原核表达dsRNA发酵条件、提取方法优化及应用

摘要

为优化原核表达系统中双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)的发酵条件和提取方法，并探讨其在水稻纹枯病防治中的应用潜力，通过构建靶向水稻纹枯病RsDCL1/2基因的重组发夹结构表达载体，并导入大肠杆菌HT115(DE3)菌株中，通过对pH、IPTG诱导浓度、诱导温度转速、诱导时间、NaCl浓度进行调整优化，筛选出最佳发酵条件以提高dsRNA产量；并评估Trizol法、RNAswift法、75%乙醇固定法及PB缓冲裂解法4种提取方法对dsRNA的提取效率，采用最适提取方法对提取的dsRNA开展水稻纹枯病的温室防治效果验证。结果表明：1）经优化后的发酵条件为pH 7,0.4 mmol/L IPTG,33℃，160 r/min,7.5 g/L NaCl，发酵时间12 h，该发酵条件下获得的dsRNA产量比优化前增加1.32倍；2）在提取方法比较中，PB缓冲裂解法在产量和纯度方面表现最佳，产量是75%乙醇固定法的3.89倍；3）温室盆栽防效试验表明，PB缓冲裂解法提取的dsRNA喷施水稻后，显著降低病斑的面积，进一步验证了dsRNA作为生物农药在水稻纹枯病防治中的潜力。综上，基于优化发酵条件和PB缓冲裂解法2种方式构建的dsRNA生产体系，可有效提高dsRNA的产量；同时，该体系产出的dsRNA在水稻纹枯病的防治中表现出良好的应用效果。

关键词

dsRNA / 发酵条件 / dsRNA提取方法 / 水稻纹枯病