微孔板成像系统在高表达荧光蛋白单克隆细胞株筛选中的应用

摘要

目的：建立一种基于微孔板成像系统筛选稳定转染后高表达荧光蛋白的单克隆细胞株的筛选流程。方法：利用慢病毒将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因转至人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cell,HBE），通过流式细胞术分选荧光信号强的单个细胞入96孔板。按照所建立的筛选流程，通过4轮基于微孔板成像系统的成像与分析功能进行逐步筛选：分选当天确认含单细胞的孔；待大多数克隆团细胞数>20个时，筛选出可形成克隆团的孔；将筛选孔中的细胞消化并转移至新孔后，进一步筛选出细胞平均荧光强度较高的孔；待生长最快的细胞增殖4～8倍时，筛选出细胞正常增殖的孔。稳定转染细胞持续培养，培养条件同单克隆细胞。待单克隆细胞增殖至数量足够，利用流式细胞术与荧光成像比较最终筛选所得单克隆细胞株与稳定转染细胞在荧光强度方面的差异。结果：依照筛选流程，依次筛选得到89个含单细胞的孔，19个可形成克隆团的孔，6个细胞平均荧光强度较高的孔，以及3个细胞正常增殖的孔。流式细胞术结果显示：与稳定转染细胞相比，来源于这3个孔的单克隆细胞株的平均荧光强度提高了近9倍，GFP荧光信号强的细胞占比也显著提高。微孔板成像结果亦显示单克隆细胞株的GFP荧光强度明显高于稳定转染细胞。结论：应用微孔板成像系统，结合本研究所建立的筛选流程，可逐步、高效地筛选出稳定转染后高表达荧光蛋白的单克隆细胞株。相比传统的显微镜观察或其他成像方法，该方法操作简单、方便，具备良好的推广应用价值。

关键词

单克隆细胞株 / 荧光蛋白 / 微孔板成像系统 / 筛选

基金资助

国家科技重大专项（2023ZD0507401）; 江苏省大型科学仪器开放共享自主研究课题（TC2023A024）