结核分枝杆菌Rv2647蛋白对肺组织损伤效应的初步研究

摘要

目的：通过噬菌体重组技术分别构建结核分枝杆菌Rv2647基因的敲除株和回补株以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms），评估结核分枝杆菌Rv2647蛋白对模型鼠肺组织的损伤效应。方法：构建同源交换位点并整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组，获取噬菌粒并将其导入Ms，构建具有同源交换位点的重组噬菌体。体外扩增获得高滴度重组噬菌体并转染结核分枝杆菌（H37Rv）,37℃静置培养28 d，挑取单克隆进行PCR验证，获得Rv2647基因敲除株（H37RvΔRv2647）。PCR扩增Rv2647基因并通过无缝克隆分别将其整合到载体pMV361和pMV261多克隆位点处，获得阳性质粒后分别电转化H37RvΔRv2647和Ms，获得结核分枝杆菌回补株（H37RvΔRv2647::Rv2647）及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Ms::Rv2647）。分别以H37Rv、H37RvΔRv2647、H37RvΔRv2647::Rv2647、Ms及Ms::Rv2647的菌液经气管攻击C57BL/6小鼠，分别比较H37Rv(30 d)与Ms(7 d)模型鼠的存活率、肺组织细菌负荷及肺组织病理损伤程度。结果：PCR结果显示，H37RvΔRv2647中Rv2647基因缺失，而H37RvΔRv2647::Rv2647及Ms::Rv2647中Rv2647基因皆存在。H37RvΔRv2647、H37Rv及H37RvΔRv2647::Rv2647组模型鼠30 d存活率分别为100.00%、83.33%及83.33%;Ms和Ms::Rv2647组模型鼠的7 d存活率分别为100.00%和83.33%;H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织细菌负荷（lgCFU）为（3.40±0.18），显著低于H37Rv组（3.86±0.15,P <0.001）和H37RvΔRv2647::Rv2647组（3.80±0.16,P <0.01）;H37RvΔRv2647组模型鼠肺组织炎症面积（%）为（4.37±3.06），显著低于H37Rv组（62.76±14.24,P <0.001）和H37RvΔRv2647::Rv2647组（67.37±0.45,P <0.001）;Ms组模型鼠肺组织lgCFU为（2.53±0.16），显著低于Ms::Rv2647组（2.81±0.13,P <0.01）;Ms组模型鼠肺组织炎症面积（%）为（5.71±1.29），显著低于Ms::Rv2647组（33.13±13.84,P <0.05）。结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2647基因敲除株（H37RvΔRv2647）及回补株（H37RvΔRv2647::Rv2647）以及过表达Rv2647的耻垢分枝杆菌（Ms::Rv2647）。Rv2647蛋白可能通过抑制宿主对结核分枝杆菌的清除，加重了模型鼠肺组织病理损伤。

关键词

结核分枝杆菌 / 差异区域 / Rv2647蛋白 / 噬菌体重组技术 / 肺组织损伤