蒙古冰草MADS-box基因家族鉴定及其对干旱胁迫的响应

Identification of MADS-box gene family in Agropyron mongolicum Keng and its response to drought stress

摘要

为挖掘蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）中与干旱胁迫响应相关的AmMADSs，以25%（0.0417 mol/L）PEG 6 000模拟干旱胁迫处理得到的蒙古冰草转录组测序数据Unigenes为对象，筛选出12个MADS-box家族基因，利用生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、系统进化树及蛋白质二、三级结构进行分析，并结合qRT-PCR技术检测其在25%（0.041 7 mol/L）PEG 6 000处理0（对照，CK）、1.0、3.0、5.0、7.0 d和复水1.0 d后的MADS-box家族基因的表达模式。结果表明：筛选出的12个蒙古冰草MADS-box转录因子，蛋白质分子量在7 263.38~31 349.53 u，编码的氨基酸长度为65~273个，蛋白质理论等电点（pI）在5.43~11.16，其中3个MADS-box转录因子属于酸性蛋白、9个MADS-box转录因子属于碱性蛋白；12个蒙古冰草MADS-box基因编码蛋白质均定位于细胞核，不含有跨膜结构域，存在大量的磷酸化位点，蛋白质二、三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。系统进化树分析发现，蒙古冰草AmMADS26-1、AmMADS26-2、AmMADS29-2、AmMADS47和AmMADS55基因与水稻已知具有抗旱功能的MADS-box家族蛋白的同源关系较近。qRT-PCR结果表明，在模拟干旱处理（25% PEG 6 000）后，AmMADS26-1、AmMADS26-2、AmMADS29-2和AmMADS47在干旱处理1.0 d后的表达水平较0 d（CK）增加1.55~4.55倍，其中AmMADS26-1和AmMADS47的表达模式在干旱处理第1—7天虽呈下调趋势，但其表达水平均高于CK的表达水平；而AmMADS55在干旱处理3.0和5.0 d后的表达水平分别比CK高 1.57和2.28倍。综上，基于对蒙古冰草MADS-box家族基因的生物信息学分析及表达模式鉴定，筛选得到5个响应干旱胁迫的关键基因，分别是AmMADS26-1、AmMADS26-2、AmMADS29-2、AmMADS47和AmMADS55。

Abstract

To identify drought-related AmMADSs in Agropyron mongolicum Keng， the unigenes obtained from transcriptome sequencing of A. mongolicum under 25% （0.041 7 mol/L） PEG 6 000-simulated drought stress was used as the research object. A total of twelve MADS-box family genes were screened. Bioinformatics methods were used to analyze their physicochemical properties， subcellular localization， conserved motifs， phylogenetic tree， and protein secondary and tertiary structures. Additionally， qRT-PCR technology was employed to examine the expression patterns of MADS-box family genes at 0（CK），1.0， 3.0， 5.0， 7.0 d after 25% （0.0417 mol/L） PEG 6 000 treatment and 1.0 d after rehydration. The results show that： The protein molecular weights of the twelve selected MADS-box transcription factors from A. mongolicum ranges from 7 263.38 to 31 349.53 u， and the length of encoded amino acids ranges from 65 to 273. The theoretical isoelectric points （pI） of the proteins ranges from 5.43 to 11.16. Among which， three MADS-box transcription factors are acidic proteins and nine are basic proteins. The proteins encoded by all twelve A. mongolicum MADS-box genes are localized in the nucleus. They lack transmembrane domains， and contain numerous phosphorylation sites， and their secondary and tertiary structures are primarily composed of random coils and α-helices. Phylogenetic analysis revealed that the A. mongolicum genes， AmMADS26-1， AmMADS26-2， AmMADS29-2， AmMADS47， and AmMADS55 are closely related to known drought-resistant MADS-box family proteins in rice. qRT-PCR results showed that after simulated drought treatment （25% PEG 6，000）， the expression levels of AmMADS26-1， AmMADS26-2， AmMADS29-2， and AmMADS47 increased by 1.55 to 4.55 times at 1.0 d of drought treatment compared to the CK. Among them， the expression patterns of AmMADS26-1 and AmMADS47 showed a downward trend from day 1 to 7 under drought treatment， but their expression levels were still higher than those of CK. In contrast， the expression level of AmMADS55 was 1.57 and 2.28 times higher than that of CK after 3.0 and 5.0 d of drought treatment respectively. In summary， based on bioinformatics analysis and expression pattern identification of the MADS-box gene family in A. mongolicum， this study identified five key genes responsive to drought stress， namely AmMADS26-1， AmMADS26-2， AmMADS29-2， AmMADS47， and AmMADS55.

Graphical abstract

关键词

蒙古冰草 / MADS-box / 生物信息学分析 / 干旱胁迫

Key words

Agropyron mongolicum Keng / MADS-box / bioinformatics analysis / drought stress

蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）又名沙芦草，是多年生二倍体禾本科牧草，其茎叶质地柔软、营养价值高，蛋白质含量可达干重的18.64%^［1-2］。此外，蒙古冰草还具有抗寒、抗旱、抗病虫害、耐盐碱等优良特点，其根系发达，分蘖能力强，具有重要的饲用价值、生态价值和育种价值^［3-4］。当前，气候变化对农业生态系统造成深远影响，干旱则是影响植物生长发育最重要的胁迫之一，会影响植物的渗透势，破坏细胞膜，严重影响农作物的产量^［5-6］。据不完全统计，我国干旱半干旱土地占全国土地面积的近1/2^［7］，占耕地面积的51%^［8］，培育耐旱作物是利用干旱、半干旱土地的有效方法之一^［9］。因此，鉴定蒙古冰草耐旱性相关基因并阐明其调控机制，对于培育优质牧草和禾本科作物种质具有重要意义。

近年来，随着分子生物学技术在牧草育种中的深入研究，许多国内外学者在蒙古冰草挖掘抗逆相关基因方面已取得了一系列进展^［10］。吴婧^［11］研究发现，过表达AmNAC102‑2基因可使蒙古冰草的根系更加茂密，从而提高植株的抗旱性。在拟南芥中过表达AmCOMT1基因会通过调控木质素的合成途径来增强植株的抗旱性^［12］。赵彦等^［13］研究发现，从蒙古冰草中分离鉴定的MwMYB4基因，其表达量受干旱胁迫的强烈诱导。同样从蒙古冰草中分离得到的肌动蛋白基因MwACT2，具有高度的保守性，在非生物逆境胁迫下能够稳定表达^［14］；除此之外，过表达AmGDSL1和AmbHLH148的转基因烟草植株的抗旱性优于野生型^［15-16］。综上，充分发挥蒙古冰草抗旱基因资源优势，可以为提高牧草和其他禾本科作物的耐旱性提供宝贵的遗传材料。

MADS-box是一类古老且庞大的基因家族，广泛存在于植物、动物和真菌中^［17］。MADS-box基因家族被分为I型和II型2个谱系^［18-19］。植物中I型主要分为SPF-like、ARG80-like和M型3类^［19］，通常含有1~2个外显子，包含1个由56~58个氨基酸组成的保守MADS结构域（MEF2-like MADS-domain）和1个不保守的C端结构域（C-domain），且根据M区可分为Mα、Mβ、Mγ和Mδ 4个亚群，主要参与植物生殖器官发育进程^［20］；II型一般含有6个外显子和7个内含子，分为MEF2和MIKC型。MEF2型基因主要存在于真菌和动物中，而MIKC型基因为植物特有。MIKC型基因又分为MIKCC和MIKC*型，它们由MADS结构（MADS superfamily）、I区（intervening）、K区（keratin-like）和C端结构域（C-terminal）4部分组成^［21-22］。高度保守的MADS-box结构域可以结合特异DNA序列，也可识别靶基因的CArG-box基序，在蛋白质二聚体和转录因子结合中发挥作用^［22-23］。相对保守的I区和K区结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合体的形成^［24］。可变的C末端结构域在转录激活以及在三级和四级蛋白质复合体的形成中发挥作用^［24-25］。

MADS-box家族基因在植物生长发育的各个方面都起到了关键作用，比如根和叶的生长^［19］、花分生组织的发育^［26］、果实成熟^［27］以及对植物非生物逆境胁迫的调控^［28］。在干旱胁迫响应方面，过表达OsMADS23的转基因水稻会通过激活ABA和脯氨酸的生物合成，增强对干旱和盐的抗性，而基因敲除则大幅降低水稻这些特性^［29］；甘露醇诱导的OsMADS25基因可能参与水稻干旱胁迫响应^［30］；OsMADS26被鉴定为水稻生物与非生物逆境胁迫响应的负调控因子^［31］。水稻中MADS-box转录因子（OsMADS18、22、26和27）在响应干旱胁迫时，基因的表达水平较CK上调2倍，3个水稻MADS-box转录因子（OsMADS2、30和55）在干旱处理后，基因的表达水平较CK下调2倍多^［32］。在水稻中过表达AmMADS47基因会通过影响苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代谢和光合作用天线蛋白中关键酶的合成显著减弱植株的抗旱性^［33］。在拟南芥中过表达AGL16导致ABA含量显著升高、叶片的气孔密度降低，负调控植株对干旱胁迫的响应^［34］。在番茄中过表达SlMBP9会显著降低IAA的合成和极性运输，对侧根的发育产生负面影响^［35］；过表达SlMBP22基因会显著提高植株的耐旱性，与干旱胁迫后的野生型相比，过表达植株的根系更加发达，且淀粉和可溶性糖的含量显著增加^［36］。异源过表达文冠果XsAGL22基因会显著增加杨树中ABA的含量，导致气孔开度变小，从而显著提高植株的耐旱性^［37］。目前，关于蒙古冰草MADS-box基因功能的研究鲜见报道。本研究基于蒙古冰草转录组测序数据，对含有MADS-box序列特征的基因进行筛选，通过生物信息学方法对筛选到的12个具有完整保守结构域的MADS-box家族基因的理化性质、保守基序、同源性，及在干旱处理下的基因表达模式进行分析，旨在筛选出与干旱相关的AmMADSs，以期为培育优质抗旱牧草和禾本科作物种质提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料及处理

供试蒙古冰草种子采自于内蒙古农业大学牧草试验站种质资源圃（40.81° N， 111.72° E，海拔1 063 m）。挑选颗粒饱满的种子去除内外稃皮，清水冲洗3.0 h后置于超净工作台中进行消毒。将消毒好的种子置于铺有浸湿滤纸的培养皿中，黑暗条件下培养2.0 d，之后移入水培盒中于BIC-300培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）中生长，温度设为24±1 ℃、光/暗周期设为16/8 h。每周更换1次培养液（1/5 Hoagland’s营养液），待幼苗生长至三叶一心时，挑选生长状况一致的蒙古冰草作为试验材料。用含有25%（0.0417 mol/L）PEG 6 000的1/5 Hoagland’s营养液进行模拟干旱处理，分别在持续胁迫处理0（对照，CK）、1.0、3.0、5.0、7.0 d以及复水1.0 d后进行取样（叶片），每个处理设置3次生物学重复，样品采集后立即液氮速冻，于-80 ℃保存备用。

1.2　试验方法

1.2.1　蒙古冰草MADS-box基因鉴定及序列分析

基于已经报道的蒙古冰草转录组测序数据^［38］，在swissprot中以“MADS-box”为关键词进行筛选，初步获得蒙古冰草MADS-box转录因子候选基因，用PlantTFDB在线软件（http：//planttfdb.gao-lab.org）和NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）对上述蒙古冰草转录组测序数据Unigenes找出的30个MADS-box转录因子进行结构域预测，剔除不包含MADS-MEF2-like和MADS Superfamily结构域的序列，并根据基因是否含有K（K-box）结构域，将得到的MADS-box基因分为I型和II型2种类型^［19］，共获得12个具有完整MADS-box结构域的基因，用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行相似度对比。再利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对12个蒙古冰草MADS-box氨基酸序列的蛋白质相对分子质量、等电点、不稳定系数等理化性质进行分析。利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白的亲/疏水性。

1.2.2　蒙古冰草MADS-box基因的亚细胞定位和跨膜结构分析

利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）和TMHMMSever 2.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）对12个蒙古冰草MADS-box转录因子进行亚细胞定位和跨膜区域预测。

1.2.3　蒙古冰草MADS-box基因的基序分析

对筛选出的12个蒙古冰草MADS-box转录因子通过DNAMAN 8.0软件进行多序列对比。利用MEME在线软件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）预测蒙古冰草MADS-box蛋白的保守基序（Motif），设置基序参数为5个，其余参数设置为默认值。通过Weblogo 3.0在线网站（https：//weblogo.threeplusone.com/）对保守结构域各个氨基酸位点的保守性进行分析，并利用TBtools软件对系统进化树、motif和保守结构域进行数据可视化处理。

1.2.4　蒙古冰草MADS-box家族的磷酸化位点分析

利用NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）对筛选出的12个蒙古冰草MADS-box蛋白序列进行磷酸化位点分析。

1.2.5　蒙古冰草MADS-box家族二、三级结构预测

利用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）对蒙古冰草12个MADS-box蛋白质进行二级结构分析；之后利用ExPaSy的SWISS-MODE（https：//swissmodel.expasy.org/）构建该家族12个蛋白的三级结构模型。

1.2.6　蒙古冰草MADS-box家族进化树构建

从国家水稻数据中心（https：//www.ricedata.cn/gene/）以及NBCI（National Center for Biotechnology Information （nih.gov））数据库筛选并下载已知具有抗旱功能的11个水稻和6个拟南芥的MADS-box转录因子序列，利用MEGA X软件对12个蒙古冰草MADS-box蛋白与17个水稻和拟南芥的MADS-box蛋白构建系统进化树。最大似然法（maximum likelihood method），1 000次Bootstrap测试，其他参数设置均为默认值。之后用ITOL（https：//itol.embl.de/）对进化树进行美化。

1.2.7　抗旱相关蒙古冰草MADS-box的qRT-PCR分析

用SnapGene 7.0.2软件对筛选出的蒙古冰草抗旱相关的AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS55基因进行特异性引物设计，以18S rRNA作为内参基因（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列合成。用Trizol法提取蒙古冰草干旱处理0（CK）、1.0、3.0、5.0、7.0 d及复水1.0 d后的总RNA，用FastKing RT kit（with gDNase）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）反转录为cDNA，之后用MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行qRT-PCR试验，每个处理采用3个独立的生物学重复，3次技术重复。反应体系为MonAmp SYBR Green qPCR Mix试剂10 μL，cDNA模板1.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH₂O 7.7 μL。反应程序为预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，循环数为45次。

用2^-△△CT法^［39］计算蒙古冰草抗旱相关5个基因的相对表达量，用SPSS 26.0软件进行数据处理与显著性分析，用Origin 2024软件进行绘图。

2　结果与分析

2.1　蒙古冰草MADS-box基因的筛选及理化性质分析

从蒙古冰草转录组测序数据组装的41 793个Unigenes中，筛选并获得12个具有完整保守结构域的MADS-box序列，其中AmMADS51、AmMADS55和AmAGL62基因属于Ⅰ型，其余9个蒙古冰草MADS-box基因均属于II型（表2）。通过Blast比对发现蒙古冰草12个MADS-box基因编码的氨基酸与其他已知物种的MADS-box基因序列相似度在87.16%（AmMADS56）~96.83%（AmMADS18），其中AmMADS18、AmAGL62与野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）亲缘关系最近，相似度为91.95%~96.83%；AmMADS26‑2、AmMADS56与乌拉尔图小麦（Triticum urartua）亲缘关系最近，相似度为87.16%~96.22%；其余8个MADS-box家族基因均与小麦（Triticum aestinum）亲缘关系最近，相似度在89.81%~96.22%。筛选出的12个蒙古冰草MADS-box转录因子基因编码的氨基酸长度为65（AmMADS55）~273（AmMADS15）个，平均为143个氨基酸。12个MADS-box的蛋白质pI也有差异，pI在5.43（AmMADS29‑1）~11.16（AmAGL62），其中3个MADS-box基因的pI<7.0，属于酸性蛋白；9个MADS-box基因的pI>7.0，属于碱性蛋白。MADS-box家族的蛋白质分子量也具有差异，蛋白质分子量在7 263.38（AmMADS55）~31 349.53 u（AmMADS15）。12个MADS-box家族蛋白的不稳定系数在37.21（AmMADS26‑1）~65.76（AmMADS55），其中稳定蛋白1个（不稳定系数<40），不稳定蛋白11个（不稳定系数>40）；脂肪族指数范围在60.23（AmAGL62）~93.21（AmMADS26‑1）。MADS-box蛋白总平均疏水指数（GRAVY）为-0.897（AmMADS15）~-0.188（AmMADS55），其中亲水蛋白6个（GRAVY<-0.5）、占比50.0%，两性蛋白6个（-0.5<GRAVY<0.5）、占比50.0%。

2.2　蒙古冰草MADS-box蛋白的亚细胞定位及跨膜结构分析

对筛选出的12个蒙古冰草MADS-box蛋白进行亚细胞定位预测发现，12个蛋白均只存在于细胞核中（表2）。再对蒙古冰草MADS-box进行跨膜结构预测结果显示，该家族跨膜螺旋氨基酸残基数的期望值均<18，表明无跨膜螺旋或者无跨膜信号肽存在（表2）。因此，12个MADS-box转录因子均在细胞核中行使功能。

2.3　蒙古冰草MADS-box的基因保守基序分析

对蒙古冰草12个MADS-box家族基因进行序列比对发现，蒙古冰草Ⅰ型MADS-box基因AmAGL62、AmMADS51和AmMADS55的氨基酸序列的相似度为62.30%；Ⅱ型MADS-box基因AmMADS1、AmMADS15、AmMADS18、AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑1、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS56的氨基酸序列的相似度为67.96%（图1）。

通过WebLogo获得的蒙古冰草MADS-box结构序列标签，位于N端的MADS superfamily和MADS-MEF2-like结构域分别由31和33个氨基酸组成，2个MADS结构域存在高度保守的Leu 20、Leu 28、Leu 1、Leu 10、Leu 17和Leu 21氨基酸位点，且K-box结构域由15个氨基酸组成，其中氨基酸位点Leu 48和Leu 52均高度保守（图2）。

蒙古冰草MADS-box蛋白家族具有4种保守的motif，分别为motif 1、motif 2、motif 3、motif 4（图3），长度为23~50个氨基酸。通过TBtools软件对系统进化树、motif和保守结构域进行可视化，发现蒙古冰草MADS-box转录因子家族有3种保守结构域，分别是MADS-MEF2-like、MADS superfamily和K结构域，其中有10个基因含有MADS-MEF2-like（motif 1和motif 3）结构域，有2个基因含有MADS superfamily（motif 1和motif 3）结构域，有9个基因含有K-box（motif 2和motif 4）结构域，此外motif 1是蒙古冰草这12个MADS-box家族基因所共有的，推测motif 1为蒙古冰草MADS-box家族中保守基序（图4）。

2.4　蒙古冰草MADS-box家族的磷酸化位点分析

由图5可知，蒙古冰草12个MADS-box家族基因的磷酸化位点主要集中在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（The）和酪氨酸（Tyr）3类氨基酸残基上。蒙古冰草MADS-box家族中磷酸化位点广泛分布在整条多肽链上，磷酸化位点总数最多的是AmMADS18基因，有33个；最少的是AmAGL62，仅含有7个，其中丝氨酸磷酸化位点数最多，排名前三的是AmMADS18（24个）、AmMADS47（22个）和AmMADS15（21个），而AmMADS18和AmAGL62中不包含酪氨酸磷酸化位点，这些磷酸化位点主要与PKC、PKA、MAPK、CKⅠ、CKⅡ和cdc2激酶有关。

2.5　蒙古冰草MADS-box家族二、三级结构预测

由图6可知，12个蒙古冰草MADS-box家族基因的二级结构主要是由24.42%（AmAGL62）~62.15%（AmMADS29‑1）α-螺旋、28.50%（AmMADS29‑1）~51.16%（AmAGL62）无规则卷曲和6.96%（AmMADS15）~27.69%（AmAGL62）延伸所构成（表3），α-螺旋和无规则卷曲为该蛋白二级结构的主要组成元件，它们间隔排列，构成稳定的二级结构，进一步盘绕折叠形成三级结构。蛋白质三级结构与二级结构相吻合，都能够不同程度地匹配到MADS-box家族（图7）。

2.6　蒙古冰草MADS-box家族进化树构建

由图8可知，29个MADS-box蛋白被分为6个亚族，同一亚族内同源关系较近，其中第Ⅰ和第Ⅱ亚族中并没有包含蒙古冰草MADS-box家族基因。蒙古冰草AmMADS29‑1单独存在于第Ⅲ亚族中；AmMADS29‑2和OsMADS27同处于第Ⅳ亚族，同源关系较近；AmMADS15、AmMADS18、AmMADS1、AmMADS26‑1和AmMADS26‑2同处于第Ⅴ亚族，其中AmMADS26‑1、AmMADS26‑2与水稻OsMADS26的同源关系较近；AmMADS55、AmMADS47、AmAGL62、AmMADS51和AmMADS56同处于第Ⅵ亚族，其中AmMADS47、AmMADS55与水稻OsMADS22、OsMADS47的同源关系较近，推测蒙古冰草AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS55与响应干旱胁迫有关。

2.7　抗旱相关蒙古冰草MADS-box的qRT-PCR分析

由图9可知，5个基因在干旱胁迫处理下的表达量相较于干旱处理0 d时（CK）的表达量均存在显著差异（P<0.05），且qRT-PCR结果与RNA-seq结果基本一致。干旱处理1.0 d后，AmMADS26‑1、AmMADS29‑2和AmMADS47的表达丰度相较于干旱处理0 d时分别升高2.87、3.55和1.05倍，其中，AmMADS26‐1和AmMADS47的表达模式在模拟干旱处理第1—7天呈持续下降趋势，而AmMADS29‐2基因的表达模式在处理第1—5天持续下降，在7.0 d后有所升高；AmMADS26‑2在干旱处理1.0和7.0 d的表达水平显著高于干旱处理0 d（CK）的表达水平（P<0.05），表达丰度分别是CK的1.54和1.50倍；AmMADS26‑1、AmMADS26‑2和AmMADS29‑2复水后的表达水平相对于胁迫7.0 d略有增加，相较于CK的表达水平也有显著提升；AmMADS55在干旱1.0 d的表达水平显著低于CK（P<0.05），随干旱处理时间的延长，其表达水平逐渐升高，复水后表达水平降低，但仍高于CK。综上，模拟干旱条件均可诱导AmMADSs的表达，且不同AmMADS基因的表达模式不相同。

3　讨 论

MADS-box家族在植物生长发育的各个方面都起到了关键的作用^［40］，大量研究表明MADS-box家族基因在水稻^［41-42］、拟南芥^［43］、小麦^［44］、大豆^［45］的非生物逆境胁迫响应中起到调控作用。本研究基于蒙古冰草转录组测序Unigenes数据中筛选并获得12条与抗旱相关且具有完整保守结构域的MADS-box序列。理化性质分析表明，蒙古冰草12个MADS-box家族蛋白均定位于细胞核，无跨膜结构，这与紫玉兰（Yulania liliiflora）^［46］、广寄生（Taxillus chinensis）^［47］、沙棘（Hippophaer hamnoidesLinn）^［48］和蓖麻（Ricinus communis L.）^［49］中MADS-box蛋白的亚细胞定位结果一致。保守结构域承载着基因的重要遗传信息，对发挥特定调控功能具有重要意义。对蒙古冰草MADS-box家族基因进行保守基序分析发现，该家族基因具有高度保守的MADS结构域和中度保守的K-box结构域，与其他植物编码的保守结构域相同^［23-25］。MADS-domain的N端的一半是DNA结合特异性的主要决定因素，而C端的一半是二聚化所必需的，这种组织通过不同MADS-box蛋白之间的异二聚化，在数量有限的基因中形成许多不同DNA结合特异性的蛋白质^［50］，该结构域在靶基因的调节中起关键作用。磷酸化位点预测表明这12个蒙古冰草MADS-box家族基因均含有丝氨酸和苏氨酸，部分含有酪氨酸，这些磷酸化位点广泛分布于整条多肽链上，这与董晓蕊等^［47］的研究结果类似。今后，应结合保守结构域及磷酸化位点的功能进行进一步验证，从而深入理解其在基因表达调控中的作用机制。

MADS-box转录因子在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着不同的作用。玉米^［51］、龙胆草^［52］和猕猴桃^［53］等基因启动子区域中含有大量逆境胁迫响应相关的顺式作用元件，包括MBS、ARE、WUN-motif和TC-rich repeats等，这些元件在植物遭受非生物逆境胁迫的过程中发挥着一定的作用。Chen等^［54］研究发现黄瓜CsAGL16基因通过调控ABA代谢通路上的CsCYP707A4基因的表达，进而影响ABA分解代谢，使气孔关闭，从而增强植株对干旱的耐受性。水稻OsMADS26基因表达下调使植株叶片的相对含水量（RWC）升高，叶绿素含量降低趋势变缓，从而表现出更强的抗旱能力^［31］。本研究中，将蒙古冰草12个MADS-box家族基因与已知具有抗旱功能的11个水稻和6个拟南芥家族基因构建系统进化树，发现29个MADS-box蛋白被分为6个亚族，水稻OsMADS22、OsMADS26、OsMADS27和OsMADS47与蒙古冰草MADS-box基因具有较高的同源性，推测蒙古冰草AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS55可能响应干旱胁迫，且这5个蒙古冰草MADS-box蛋白质的二、三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，这与付学森等^［55］ 在对灰毡毛忍冬中的研究结果一致。

刘泓畅等^［51］通过qRT-PCR分析结果表明，干旱胁迫下玉米MADS-box家族中的Zm00001eb411130基因的相对表达量相较于未受胁迫的对照上调2.43倍，Zm00001eb2794400基因的相对表达量上调2.47倍。Arora等^［32］发现，在干旱胁迫下，水稻OsMADS2、OsMADS30和OsMADS55基因的表达水平较未干旱处理前下调2倍以上。本研究qRT-PCR分析结果显示，5个MADS-box家族基因在模拟干旱处理后的不同时间的表达水平存在显著差异（P<0.05），AmMADS26‑1、AmMADS29‑2和AmMADS47的表达模式均呈现先上调后下调趋势，且在干旱处理1.0 d后的表达量达到峰值，显著高于干旱0 d（CK）的表达量，其中AmMADS26‑1在干旱处理1.0 d后的表达量相较于CK升高2.87倍，与Aroro等^［32］的研究结论一致。今后应就AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS55调控蒙古冰草对干旱胁迫的应答方面继续深入研究，明确其调控机制。

4　结 论

对蒙古冰草12个具有完整保守MADS-box结构域家族基因的理化性质、保守基序、同源性及蛋白质结构进行分析发现，其蛋白质二、三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，同时与已知具有抗旱功能的水稻（Oryza sativa L.）MADS-box同源关系较近。在25%（0.041 7 mol/L）PEG 6 000模拟干旱处理后，AmMADS26‑1、AmMADS26‑2、AmMADS29‑2、AmMADS47和AmMADS55表达水平显著变化，推测为蒙古冰草响应干旱胁迫的关键基因。

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基金资助

国家自然科学基金(32360338)