酸性预适应激活钠-氢交换体1调控细胞内pH稳态减轻肾缺血再灌注损伤的研究

摘要

背景适宜的细胞内pH(pHi)是细胞发挥功能的基础。酸性预处理有利于诱导细胞内液酸适应，增强细胞应对损伤性应激的能力，被称为酸性预适应(AP)。钠-氢交换体1(NHE1)在肾小管上皮细胞广泛表达，也是细胞排H+的主要通道之一。然而，NHE1在肾脏AP中的作用及其机制尚不明确。目的 本研究首先在人肾小管上皮细胞系(HK2)中建立可有效减轻缺氧/复氧(H/R)损伤的AP模型，围绕NHE1阐明AP调控pHi稳态的作用机制，并在小鼠缺血预适应(IPC)模型中加以验证。方法 实验于2023年6—12月在复旦大学附属中山医院肾内科实验室完成。在体外实验，采用缺氧24 h后复氧1 h建立HK2细胞的H/R模型。应用pH 6.6酸性培养基处理细胞，构建AP模型。根据不同实施方案分为3部分，(1)AP模型的建立：将AP过程分为pH 6.6酸性培养基处理阶段(A)和pH 7.4正常培养基恢复阶段(R),HK2细胞先后经过不同时间的A和R处理后再进行H/R，探索最佳AP模型及其对NHE1和pHi的调控作用；(2)使用NHE1的小干扰RNA(siNHE1)敲低NHE1，观察AP保护效应的改变；(3)应用低氯离子培养基抑制pHi的波动，观察AP对NHE1调控作用和保护效应的改变。在体内实验，选取24只SPF级雄性野生型C57BL/6小鼠，分为假手术组(Sham组)、肾缺血再灌注组(I/R组)、肾缺血预适应组(IPC组)、肾缺血预适应+肾缺血再灌注组(IPC+I/R组)，每组各6只。I/R模型采用夹闭双侧肾动静脉35 min后复灌流24 h。IPC模型采用夹闭双侧肾动静脉15 min后复灌流4 d。IPC+I/R组则是在IPC后进行I/R处理。使用CellTiter-LumiⅡ发光法检测细胞活力。使用Western Blotting法检测NHE1、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved caspase)3、肾脏损伤分子1(KIM1)和cleaved caspase 9表达水平；使用流式细胞仪和Tunel染色评估细胞凋亡水平；采用BCECFAM探针和NH4Cl冲击法检测p Hi和NHE1活力；采用细胞外液p H值(pHe)-pHi曲线评估pHi稳态维持能力；使用免疫荧光染色检测NHE1在HK2细胞和肾脏组织中的定位。结果 酸性处理12 h，正常培养基恢复6 h可显著降低H/R处理后cleaved caspase 3和cleaved caspase 9表达水平，减少Annexin V和Tunel阳性细胞比例(P<0.05)。AP缓解H/R处理后的细胞内酸化(P<0.05)，上调NHE1表达和活性，并上移pHe-pHi曲线；敲减NHE1表达下移AP后的pHe-pHi曲线。敲减NHE1减弱AP对H/R损伤的保护作用，表现为cleaved caspase 3和cleaved caspase 9表达水平升高(P<0.05)。低氯培养消除了AP早期pHi的波动，同时抑制了AP后NHE1表达上调和p He-pHi曲线上移。IPC缓解I/R后的pHi降低(P<0.05)并上移pHe-pHi曲线。IPC显著降低了I/R后KIM1和cleaved caspase 3表达水平，上调I/R后NHE1表达水平(P<0.05)。免疫荧光显示I/R后NHE1在近端肾小管上皮细胞表达增多。结论 本研究在肾脏细胞H/R模型中证实AP的保护作用。AP通过诱导pHi的短暂波动上调NHE1表达和活性，进而诱导细胞内酸适应，最终减轻H/R损伤。

关键词

急性肾损伤 / 酸性预适应 / 缺血预适应 / 钠-氢交换体1 / 细胞内pH

基金资助

国家自然科学基金资助项目（82070710）; 2021年度上海市科技创新行动计划-生物医药科技支撑专项（中医专项）（21S21902900）