垂穗披碱草叶斑病作为负对照组。

1.3　颖枯近壳多胞菌特异性引物设计及PCR扩增

根据GenBank中登录的颖枯近壳多胞病菌一段RPB2基因保守序列（RPB2：PQ675422），使用软件SnapGene设计颖枯近壳多胞菌的特异性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Pr-F：5'-CAATTCGCATTGGGGTCTTGTTTG-3'，Pr-R：5'-GAAGTCGATGATTGGAGTAGCG-3'。

PCR反应体系总体积为25 μL：12.5 μL 2×High Fidelity PCR Master Mix，引物Pr-F/Pr-R（10 μmol/L）各1 μL，1 μL模板DNA，加入ddH₂O补足到25 μL。将反应体系混匀后置于普通PCR仪中进行扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸5 min。将扩增产物于1.0%琼脂凝胶中电泳，进行引物特异性验证，在凝胶成像仪中检测拍照。

1.4　PCR扩增灵敏度检测

将颖枯近壳多胞菌DNA浓度从100 ng/μL依次稀释到50 ng/μL、25 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、50 pg/μL和1 pg/μL，共9个稀释度。依照方法“1.3”所述的反应体系与程序，将DNA原液及稀释液作为模板进行PCR反应，检测颖枯近壳多胞菌PCR反应的灵敏度，试验重复3次。

1.5　发病植株组织的快速检测

以接种颖枯近壳多胞菌的发病垂穗披碱草叶片、接种表1中常见病原菌的发病叶片和健康叶片组织中提取的基因组DNA为模板进行常规PCR反应，反应体系和程序如1.3所述。最终产物经1.0%琼脂凝胶电泳后成像检测，试验重复3次。

2　结果与分析

2.1　特异性验证检测

特异性验证结果表明（图1），本研究建立的颖枯近壳多胞菌PCR检测方法具有高度特异性，只有颖枯近壳多胞病菌DNA模板的反应中出现片段大小为127 bp的特异性条带，而其他21种病菌及ddH₂O均无扩增条带。表明该引物是颖枯近壳多胞菌特异性引物，可用于颖枯近壳多胞菌的分子鉴定及分子检测。

2.2　Pr-F/Pr-R对颖枯近壳多胞菌灵敏度检测

颖枯近壳多胞菌PCR灵敏度检测的结果显示，当DNA的模板浓度在100 ng/μL、50 ng/μL、25 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL及100 pg/μL时，PCR均能扩增出条带；而DNA模板浓度为50 pg/μL和1 pg/μL时无条带（图2），说明Pr-F/Pr-R对颖枯近壳多胞菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/μL。

2.3　发病植物组织的快速检测

对接种颖枯近壳多胞菌后发病的垂穗披碱草叶片组织的基因组DNA进行常规PCR扩增（图3），该样品能扩增出127 bp的特异性条带，而接种亚隔孢壳属、异壳二孢属、小光壳属、拟盘多毛孢属、壳多胞属、根腐离蠕孢菌、交链格孢属和癣囊腔菌引起的垂穗披碱草叶斑病及健康垂穗披碱草叶片基因组DNA均不能扩增出条带，说明Pr-F/Pr-R能对颖枯近壳多胞菌P. nodorum引起的病害进行快速分子检测。

3　讨 论

在建立颖枯近壳多胞病菌的检测方法中，Iori等^［24］基于高光谱成像分析和qPCR验证，建立了一种用于早期检测颖枯近壳多胞病菌的方法，这种快速且无创的技术可以在接种病原菌仅48 h后区分健康和病变组织的光谱。Oliver等^［25］使用基于SYBR Green的qPCR测定方法对感病植物叶片的颖枯近壳多胞菌进行定量。qPCR的绝对定量精度较高，但设备成本显著增加。在继承常规PCR简易性与可靠性的前提下，本研究通过靶向RPB2基因保守域的单次扩增，克服了巢式PCR的高污染风险与多重PCR的优化复杂性，并且降低了耗材和设备成本。本研究成功从发病的垂穗披碱草叶片组织中直接检测到病原菌，颖枯近壳多胞菌生长缓慢，该体系大大缩短检测周期，简化操作流程，便于处理大量样本。RPB2是单拷贝蛋白编码基因，具高覆盖度，且有足够的变异用于系统发育和物种类别分析^［19］，更适合种属水平上的区分，能够避免ITS的多拷贝问题或IGS区可能存在的重复序列变异问题。在本检测体系建立过程中，设计特异性引物需要注意引物长度、GC含量、退火温度、靶序列保守性和引物序列的二级结构、PCR体系中的循环周期等因素，以确保PCR反应高效、准确地进行^［26］。特异性的缺乏通常可以通过调整退火温度或引物的初始浓度来改善^［27］。PCR扩增完成后使用凝胶成像系统进行验证时，主要看PCR扩增产物是否与预期PCR产物（以靶序列为模板设计引物）大小一致，以及特异性条带是否明显，是否有发夹结构和引物二聚体^［28］。本研究建立的技术成功检测到回接样品中的颖枯近壳多胞病菌，特异性条带明亮清晰，未形成发夹结构和引物二聚体条带，与靶序列大小相当，说明扩增产物质量高；而对于天然草原植物上分离出的常见病原菌以及回接到垂穗披碱草植株上的非颖枯近壳多胞叶斑病原菌无条带或无特异性条带，说明Pr-F/Pr-R引物对垂穗披碱草近壳多胞叶斑病具有高度特异性。本研究填补了颖枯近壳多胞病菌鉴定没有特异性检测方法的空缺，首次将RPB2序列分析应用于颖枯近壳多胞病菌的快速鉴定中，为近壳多胞叶斑病的鉴定开拓了途径，同时，基于RPB2序列建立的检测体系对于发掘其他病原菌检测新靶标提供新思路。

感染禾草的近壳多胞菌属种类繁多，本研究聚焦于颖枯近壳多胞菌的快速检测鉴定，引物Pr-F/Pr-R对青藏高原高寒草地常见病原菌（如Didymella boeremae、Neoascochyta cylindrispora、Bipolaris sorokiniana等）均无交叉反应，证实该引物的高度特异性。李金庆等^［4］设计特异性引物进行麦类壳多胞斑点病菌（P.pseudonodorum）的检测，对照组选用6种进境大麦中经常截获的病菌，与本试验对照组设置思路一致，均未对靶向病原菌的近缘种或同属不同种进行特异检测。未来可进一步验证该体系是否适用于颖枯近壳多胞病菌近缘种的快速检测。此外，颖枯近壳多胞病菌可侵染多类寄主，但本研究仅验证了该体系可直接检测侵染垂穗披碱草引起的叶斑病植物组织，该检测体系是否普适于小麦、大麦等其他重要经济禾谷类作物上的颖枯近壳多胞菌检测，是下一步需要验证的重点。

4　结 论

本研究利用颖枯近壳多胞病菌RPB2保守序列设计了具有高度特异性的引物Pr-F/Pr-R，建立了一种高效、快速、稳定的PCR检测近壳多胞叶斑病的分子技术，Pr-F/Pr-R对颖枯近壳多胞菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/μL。该技术成功检测到回接样品中的颖枯近壳多胞病菌，而对于天然草原植物上分离出的常见病原菌无条带或无特异性条带。本研究将RPB2序列分析应用于颖枯近壳多胞病菌的鉴定中，为近壳多胞叶斑病的鉴定开拓了途径，为田间快速诊断、大规模样本筛查提供了新的可能。同时，基于RPB2序列建立的检测体系对于发掘其他病原菌检测新靶标提供新思路。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2022YFD1401101)

“双一流”建设经费-队伍建设经费-科研启动经费项目(561120201)

国家农业产业技术体系项目(CARS-34)