利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09亚型流感病毒

摘要

目的：利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09病毒，评价其在MDCK细胞和鸡胚内的生长特性以及对BALB/c小鼠的致病性。方法：RT-PCR技术扩增A/Puerto Rico/8/1934（简称PR8）病毒基因片段，并克隆至pHW2000双向表达载体上。全球共享流感数据倡议组织（global initiative of sharing all influenza data,GISAID）数据库中下载A/Wisconsin/588/2019（H1N1）的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）序列，将其HA非编码区替换为A/California/07/2009（H1N1）的HA非编码区。全基因合成A/Wisconsin/588/2019的HA和NA片段，分别克隆至pHW2000双向表达载体上。将PR8病毒6个内部基因重组质粒与A/Wisconsin/588/2019的HA和NA重组质粒共转染293T细胞与MDCK细胞，拯救重组病毒。对重组病毒进行血凝效价测定和RT-PCR鉴定以判断是否拯救成功。将重组病毒接种MDCK细胞和9～10日龄鸡胚，评价其生长特性并绘制生长曲线。将重组病毒以滴鼻方式感染BALB/c小鼠，记录小鼠体重变化和生存率以评价其致病性。结果：成功拯救出重组A/Wisconsin/588/2019病毒，血凝效价为1∶8，测序鉴定其HA和NA序列与预期一致，重组病毒接种MDCK细胞后72 h，大部分细胞完全脱落，病毒滴度为10^5.38TCID₅₀/mL，复制高峰期为接种后60 h，接种鸡胚后的血凝效价最高可达1∶2～8。重组病毒（病毒稀释比为1∶1）滴鼻BALB/c小鼠后第8天，小鼠全部死亡，对小鼠的半数致死剂量为10^-1.38/50μL。结论：成功拯救一株重组H1N1pdm09病毒，该病毒在MDCK细胞上生长良好且具有良好的鸡胚适应性，对小鼠具有致病性和致死性，为反向遗传学技术快速拯救流感病毒提供新思路。

关键词

季节性流感 / H1N1 / 反向遗传学技术

基金资助

江苏省“双创人才”项目（JSSCRC2023555）; 江苏省重点研发计划（BE2021756）