活化α7乙酰胆碱受体促进LPS刺激的人牙髓干细胞牙/骨向分化

摘要

目的：探讨活化α7乙酰胆碱受体（alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR）联合钙离子(calcium ion,Ca²⁺对LPS刺激的人牙髓干细胞（dental pulp stem cell,DPSC）牙/骨向分化的影响。方法：分离培养DPSC，流式细胞术对DPSC进行表面标志物表达鉴定。CCK-8检测α7-nAChR激动剂PNU-282987和Ca²⁺对DPSC增殖的影响。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性和染色筛选PNU-282987促进DPSC表达ALP活性的最佳浓度。用大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）模拟炎性微环境刺激DPSC。采用免疫印迹分析（Western blot,WB）、实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）和茜素红染色等方法检测牙/骨向分化的相关蛋白：Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen,COL-I）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialoprotein,DSPP）、骨钙素（osteopontin,OPN）、ALP、核心转录因子-2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）、成骨细胞特异性转录因子（osterix,OSX），相关基因（COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）和矿化基质表达情况。Fura-2AM用于检测细胞内Ca²⁺流动情况。结果：CCK-8实验显示，PNU-282987浓度低于10μmol/L时对细胞增殖无抑制作用，且此浓度处理LPS刺激的DPSC后ALP活性增加最明显；Ca²⁺浓度低于2 mmol/L对细胞增殖无抑制作用；Western blot和RT-qPCR实验显示，PNU-282987及Ca²⁺处理后的LPS刺激的DPSC牙/骨向分化相关蛋白（COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）和相关基因（COL-I、DSPP、OPN、ALP、RUNX2、OSX）的表达及矿化基质形成均明显上调，二者联合后上调最显著（P <0.001）。Fura-2 AM钙离子探针结果显示DPSC细胞内Ca²⁺浓度增加。结论：10μmol/L PNU-282987联合2 mmol/L Ca²⁺可以促进LPS刺激的DPSC的牙/骨向分化能力。

关键词

α7乙酰胆碱受体 / 牙/骨向分化 / 人牙髓干细胞 / 钙离子 / 脂多糖