外泌体调节复发性流产小鼠子宫内膜细胞上皮间充质转化的作用机制研究

摘要

背景 复发性流产（RSA）是常见的生殖障碍性疾病，在胚胎植入过程中，子宫内膜发生上皮间充质转化（EMT）,RSA的发生与该过程减弱密切相关。子宫内膜来源外泌体及其携带的miRNA参与细胞间通讯，影响细胞EMT，与RSA关系密切，但具体作用机制尚不明确。目的 本研究聚焦于外泌体在细胞EMT中的功能，通过实验验证子宫内膜来源外泌体及其分泌的miRNA-221对RSA小鼠子宫内膜细胞EMT的调控作用。方法 2021年10月—2022年5月，选取SPF级、健康8周龄雌性小鼠24只，随机选取12只作为正常对照组，剩余12只小鼠制作RSA模型，造模结束后雌雄合笼，妊娠第4日处死雌性小鼠，分离和培养子宫内膜上皮细胞并收集外泌体，通过透射电镜和免疫印迹法（WB）进行外泌体鉴定；通过CCK-8、Transwell和流式细胞术检测外泌体干预前后两组细胞增殖、侵袭、迁移能力；细胞EMT相关蛋白[E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、基质金属蛋白酶7（MMP-7）、MMP-9]及外泌体标志蛋白(CD₆₃、CD₈₁、TSG101)的表达；外泌体处理后的细胞EMT标志蛋白(CD₂₄^-APC、CD₄₄^-FITC)的表达；转染miRNA-221模拟物和抑制物分析外泌体源性miRNA-221对小鼠子宫内膜上皮细胞EMT的作用，并通过WB和双荧光素酶报告基因检测进行分析。结果 RSA组小鼠的子宫内膜上皮细胞具有异常的EMT，小鼠子宫内膜上皮细胞能够分泌外泌体。添加外泌体的RSA组细胞增殖率、迁移能力、侵袭能力、CD₄₄⁺/CD₂₄⁺表达水平高于细胞上清液RSA组（P<0.05）。与细胞上清液RSA组相比，添加外泌体的RSA组细胞的EMT标志蛋白E-cadherin水平降低，间质样标志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基质标志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高（P<0.05）。RSA组miRNA-221表达水平低于正常对照组（P<0.05）。与对照随机miRNA相比，miRNA-221模拟物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路（P<0.05）。与对照随机miRNA相比，miRNA-221模拟物降低了PTEN mRNA的表达水平（P<0.05），而mi RNA-221抑制剂转染则增加了PTEN mRNA的表达水平（P<0.05）。结论 子宫内膜来源外泌体miRNA-221可通过负向调控Pten基因，激活PI3K-AKT通路，促进子宫内膜上皮细胞EMT，影响RSA妊娠结局。

关键词

复发性流产 / 上皮间充质转化 / 外泌体 / miRNA-221 / Pten基因 / PI3K-AKT通路

基金资助

国家自然科学基金面上资助项目（82074477）; 北京市自然科学基金面上资助项目（7222268）