淡水鱼中5种人兽共患吸虫囊蚴多重PCR检测方法的建立

摘要

为快速鉴别淡水鱼感染吸虫囊蚴的种类，基于GenBank中华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫参考序列的保守区域分别设计5对特异性引物，通过优化反应条件，建立同时检测5种吸虫囊蚴的多重PCR方法。结果显示：1)PCR反应体系中最佳引物组合浓度为10μmol/L，最适退火温度为59℃，可同时扩增的各吸虫特异性片段，扁弯口吸虫、全冠吸虫、卷棘口吸虫、肝片吸虫和土耳其斯坦裂体吸虫的检测结果均为阴性；5种吸虫囊蚴重组质粒DNA最低检出浓度均为1 ng/μL；批间与批内试验均一致。2）通过单重PCR方法验证多重PCR检测结果，符合率为100%。3）采用多重PCR方法检测的100尾麦穗鱼中，21尾（21/100,21%）阳性，8尾（8/100,8%）为单病原感染，13尾（13/100,13%）为多病原混合感染，华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫的阳性数分别为11(11%)、9(9%)、4(4%)、8(8%)和8(8%)，与分别使用形态学方法及单重PCR验证结果相同。综上，本研究成功建立了同时检测淡水鱼华支睾吸虫、东方次睾吸虫、横川后殖吸虫、日本棘隙吸虫和圆圃棘口吸虫囊蚴的多重PCR方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，有望在鱼病检测、突发鱼源性公共卫生事件及出入境检验检疫中应用。

关键词

华支睾吸虫 / 东方次睾吸虫 / 横川后殖吸虫 / 日本棘隙吸虫 / 圆圃棘口吸虫 / 多重PCR