黄芩苷激活自噬抑制炎症促进牙髓干细胞成牙/骨分化

摘要

目的：通过验证黄芩苷（baicalin,BA）在炎症环境下的抗炎效果并探究其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell,hDPSC）成牙/骨分化的影响，为牙髓炎的活髓保存治疗提供参考。方法：选取人早期炎症牙髓组织制作冰冻切片并进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，免疫组化染色检测白细胞介素（interleukin,IL）-1β表达，免疫荧光染色检测IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的表达。将人单核细胞白血病细胞系THP-1分化的巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的诱导下极化为M1亚群，再用50μmol/L的BA处理后，利用免疫荧光、实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western blot分析iNOS、IL-1β及IL-8的表达变化，利用Western blot检测LC3B、Beclin-1及P62的表达变化以观察巨噬细胞自噬，并在使用自噬抑制剂3-MA阻断自噬后检测IL-1β及IL-8的表达变化。随后，提取不同条件处理的巨噬细胞上清液制备条件培养液作用于hDPSC并进行矿化诱导，采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红（alizarin red S,ARS）染色、RT-PCR及Western blot分析ALP、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）及Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen,COL-1）的表达，以观察炎症环境下BA对hDPSC成牙/成骨分化能力的影响。结果：早期牙髓炎组织炎症区周围IL-1β和iNOS的表达明显升高。LPS和IFN-γ诱导后，巨噬细胞由M0向M1极化，iNOS、IL-1β及IL-8表达明显增加。当加入50μmol/L BA共同孵育24 h后，巨噬细胞极化程度明显降低，IL-1β、IL-8的mRNA水平明显下降；同时，与M1组相比，加入BA后LC3B-Ⅱ、Beclin-1表达升高，P62表达被抑制；3-MA阻断自噬后，IL-1β及IL-8的m RNA水平显著升高。M1巨噬细胞的上清液作用于hDPSC并进行矿化诱导7～21 d后，hDPSC的ALP活性降低，钙盐沉积减少，ALP、DSPP、RUNX2、OPN及COL-1的表达减少。BA处理后的M1巨噬细胞上清液加入hDPSC后，ALP活性显著升高，钙盐沉积明显增多，ALP、DSPP、RUNX2、OPN及COL-1的表达明显增加。结论：在炎症微环境下，BA可能是通过激活细胞自噬抑制牙髓炎症反应，促进hDPSC的成牙/骨分化能力。

关键词

黄芩苷 / M1巨噬细胞 / THP-1 / 成牙/骨分化 / 牙髓干细胞

基金资助

国家自然科学基金（82270955）; 南京市卫生科技发展专项资金（YKK24293）