用于非洲马瘟病毒核酸检测的假病毒阳性对照品的制备

摘要

为制备含非洲马瘟病毒（African horse sickness virus,AHSV）VP7基因的假病毒，并作为AHSV核酸检测的阳性对照品，本研究合成了含AHSV VP7基因片段的核苷酸序列，将该基因片段插入慢病毒穿梭载体pSIN4-GFP中，将重组慢病毒穿梭质粒pSIN4-VP7和慢病毒骨架质粒pMD 2G、pSPA-X2共转染293T细胞，包装AHSV假病毒颗粒，并通过RT-PCR、荧光RT-PCR、逆转录酶检测及电镜验证AHSV假病毒包装。在AHSV假病毒颗粒中加入冻干保护剂制备成阳性对照品，对该冻干阳性对照品进行物理性状检验、无菌检验、均一性评估和稳定性评估。结果显示：1）经菌液PCR及测序验证，成功构建含AHSV VP7基因的慢病毒穿梭质粒。重组慢病毒质粒与慢病毒骨架质粒共转染293T细胞48 h后，提取细胞上清中RNA，经RT-PCR和荧光RT-PCR鉴定，RT-PCR结果显示，能扩增出大小约1 187 bp的特异性条带，且测序结果显示特异性条带与插入片段一致。荧光RT-PCR结果显示，有特异性扩增曲线。2）逆转录酶检测结果显示AHSV假病毒颗粒中逆转录酶浓度为2 628μg/mL，表明成功包装出AHSV假病毒颗粒，且假病毒含量较高。电镜观察显示AHSV假病毒颗粒为不规则圆形病毒样结构，直径为150～200 nm。3）均一性评估显示，阳性对照品Ct值的变异系数<10%，表明均一性良好。4）加速热稳定性试验显示，制备的阳性对照品分别经4、25和37℃放置7 d后仍能保持稳定。保存期试验表明制备的阳性对照品能在-20和-80℃环境下保存6个月。综上，本研究成功制备了含有AHSV VP7基因片段的假病毒阳性对照品，可实现对AHSV核酸提取和检测过程的全程监控。

关键词

非洲马瘟病毒(AHSV) / VP7基因 / 假病毒 / 阳性对照品