矢志方在高尿酸血症尿酸转运相关蛋白中的作用机制研究

摘要

背景 传统中医药是治疗高尿酸血症的重要方法，矢志方在治疗高尿酸血症所致的肾脏损伤方面疗效显著，但目前尚缺乏矢志方在尿酸相关转运蛋白中的作用及机制的相关研究。目的 将计算机技术与分子生物学实验相结合，探究矢志方对高尿酸血症尿酸相关转运蛋白的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路在其中的作用机制。方法 于2023年5—11月开展体内外实验，将课题组前期运用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法（UPLC-Q-TOF-MS）分析得到的矢志方药物活性成分进行筛选后，和尿酸转运相关蛋白[尿酸转运蛋白1(URAT1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、有机阴离子转运体1(OAT1)、有机阴离子转运体3(OAT3)]进行分子对接探讨其与尿酸各转运蛋白的关系。体外培养人肾小管上皮（HK-2）细胞，依次分为正常组、模型组、抑制剂组、矢志方组、抑制剂+模型组，造模给药后，采用Western blotting、免疫荧光技术检测尿酸转运相关蛋白及ERK1/2信号通路的表达情况。将25只SD大鼠随机分为正常组、模型组、矢志方组、非布司他组和抑制剂组，每组5只进行体内实验。除正常组予0.9%氯化钠溶液灌胃外，其余各组采用氧嗪酸钾（1 500 mg/kg）和腺嘌呤（50 mg/kg）联合灌胃制备高尿酸血症大鼠模型，同时矢志方组、非布司他组、抑制剂组分别予矢志方（6.75 g/kg）、非布司他（3.6mg/kg）和抑制剂U0126(30 mg/kg)连续灌胃4周。采用HE染色观察肾组织病理变化，六胺银染色观察尿酸盐结晶形成情况，Western blotting、免疫组化检测尿酸转运相关蛋白表达情况。结果 共筛选出10个活性成分，分子对接小提琴图显示，相较于URAT1,OAT1、OAT3能够与矢志方更多活性成分形成稳定对接，ABCG2对接能量较低，但热图表明URAT1与矢志方活性成分对接的结合能相较于其他更高，结合最稳定。体外实验表明，与正常组比较，模型组URAT1蛋白表达升高，OAT1、OAT3蛋白表达降低（P<0.01）；正常组与模型组的ABCG2蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，抑制剂组、矢志方组、抑制剂+模型组URAT1蛋白表达均降低，OAT1、OAT3蛋白表达均升高（P<0.01）；模型组与抑制剂组、矢志方组、抑制剂+模型组的ABCG2蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。六胺银染色可见模型组尿酸盐结晶形成，而抑制剂组、矢志方组、抑制剂+模型组尿酸盐结晶明显减少。病理染色可见模型组出现肾脏损伤，抑制剂组、矢志方组、抑制剂+模型组损伤减轻。体外实验表明，与正常组比较，模型组URAT1蛋白表达升高，OAT1、OAT3、ABCG2蛋白表达降低（P<0.01）；与模型组相比，矢志方组、非布司他组和抑制剂组URAT1蛋白表达降低，OAT1、OAT3蛋白表达升高（P<0.01）；模型组与矢志方组、非布司他组和抑制剂组ABCG2蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 矢志方能够显著降低高尿酸血症URAT1表达，并升高OAT1、OAT3表达来发挥治疗作用，该作用与ERK1/2信号通路密切相关，矢志方活性成分Deoxyadenosine、P-Hydroxybenzaldehyde、Sinapic acid可能在其中发挥主要作用。

关键词

高尿酸血症 / 矢志方 / 尿酸转运蛋白 / ERK1/2信号通路 / 计算机技术