考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的优化

摘要

针对传统考马斯亮蓝法在痕量蛋白质检测中灵敏度不足、稳定性差的问题，根据其反应原理对各个环节进行优化。首先，用酶标仪和96孔板替代传统的紫外分光光度计和比色皿，以提高检测通量与精度；其次，用20 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer, PB）替代水作为稀释液，以增强蛋白质溶出度；最后，将考马斯亮蓝G-250溶液优化为最佳配方——5 mg考马斯亮蓝G-250溶于含5%（体积分数，下同）的95%乙醇和13%的85%磷酸的水溶液中。结果表明：最佳反应体系为等体积牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）与考马斯亮蓝G-250溶液反应，最优反应条件为避光反应10 min;蛋白质浓度在0～21 mg/L范围内线性关系良好（线性相关系数R²>0.99）,检测限低至1μg/mL,准确度（80%～115%）和精密度（RSD<4%）均在药典参考值限度内。本文成功实现了痕量蛋白质的精准定量分析，且具有低成本、快速、高通量的特点，为蛋白质相关研究提供了更为精准、高效的技术支持。

关键词

应用生物化学 / 蛋白质含量测定方法 / 考马斯亮蓝 / 稳定性 / 检测限

基金资助

国家药典委员会国家药品标准提高项目(2021Y04); 河北省外专百人计划项目(2200626); 河北省农业科技成果转化资金项目(202460101010040)